黑果腺肋花楸花青素的分離純化

張卉，尤小明，劉姝含，臧淑艷

1.沈陽化工大學(xué)制藥與生物工程學(xué)院（沈陽 110020）；2.湖北黃岡市中心醫(yī)院（黃岡 438000）；3.沈陽化工大學(xué)理學(xué)院（沈陽 110020）

黑果腺肋花楸（Aronia prunifolia‘Viking’）屬薔薇科多年生落葉灌木，其果實(shí)中富含花青素。花青素不僅是一種天然可食用色素，而且具有抗腫瘤、抗氧化、預(yù)防糖尿病及高血壓的作用[1-3]。由于花青素是從植物中提取，導(dǎo)致純度低、雜質(zhì)多，從而降低花青素的穩(wěn)定性，影響其在原料藥及功能性食品的開發(fā)應(yīng)用[4]。因此，深入研究花青素的純化工藝，對(duì)于花青素的進(jìn)一步研發(fā)具有深遠(yuǎn)意義。

近年來大孔吸附樹脂因具有吸附選擇性好、富集效果強(qiáng)、可重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，常被應(yīng)用于花青素分離純化研究[5]。王宏等[6]選用AB-8大孔樹脂來純化黑枸杞花青素，有效提高花青素純度。王維茜等[7]將刺葡萄皮中粗提液依次經(jīng)大孔樹脂HP-20、聚酰胺樹脂、葡聚糖凝膠Sephadex LH-20吸附純化，最終得到3種花色苷單體。張賽男等[8]使用HPD-100大孔樹脂純化玫瑰茄花色苷，將花青素的色價(jià)提高至38.5。國石磊等[9]采用大孔樹脂純化黑果腺肋花楸花青素，研究樹脂與花青素的吸附-解吸條件。尚未見到國內(nèi)外學(xué)者對(duì)于大孔樹脂純化黑果腺肋花楸花青素的吸附性能做深入探討。因此，對(duì)純化黑果腺肋花楸花青素大孔樹脂的吸附型號(hào)、吸附條件及動(dòng)力學(xué)深入研究，可為黑果腺肋花楸花青素的開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑果腺肋花楸（冷凍貯藏，遼寧華益農(nóng)業(yè)有限公司）。

矢車菊素-3-O-半乳糖糖苷等標(biāo)準(zhǔn)品（上海哈靈生物技術(shù)有限公司）；HPD-450、X-5、AB-8、HPD-100型大孔吸附樹脂（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（天津市博迪化工股份有限公司）；鹽酸、乙酸鈉、氯化鉀、氫氧化鈉、檸檬酸（分析純，天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；甲醇、乙酸、乙腈（色譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；T-5型紫外分光光度計(jì)（北京普吸通用儀器有限公司）；BT-100-1L型蠕動(dòng)泵（Longerpump公司）；LYO GT2-2型真空冷凍干燥機(jī)（SPK公司）；HZP-150型全溫振蕩培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Agilent1200液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；高效液相-質(zhì)譜儀，由Agilent1290液相色譜。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑果腺肋花楸花青素提取液的制備

參考孫陽昭等[10]所用方法，提取溶劑改為酸化甲醇溶液（V甲醇∶V水∶V鹽酸=80∶19∶1）。

1.3.2 花青素含量測定

以矢車菊素-3-O-半乳糖苷為標(biāo)準(zhǔn)品，pH示差法[11]測定樣品中花青素含量。

1.3.3 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂HPD-450、X-5、AB-8和HPD-100的處理方法參照文獻(xiàn)[12-13]。

取經(jīng)預(yù)處理的4種大孔吸附樹脂各2.0 g，置于4個(gè)150 mL具塞錐形瓶中，每瓶加入50 mL花青素粗提液，在30 ℃、110 r/min條件下振蕩24 h，過濾，測定濾液的花青素吸光度，按1.3.2方法計(jì)算濾液中的花青素，并按式（1）計(jì)算樹脂的吸附率。將上述吸附飽和的4種樹脂，分別加入50 mL pH 3.0、體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液，同上述方法，按式（2）計(jì)算樹脂解吸率。

式中：A為吸附率，%；C0為起始溶液花青素質(zhì)量濃度，mg/g；Ce為吸附平衡溶液質(zhì)量濃度，mg/g；D為解吸率，%；V1為吸附溶液體積，mL；V2為解吸溶液體積，mL；C1為解吸液花青素質(zhì)量濃度，mg/g。

1.3.4 大孔樹脂對(duì)花青素的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)研究

稱取2.0 g經(jīng)預(yù)處理的HPD-100大孔吸附樹脂，置于150 mL具塞錐形瓶中，加入50 mL花青素粗提液，在30 ℃、110 r/min條件下吸附一定時(shí)間：吸附0~15 min期間，每隔5 min測定樣液吸光度；吸附15~105 min期間，每隔15 min測定吸光度；吸附105~195 min期間，每隔30 min測定吸光度；吸附195~325 min期間，每隔60 min測定吸光度，計(jì)算樣液的花青素含量，按式（3）計(jì)算樹脂的吸附量。分別采用準(zhǔn)一級(jí)方程、準(zhǔn)二級(jí)方程2個(gè)動(dòng)力學(xué)模型[14]及顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型[15]描述該樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素的吸附情況和擴(kuò)散機(jī)理。

式中：W為大孔樹脂吸附量，g；V1為吸附溶液體積，mL；C0為起始溶液花青素質(zhì)量濃度，mg/g；Ce為吸附平衡溶液質(zhì)量濃度，mg/g；Q1為花青素吸附量，mg/g。

1.3.5 大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸花青素試驗(yàn)

（1）溫度對(duì)花青素吸附-解吸的影響

將50 mL pH 3.0的花青素溶液加入到預(yù)處理好的2.0 g大孔樹脂中，分別在20，30，40，50和60 ℃，轉(zhuǎn)數(shù)均為110 r/min條件下振蕩4.5 h，按式（3）計(jì)算大孔樹脂的吸附量。

（2）解吸液的體積分?jǐn)?shù)對(duì)花青素解吸的影響

分別將50 mL體積分?jǐn)?shù)30%，40%，50%，60%，70%和80%的酸性乙醇溶液，加入到吸附飽和的大孔樹脂中，在30 ℃、110 r/min條件下振蕩2.5 h，過濾，測定濾液中的花青素。

1.3.6 大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附-解吸花青素試驗(yàn)

將預(yù)處理過的12.5 g大孔樹脂濕法裝柱，以3 BV/h的速度將花青素粗提液上樣，每0.5 BV收集一次流出液并測定其吸光度，繪制泄露曲線。將已吸附飽和的大孔樹脂，用體積分?jǐn)?shù)60%、pH 3.0的乙醇溶液以500 μL/min流速進(jìn)行洗脫，每0.5 BV收集1次流出液，測定濾液中的花青素，繪制洗脫曲線。

1.4 HPLC-DAD分析

采用1200型號(hào)的液相色譜儀及二極管陣列檢測器，分析得出黑果腺肋花楸花青素單體的種類和含量，色譜操作條件參考國石磊[16]，樣品濃度2 mg/mL，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量25 μL，流速1 mL/min，檢測波長520 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

4種大孔樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素的吸附解吸附能力如表1所示。

表1 4種大孔樹脂對(duì)花青素吸附與解吸性能

由表1可知，HPD-100型的大孔樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素吸附率達(dá)到90%以上，解吸率可達(dá)95%以上，選擇其用于黑果腺肋花楸花青素的純化。

2.2 HPD-100大孔樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素的吸附動(dòng)力學(xué)研究

2.2.1 靜態(tài)吸附曲線

HPD-100大孔樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素的靜態(tài)吸附曲線如圖1所示。

圖1 HPD-100大孔樹脂對(duì)花青素的靜態(tài)吸附曲線

在吸附50 min內(nèi)，HPD-100對(duì)花青素的吸附量增長迅速；50~175 min內(nèi)吸附量增長速度逐漸降低；175 min后大孔樹脂吸附量趨于平衡，平衡吸附量為2.73 mg/g。

2.2.2 HPD-100大孔樹脂吸附花青素的動(dòng)力學(xué)模型

HPD-100大孔樹脂吸附花青素的動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)見表2。

由表2可知，HPD-100大孔樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素的吸附過程分別與準(zhǔn)一級(jí)速率方程和準(zhǔn)二級(jí)速率方程進(jìn)行擬合，發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)二級(jí)速率方程的R2（0.991 8）大于準(zhǔn)一級(jí)速率方程R2（0.939 8），說明該吸附過程屬于單一化學(xué)吸附過程。

表2 HPD-100型大孔樹脂吸附花青素動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)

2.2.3 HPD-100大孔樹脂吸附花青素顆粒擴(kuò)散模型

HPD-100大孔樹脂吸附花青素粒子擴(kuò)散模型參數(shù)見表3。

由表3可知，顆粒內(nèi)擴(kuò)散模型對(duì)整個(gè)吸附過程進(jìn)行3個(gè)階段的擬合，第1個(gè)階段、第2個(gè)階段和第3階段分別屬于薄膜擴(kuò)散、粒子內(nèi)部及平衡吸附階段。通過對(duì)比3個(gè)階段的速率常數(shù)Ki，薄膜擴(kuò)散為主要控速步驟。

表3 HPD-100型大孔樹脂吸附花青素粒子擴(kuò)散模型參數(shù)

2.3 HPD-100大孔樹脂對(duì)花青素靜態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 溫度對(duì)HPD-100大孔樹脂吸附-解吸效果的影響

由圖2可知，花青素吸附量隨著溫度升高逐漸下降，在50~60 ℃吸附量不再變化。原因在于在低溫條件下花青素比較穩(wěn)定，隨著溫度升高，花青素逐漸開始分解。

圖2 溫度對(duì)大孔樹脂吸附花青素的影響

2.3.2 解吸液體積分?jǐn)?shù)對(duì)HPD-100大孔樹脂解吸花青素的影響

由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，花青素洗脫效果最好。這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)不同，乙醇溶液極性則不同，影響花青素和大孔樹脂之間的分子作用力，從而影響解吸效果[17]。

圖3 乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂解吸能力的影響

2.4 動(dòng)態(tài)吸附-解吸試驗(yàn)

由圖4可知，隨著上樣量增大，流出液中花青素含量逐漸增加。流出液中花青素吸光度達(dá)到上樣液花青素吸光值1/10時(shí)認(rèn)為已出現(xiàn)泄露，即第8管（上樣量達(dá)到4 BV）上樣液時(shí)出現(xiàn)泄露。洗脫液用量至第21管時(shí)，洗脫液中花青素已完全洗脫。

圖4 HPD-100大孔樹脂對(duì)花青素吸附泄漏曲線及洗脫曲線

2.5 HPLC-DAD分析結(jié)果

黑果腺肋花楸花青素純化樣品在520 nm波長下的HPLC-DAD分析圖譜如圖5所示。

由圖5可知，黑果腺肋花楸花青素可分離出4種單體成分，占比依次是49.04%，41.17%，3.34%及6.45%。經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)組分1為矢車菊素-3-半乳糖苷，組分2為矢車菊素-3-阿拉伯糖苷，組分4為矢車菊素-3-木糖苷，組分3待進(jìn)一步鑒定[18-20]。

圖5 經(jīng)HPD-100大孔樹脂純化后的花青素在520 nm下的HPLC圖

3 結(jié)論與討論

HPD-100大孔樹脂對(duì)黑果腺肋花楸花青素有良好的吸附效果，30 ℃條件下4.5 h可完全吸附；該樹脂對(duì)花青素的吸附過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)模型描述，且以薄膜擴(kuò)散為主；大孔樹脂純化花青素最佳條件為：花青素樣液pH 3.0、上樣量4 BV、上樣流速700 μL/min、解吸液pH 3.0、解吸量5 BV、解吸流速500 μL/min。經(jīng)大孔樹脂純化后的花青素在520 nm的條件下分離出4種黑果腺肋花楸花青素單體成分，即矢車菊素-3-半乳糖苷、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷、矢車菊素-3-木糖苷，還有一種待鑒定。

大孔樹脂純化花青素的機(jī)理是通過吸附和篩分2個(gè)機(jī)制共同作用實(shí)現(xiàn)。一方面，大孔樹脂對(duì)花青素的吸附屬于物理性吸附，吸附作用力為分子間引力，無需高活化能，吸附和解吸速度都較快。另一方面，樹脂的多孔結(jié)構(gòu)又使其對(duì)分子量大小不同的物質(zhì)具有篩選作用。HPD-100大孔樹脂為苯乙烯型非極性共聚體結(jié)構(gòu)，適用于花青素這類弱極性的物質(zhì)的純化分離，與極性較大的大孔樹脂相比，可在吸附花青素的同時(shí)，將一些水溶性多糖和氨基酸雜質(zhì)濾去，且吸附過程不受無機(jī)鹽存在的影響。因此，HPD-100大孔樹脂在吸附純化花青素的同時(shí)，可以去除花青素提取物中的糖、有機(jī)酸、礦物質(zhì)及其他水溶性雜質(zhì)，為花青素的開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。