蛋白酶對茶湯中游離氨基酸含量的影響

程謙偉，林穎鳳，楊菊，陳通，孟陸麗，鄭燕紅

廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院（柳州 545006）

中國的茶葉分為綠、白、黃、青、紅和黑茶六大類，其中發(fā)酵紅茶是目前最受人們歡迎的茶類之一[1]。茶蛋白是茶葉中主要的化學(xué)成分之一，其除了對茶葉色、香、味具有重要意義，同時還具有降血脂和抗氧化的營養(yǎng)價值[2-4]。茶葉中的茶蛋白含量占茶葉干重的20%~30%，其中非水溶性蛋白約占茶蛋白總量的95%，主要包括谷蛋白和醇溶蛋白[5-6]。但茶葉沖泡后只有少量的水溶性蛋白進入茶湯，約占總蛋白的2%，而大量的非水溶性蛋白則殘留在茶渣里，這部分茶蛋白具有很高的潛在利用價值[7]。

在制備發(fā)酵紅茶的過程中，在其揉捻工序中添加堿性蛋白酶，通過酶解茶葉中豐富的蛋白質(zhì)，進而增加茶湯中游離氨基酸的含量，提高茶湯的營養(yǎng)價值，為在制茶過程中添加外源酶來改善茶葉的品質(zhì)和提高茶湯營養(yǎng)價值提供一定的參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要原料、試劑

茶葉（廣西柳州三江縣）；堿性蛋白酶（酶活力10萬 U/g，南寧龐博生物工程有限公司）；茶氨酸（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；茚三酮（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸氫二鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；磷酸二氫鉀（西隴科學(xué)股份有限公司）；等。

1.2 試驗儀器

LRH-250-A生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；MS104S電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；TU-1950紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；等。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅茶制作工藝

茶青→凋萎→揉捻（加入堿性蛋白酶液，液茶比質(zhì)量比為1∶5）→發(fā)酵→干燥即得成品

1.3.2 茶湯待測液的制備

茶葉浸泡（料液比1∶90 g/mL，100 ℃水浸泡15 min）→抽濾→取濾液定容至100 mL即為茶湯待測液

1.3.3 茶葉發(fā)酵工藝的優(yōu)化

揉捻的過程中加入一定量的堿性蛋白酶液，分別考察了酶添加量（0.4%~1.4%）、發(fā)酵時間（5~9 h）、發(fā)酵溫度（24~32 ℃）等因素對茶湯中游離氨基酸含量的影響。

1.3.4 茶湯中游離氨基酸含量的測定

采用茚三酮比色法測定茶湯待測液中的氨基酸含量[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶添加量對茶湯游離氨基酸含量的影響

在揉捻的過程中分別按酶添加量0.4%，0.6%，0.8%，1.0%，1.2%和1.4%加入酶液，在28 ℃的條件下發(fā)酵6 h，研究堿性蛋白酶的酶添加量對茶湯中游離氨基酸含量的影響，其結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，隨著酶用量的增加，茶湯中的游離氨基酸含量呈上升趨勢，表明在此條件下隨著酶添加量的增加，茶葉中蛋白質(zhì)的水解程度提高，進而使茶湯中的游離氨基酸含量有所提高。

圖1 酶添加量對茶湯游離氨基酸含量的影響

2.2 發(fā)酵時間對茶湯游離氨基酸含量的影響

在酶添加量1.2%、發(fā)酵溫度28 ℃的條件下，分別發(fā)酵5，6，7，8和9 h，考察發(fā)酵時間對茶湯中游離氨基酸含量的影響。由圖2可以看出，茶葉在發(fā)酵初期堿性蛋白酶促進蛋白質(zhì)水解程度提高，因而隨著發(fā)酵時間的延長，茶湯中的游離氨基酸含量在發(fā)酵初期呈上升趨勢，在發(fā)酵時間達到6 h后游離氨基酸含量變化趨勢不明顯并隨著發(fā)酵時間的延長略有下降，這可能是因為隨著發(fā)酵時間的進一步延長，茶葉中的部分游離氨基酸會轉(zhuǎn)變?yōu)槿┑任镔|(zhì)，從而使游離氨基酸的含量有所下降[9-11]。

圖2 發(fā)酵時間對茶湯游離氨基酸含量的影響

2.3 發(fā)酵溫度對茶湯游離氨基酸含量的影響

在酶添加量1.2%、發(fā)酵溫度分別為24，26，28，30和32 ℃的條件下發(fā)酵6 h，研究發(fā)酵溫度對茶湯中游離氨基酸含量的影響，其結(jié)果如圖3所示。發(fā)酵溫度從24 ℃上升至32 ℃的過程中，茶湯中游離氨基酸的含量是隨著發(fā)酵溫度的升高而上升的，這與堿性蛋白酶的酶活力在此條件下隨著溫度的升高酶活力增大有關(guān)。

圖3 發(fā)酵溫度對茶湯游離氨基酸含量的影響

2.4 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取酶添加量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度作為因素，以茶湯中的游離氨基酸含量為指標(biāo)，進行正交試驗，其因素水平表如表1所示。

表1 正交因素水平表

其正交試驗結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗結(jié)果

從表2可以看出，在研究的條件下所取得的優(yōu)方案為A3B2C3，即堿性蛋白酶添加量1.4%、發(fā)酵時間6 h、發(fā)酵溫度28 ℃。茶湯中游離氨基酸含量的因素影響大小依次是B＞C＞A，即發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和堿性蛋白酶添加量對發(fā)酵茶的茶湯中游離氨基酸含量的影響依次減小。

對正交試驗結(jié)果進行方差分析，所得到的方差分析表如表3所示。查表得F臨界值F0.05(2,2)=19，F(xiàn)0.01(2,2)=99。由表3可以看出，發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對發(fā)酵茶茶湯中的游離氨基酸含量影響顯著，其中又以發(fā)酵時間的影響最為明顯，而堿性蛋白酶的添加量在研究條件下對茶湯中的游離氨基酸的影響差異不顯著。在堿性蛋白酶添加量1.4%、發(fā)酵時間6 h、發(fā)酵溫度28 ℃的條件下制備發(fā)酵茶，茶湯中的游離氨基酸含量為43.79 mg/100 mL，而未添加堿性蛋白酶制備的發(fā)酵茶茶湯中游離氨基酸含量為36.88 mg/100 mL。

表3 正交試驗結(jié)果的方差分析

3 結(jié)論

在酶添加量1.4%、發(fā)酵溫度28 ℃、發(fā)酵時間6 h的條件下制備發(fā)酵茶，其茶湯中的游離氨基酸含量為43.79 mg/100 mL，未添加酶在相同條件下進行發(fā)酵所得茶葉制得的茶湯中游離氨基酸含量為36.88 mg/100 mL。由此可見，茶葉在揉捻的過程中添加堿性蛋白酶后，在一定的條件下可以促進茶葉中的蛋白質(zhì)水解，從而使茶湯中的游離氨基酸含量有所增加，改善茶湯的品質(zhì)。