維生素E/抗菌肽緩釋微膠囊的制備及表征

王新新，許令俠，盧艷慧，曲芙生，李迎秋，梁艷

齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）食品科學與工程學院（濟南 250353）

維生素E作為一類脂溶性活性物質，在抗氧化方面表現突出，但因其對紫外線、氧、酸堿等外部因素較為敏感，無法直接進行使用。被稱為新型抗菌劑的抗菌肽是一類由12~100個氨基酸殘基所構成的兩親性陽離子肽，無交叉抗性和病原菌耐藥性。研究表明，抗菌肽具有多重生物活性，如抗病毒、廣譜抗菌等，并在熱穩(wěn)定性、耐酸堿性、對高等動物正常細胞毒副性小等方面表現優(yōu)異[1-4]。雖然抗菌肽作為抗生素替代品具有巨大的發(fā)展?jié)摿?，但因為生物體內存在的蛋白酶對抗菌肽具有一定水解作用，導致其利用率及抗菌性能大打折扣，在實際應用中嚴重受限。

微膠囊技術是微量物質包裹在聚合物薄膜中的技術，是一種儲存固體、液體、氣體的微型包裝技術。該技術因可增強產品穩(wěn)定性、提高產品緩釋性能以及改善產品物理性質等特點，而被廣泛應用在食品、醫(yī)藥、生物技術等多個領域[5]。復合凝聚微膠囊技術選擇高分子材料（帶相反電荷）作為壁材，將芯材分散于壁材溶液中，通過pH調節(jié)，使相反電荷間通過靜電自組裝在芯材表面形成固化膜，并利用溶解度改變后的相分離現象而獲得的微膠囊[6]。該技術所生產的微膠囊由疏水性的芯材和親水性的壁材所構成，具備高載量、耐高溫的特性，并在芯材的緩控釋方面優(yōu)勢顯著[7]。

試驗以氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠為壁材，以維生素E/抗菌肽為芯材，通過構建復合凝聚體系，制備一種維生素E/抗菌肽復合凝聚微膠囊[8-10]。通過單因素試驗對微膠囊制備工藝進行優(yōu)化處理，并利用紅外、形貌表征、粒徑分析、抗菌肽體外試驗及活性驗證對所制備維生素E/抗菌肽微膠囊進行表征，以期實現維生素E和抗菌肽在體內利用率的提升及抗菌性能的緩慢釋放[11]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨基-β-環(huán)糊精（山東濱州智源生物科技有限公司）；阿拉伯膠（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；維生素E（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；抗菌肽（上海玉博生物科技有限公司）；吐溫80（上海麥克林生化科技有限公司）；人體胃液（福州飛凈生物科技有限公司）。

1.2 儀器與設備

ESR-500X高速剪切乳化機（南通博萊德機械科技有限公司）；FS-1高速勻漿機（常州市凱航儀器有限公司）；GY-GTGZJ噴霧干燥機（上海歸永電子有限公司）；Quanta 200掃描電鏡（FEI公司）；TENSOR紅外光譜儀（廣東晟澤科技有限公司）；馬爾文3000激光粒度儀（深圳市倍鈉德科技有限公司）；BT-1001智能粉體特性測試儀（丹東百特儀器有限公司）；BGG-9035A鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 復合凝聚微膠囊的制備與優(yōu)化

1.3.1.1 微膠囊芯材的制備

準確稱取200 g維生素E油和適量的吐溫80（調節(jié)HLB值在10~13.5）置于高壓剪切乳化機中，以2 000 r/min轉速高速分散處理10 min后，將等質量的抗菌肽水溶液緩慢滴入其中，并以3 000 r/min轉速進行乳化分散處理30 min，獲得含抗菌肽的復合凝聚微膠囊芯材。

1.3.1.2 復合壁材溶液的制備

將適當比例氨基-β-環(huán)糊精、阿拉伯膠按照一定比例混合后倒入200 mL蒸餾水中，45 ℃氣浴恒溫搖床（水浴鍋）中加熱攪拌至溶解以形成復合凝聚微膠囊壁材。

1.3.1.3 復合凝聚微膠囊的制備[12-13]

取100 g壁材溶液置于高速勻漿機中，以2 000 r/min速度高速攪拌10 min后緩慢滴入復合凝聚微膠囊芯材溶液，并提高轉速至10 000 r/min進行分散處理。5min后將混合液轉移到高壓均質機中進行二次混合處理，處理條件：30 MPa下10 min，49 MPa下5 min，獲得分散均一的微膠囊預備液。利用1 mol/L HCl溶液將體系調至pH 4.5左右后繼續(xù)反應10 min，降溫至15 ℃以下并用0.2 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH 6.0進行固化處理。將所制備的復合凝聚微膠囊分散液靜置20~24 h后，棄去上清液得到微膠囊濕囊，并利用離心噴霧干燥得到試驗所需的復合凝聚微膠囊[14]。噴霧干燥的條件設置為：進料流速500 mL/h，進風口、出風口溫度分別為180 ℃和80 ℃[15-16]。

1.3.2 微囊包埋率測定[17]

從泉州志愿服務開展的情況看，大部分志愿活動是由政府部分機構組織的，志愿者也是由政府機關工作人員組成。政府主導和行政推動的方式雖然有利于啟動志愿服務活動，但過分依靠行政推動往往會出現“被志愿”或志愿服務形式化或運動化的問題。[7]由于長期的行政化主導，一方面讓民眾產生誤解，以為志愿服務是政府行為；一方面很容易形成運動式，出現形式化的問題；一方面“被志愿”者在心理上對志愿服務活動會產生抵觸情緒。

通過索氏提取法測定總油含量。準確稱取2.0 g微囊固體M0，用9 cm濾紙進行包裹，研磨使其充分粉碎，稱取質量為M1，將包裹后的樣品用石油醚進行索氏提取，8 h后80 ℃烘干得到質量M2?？傆秃堪词剑?）計算。

表面油含量測定：準確稱取2 g粉體M0加入45 mL石油醚，輕搖1 min抽濾，洗滌漏斗，抽濾，將抽濾后的液體烘干，稱取質量M1。表面油含量按式（2）計算，包埋率按式（3）計算。

1.3.3 微膠囊粒徑測定

利用激光粒度儀來測定微膠囊的粒徑大小并表征其粒徑分布。將微膠囊分散在適量去離子水中制成懸浮液，超聲處理30 s后，在激光粒度儀上進行粒徑的測定。

1.3.4 微膠囊形貌表征

從微觀層面表征微膠囊的結構，采用加速電壓5 keV的JEOL JSM-6700F場發(fā)射掃描電子顯微鏡進行測試（測試前對樣品作噴金處理）。

1.3.5 微膠囊紅外表征

傅里葉變換紅外光譜被用來檢測形成微膠囊后阿拉伯膠、氨基-β-環(huán)糊精、維生素E特征官能團的變化情況，從側面驗證所制備微膠囊對芯材的包埋情況。

1.3.6 復合凝聚微膠囊的體外釋放試驗及抗菌肽活性驗證

模擬人的胃液，以此為模型，以釋放出來的維生素E含量和抗菌肽為指標，測試成分含量變化。

2 結果與討論

2.1 微膠囊制備工藝優(yōu)化

復合凝聚微膠囊制備過程中，以維生素E包埋率為指標，依次以氨基-β-環(huán)糊精與阿拉伯膠比例（3∶1，5∶1，7∶1，9∶1和11∶1）、吐溫80添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）、芯材添加量（25%，35%，45%，55%和65%）和抗菌肽添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）作為變量，進行單因素試驗，從而分析各因素對微囊包埋率影響。

從圖1（a）可知：氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠之間的配比直接影響維生素E油的包埋效果，二者比例為5∶1時，包埋率達到最高值，表明在該比例下氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠之間可形成穩(wěn)定的陰陽離子配對體系，包埋率達到最大值[18]；但隨著氨基-β-環(huán)糊精比例逐步增加，因環(huán)糊精間靜電斥力及空間位阻的存在，破壞原本穩(wěn)定的陰陽離子配對體系的穩(wěn)定性，最終導致微膠囊因壁材體系的不穩(wěn)定產生包埋率下降的問題[19]。

由圖1（b）可以看出：相對于氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠比例而言，吐溫80添加量對包埋效果來說，影響相對較小。隨著吐溫80添加量逐步增加，包埋效果并沒有發(fā)生很大的變化；微膠囊的包埋率在吐溫80添加量1.5%時達到最大，吐溫80添加量增加至2.0%和2.5%時，微膠囊包埋率下降。產生這種現象的原因是吐溫80的加入僅對乳化效果產生影響，對包埋率的影響微乎其微，但隨著添加量逐漸增加，因壁材在總體系中所占比例逐步下降，造成微膠囊“漏油”現象的出現，使包埋率呈現下降趨勢。因此，選取添加量1.5%作為微膠囊制備的最佳乳化劑使用量。

作為試驗的主承載體，芯材添加量的變化對包埋效果的影響較大，隨著芯材添加量增加，包埋效果呈現先升高后下降趨勢，芯材添加量35%時，包埋率達到最大值，如圖1（c）所示。但隨著芯材添加量再度增加，因壁材在體系中比例逐步下降，使復合凝聚反應所形成的囊壁越來越薄，微膠囊力學性能大幅降低。由此可知，在微膠囊制備過程中，芯材添加量設定35%時，達到最大包埋率（83.2%），包埋效果最好。

眾多抗菌肽微膠囊研究中表明，抗菌肽的濃度直接關系到該微膠囊的實際應用效果。據相關文獻報道，抗菌肽雖然具有很強的抵抗病毒或真菌、抑制或殺傷腫瘤細胞等功能，但其在人體的吸收量相對較少。因此分別選取0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%作為抗菌肽的添加量，并研究不同添加量對微膠囊包埋率的影響情況。從圖1（d）中可以看出，抗菌肽添加量對微膠囊包埋率的影響總體呈現先增加后減小趨勢（添加量1.5%時，包埋率最高可達81.5%），但相對于壁材配比、芯材添加量而言，抗菌肽添加量對微膠囊包埋率的影響總體偏小。

圖1 氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠比例（a）、吐溫80用量（b）、芯材用量（c）、抗菌肽添加量（d）對包埋率的影響

2.2 微膠囊粒徑分析及形貌表征

微膠囊的微觀結構、粒徑大小對其穩(wěn)定性、機械性能和粉體特性具有不同程度的影響。試驗用激光粒度分析儀測量、表征微膠囊的粒徑大小和分布，用掃描電鏡來表征微膠囊的微觀形態(tài)（圖2）。由圖2（a）可知，所制備微膠囊的平均粒徑為2.823±0.11 μm，處于亞微囊區(qū)域，PDI為0.322，粒徑分布集中且正態(tài)分布良好，表明所制備的微膠囊大小均一、分散性良好[20]。由圖2（b）可以看出所制備微膠囊為表面規(guī)則，無裂紋的球體顆粒，表面無撕裂跡象[21]。但噴霧干燥過程中，高溫、高壓的制備條件易對一些囊壁薄的顆粒產生不利影響，最終導致膠囊破裂現象的出現，如圖2（c）所示。破裂微膠囊內部存在空穴，囊壁具有一定的厚度且結構致密。這表明氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠通過復合凝聚體系所形成的微膠囊壁可將芯材完美的包埋于其中，保證所制備微膠囊的高包埋率。

圖2 微膠囊粒徑及形貌表征圖

2.3 紅外光譜表征

氨基-β-環(huán)糊精因特有的疏水性空腔結構，使其能夠將脂溶性物質包埋在空腔內部形成具有相對穩(wěn)定結構的微膠囊體系。包埋過程中，由于疏水作用、靜電相互作用等非共價鍵的存在，使原料活性官能團的紅外特征峰發(fā)生不同程度變化。由圖3可知，阿拉伯膠的特征吸收峰中1 758 cm-1代表羰基伸縮振動峰、1 573 cm-1代表芳香環(huán)骨架振動峰；氨基-β-環(huán)糊精中3 324 cm-1代表氨基伸縮振動峰；維生素E的特征吸收峰主要包括甲基不對稱伸縮振動峰（2 954 cm-1）、羰基伸縮振動峰（1 761 cm-1）、甲基彎曲振動峰（1 368 cm-1）及C—O—C反對稱伸縮振動峰（1 208 cm-1）[20]。由圖3（d）所示，在形成復合凝聚微膠囊后，阿拉伯膠、氨基-β-環(huán)糊精及維生素E的特征峰呈現出不同程度的強度變化。其中，以維生素E的變化最大：位于2 954 cm-1、1 761 cm-1的特征峰完全消失、1 368 cm-1和1 208 cm-1處特征峰變小，表明維生素E被有效的包埋于氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠所形成的微膠囊中。

圖3 阿拉伯膠（a）、氨基-β-環(huán)糊精（b）、維生素E（c）、微膠囊（d）的紅外光譜圖

2.4 微膠囊穩(wěn)定性研究

理想的微膠囊是保護芯材中的活性物質不受體內酶的破壞，并保證其可在體內緩慢釋放被人體所吸收。因此，微膠囊在模擬胃液中的穩(wěn)定性是保證微膠囊對活性物質具有保護作用的重要指標。從經模擬胃液對微膠囊進行消化處理后的維生素E釋放情況和抗菌肽活性2個方面對微膠囊穩(wěn)定性進行研究。

如圖4所示，在模擬人體胃液的環(huán)境中，通過復合凝聚法制得的微膠囊緩釋性比簡單的物理共混具有顯著提高。結果表明，4 h后微膠囊中維生素E的釋放率僅34%，而物理共混的釋放率達92%，直到18 h后微膠囊體系內維生素E才達到完全釋放。這意味著經微囊化處理的維生素E具有抵抗外部因素影響的能力，產品穩(wěn)定性得以提高，且緩釋效果顯著，可達到在體內緩慢釋放的功效[22]。

圖4 不同混合方式的維生素E在模擬胃液釋放率

由大腸桿菌抑制性結果來看，如圖5所示，基于復合凝膠體系所制備的微膠囊對于活性成分抗菌肽具有很高的保護性，導致微膠囊在抗菌性上明顯低于未被微囊包裹的抗菌肽。據相關文獻報道，阻礙人體吸收抗菌肽類物質的主要障礙為蛋白酶對其的水解作用，因此進一步研究微膠囊的蛋白酶耐受性來驗證所制備微膠囊的穩(wěn)定性[23]。從蛋白酶的耐受性來看，微膠囊化后的抗菌肽耐受性相比于常規(guī)抗菌肽提高73%，意味著抗菌肽已經成功包埋于壁材或者內腔中，使抗菌肽的蛋白酶耐受性大幅提升?？偟膩碚f，利用復合凝聚微膠囊技術對抗菌肽進行包埋，雖然一定程度上抑制其抗菌活性，但這種影響相比于對抑制蛋白酶降解來講可忽略不計。

圖5 不同制備方式的抗菌肽抑菌性和耐受性比較

3 結論

試驗利用復合凝聚微膠囊體系對維生素E/抗菌肽進行穩(wěn)定性包埋處理，單因素試驗結果表明，所制備的微膠囊在氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠添加比例5∶1、吐溫80添加量1.5%、芯材添加量35%，芯材中抗菌肽添加量1.5%時包埋率達到最大，包埋效果顯著。紅外光譜結果表明氨基-β-環(huán)糊精和阿拉伯膠間通過靜電相互作用、疏水作用等非共價鍵間所形成的壁材可有效實現芯材包埋；粒徑分布及掃描電鏡結果表明所制備微膠囊平均粒徑為2.823±0.11 μm，分布集中且正態(tài)分布良好；穩(wěn)定性試驗表明4 h后微膠囊芯材釋放率僅34%，18 h后芯材可完全釋放；抗菌肽活性驗證結果表明經微膠囊化處理后的抗菌肽相比于未處理的抗菌肽，在耐受性有所提升，而抗菌活性有所抑制，但影響較小。由此可知，通過微膠囊化處理后的維生素E/抗菌肽完全可以滿足當前對于維生素E和抗菌肽等活性物質體內緩釋需求，在食品、醫(yī)藥等領域具有巨大應用潛力。