響應(yīng)面試驗優(yōu)化大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝

程天德，游麗君

1.清遠職業(yè)技術(shù)學院食品藥品學院（清遠 511510）；2.華南理工大學食品科學與工程學院（廣州 510640）

大果山楂是一種有著悠久歷史的藥食兩用水果，與中國傳統(tǒng)中藥山楂具有相似的成分和功效[1-2]。大果山楂既可鮮食，也可加工成山楂酒、山楂果汁、山楂醋、山楂茶等[3-4]。雖然大果山楂營養(yǎng)價值豐富，但由于其味道酸澀，山楂汁、山楂茶等產(chǎn)品難以被消費者廣泛接受，因此需要研究可改善大果山楂澀味的深加工技術(shù)。果汁脫澀的方法主要有物理脫澀法、化學脫澀法和生物脫澀法[5]。劉國凌等[6]進行活性炭-超聲波聯(lián)合脫除法對崗稔果汁的脫澀研究，有一定脫澀效果，但存在果汁不穩(wěn)定，易失去原有色澤和風味等缺陷。張珊珊等[7]采用明膠對山荊子果汁進行脫澀，效果較好，但明膠脫澀法特異性強，存在二次沉淀等問題。朱一方等[8]進行單寧酶對刺梨果汁脫澀的研究，并與明膠脫澀法和羧甲基殼聚糖脫澀法進行比較，顯示酶法脫澀效果更好，但在最優(yōu)條件下的單寧脫除率僅為70.67%，部分單寧由于有果膠的保護而無法被分解，導致脫澀效果難以進一步提升。

大果山楂汁的澀味主要來自于單寧類物質(zhì)[9]，除可采用單寧酶直接降解單寧而脫澀外，還可采用果膠酶、纖維素酶水解大果山楂汁中的果膠和多糖，使大果山楂汁中的單寧失去果膠等物質(zhì)的保護而與其他膠體共同沉淀，達到脫澀的目的[10]。試驗以大果山楂汁中的單寧含量為考察指標，采用單寧酶、果膠酶和纖維素酶進行酶解，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，確定最佳復(fù)合酶配比，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝，得出最優(yōu)工藝條件，以期為大果山楂汁的脫澀和產(chǎn)品品質(zhì)的改善提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大果山楂（廣東省連山縣某大果山楂種植基地）；單寧標準品（上海金穗生物科技有限公司）；500 U/g單寧酶（南寧東恒華道生物科技有限責任公司）；30 000 U/g果膠酶（南寧龐博生物工程有限公司）；20 000 U/g纖維素酶（山東隆科特酶制劑有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ-2型組織搗碎機（金壇市晨陽電子儀器廠）；UV-759型分光光度計（上海精密儀器儀表有限公司）；JA3003N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；PHS-25型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；SHA-CA型數(shù)顯恒溫水浴振蕩器（常州金壇友聯(lián)儀器研究所）；CL4S型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 大果山楂汁制備工藝

準確稱取100 g新鮮大果山楂，加入500 mL pH 5.0的磷酸緩沖溶液，用高速組織搗碎機打漿，煮沸10 min，冷卻至室溫后于3 500 r/min離心20 min，取大果山楂汁于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 單寧含量測定

參考GB/T 27985—2011[11]進行測定。分別取2.0，4.0，6.0，8.0和10.0 mL 10 μg/mL的單寧標準溶液于5個50 mL容量瓶中，依次加入3.0 mL鐵（Ⅲ）溶液，置于85 ℃恒溫水浴鍋中水浴20 min。將冷卻至室溫的標準溶液分別依次加入4.0 mL pH 5.0的磷酸緩沖溶液、6.0 mL鄰二氮菲、1.0 mL EDTA溶液，用蒸餾水定容至刻度后搖勻，靜置10 min，以試劑空白作對照，在510 nm波長下測定吸光度，制作單寧標準曲線，回歸方程為Y=0.472 5X+0.082 6，R2=0.996 2。參考上述方法測定大果山楂汁酶解前后單寧含量，計算得出單寧脫除率（%）。

1.3.2.2 單酶水解工藝

分別稱取一定質(zhì)量的單寧酶、果膠酶和纖維素酶加入大果山楂汁中，于45 ℃恒溫水浴鍋中酶解2 h，酶解結(jié)束后于95 ℃熱水中滅酶15 min，減壓抽濾即得酶解液。

1.3.2.3 確定單酶最佳添加量

分別向大果山楂汁中添加0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 g/100 mL的單寧酶、果膠酶和纖維素酶，按照1.3.2.2的工藝進行酶解，分別測定各酶解液中單寧含量，通過分析單酶添加量對酶解液中單寧脫除率的影響，確定各種酶的合適添加量。

1.3.2.4 確定復(fù)合酶比例

根據(jù)1.3.2.3的試驗結(jié)果，按照表1進行正交試驗，以復(fù)合酶比例為變量，按照1.3.2.2的工藝進行酶解，以大果山楂汁單寧脫除率為指標，確定最佳復(fù)合酶比例。

表1 復(fù)合酶比例的正交試驗因素水平表單位：g/100 mL

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

1.3.3.1 酶解溫度對大果山楂汁脫澀效果的影響

采用1.3.2.4所確定的最佳復(fù)合酶比例加入酶制劑，分別在30，35，40，45，50和55 ℃條件下按1.3.2.2的工藝進行酶解，研究不同溫度對大果山楂汁脫澀效果的影響，確定酶解溫度的合適范圍。

1.3.3.2 酶解pH對大果山楂汁脫澀效果的影響

采用1.3.2.4所確定的最佳復(fù)合酶比例加入酶制劑，分別在pH 3.5，4.0，4.5，5.0，5.5和6.0的條件下按1.3.2.2的工藝進行酶解，研究不同pH對大果山楂汁脫澀效果的影響，確定酶解pH的合適范圍。

1.3.3.3 酶解時間對大果山楂汁脫澀效果的影響

采用1.3.2.4所確定的最佳復(fù)合酶比例加入酶制劑，按1.3.2.2的工藝分別酶解0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 h，研究不同酶解時間對大果山楂汁脫澀效果的影響，確定合適的酶解時間。

1.3.4 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)1.3.3的試驗結(jié)果，選擇酶解溫度、酶解pH和酶解時間3個因素及各因素合適的水平，依據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，采用Design-Expert 8.0.6軟件設(shè)計三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗，以大果山楂汁單寧脫除率為響應(yīng)值，利用響應(yīng)面分析法對大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝進行優(yōu)化。響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計的因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平表

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2010軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析并繪制圖表，采用正交設(shè)計助手Ⅱ進行正交試驗設(shè)計和顯著性差異分析，使用Design Expert 8.0.6進行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單酶添加量對大果山楂汁脫澀效果的影響

單寧酶、果膠酶和纖維素酶添加量對大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖1所示?？梢钥闯?，3種酶都能提高大果山楂汁單寧脫除率，但單寧酶的影響比果膠酶、纖維素酶更明顯，原因在于果膠酶和纖維素酶主要是分解大果山楂汁中的果膠類物質(zhì)及多糖，使單寧溶出并與其他物質(zhì)形成膠體而共同沉淀，單寧酶則是直接分解單寧類物質(zhì)從而降低大果山楂汁中單寧含量。單寧酶添加量0.7 g/100 mL時，大果山楂汁單寧脫除率達到68.35%，繼續(xù)增加單寧酶，單寧脫除率反而下降。果膠酶添加量達到0.3 g/100 mL時，大果山楂汁單寧脫除率達到26.72%，繼續(xù)增加果膠酶，單寧脫除率的變化趨勢逐漸平緩。纖維素酶添加量0.5 g/100 mL時，大果山楂汁單寧脫除率達到22.66%，繼續(xù)增加纖維素酶，單寧脫除率的變化趨勢逐漸平緩。

圖1 單酶添加量對大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.2 復(fù)合酶比例正交試驗結(jié)果

復(fù)合酶比例正交試驗及方差分析結(jié)果見表3和表4。

由表3可知，單寧酶的極差為16.257，果膠酶和纖維素酶的極差分別為2.704和2.137，說明單寧酶添加量對大果山楂汁單寧脫除率的影響最大。從各水平的均值可以看出，正交試驗所得的最佳復(fù)合酶比例為果膠酶0.4 g/100 mL、單寧酶0.7 g/100 mL、纖維素酶0.6 g/100 mL。按此比例添加復(fù)合酶，按1.3.2.2的工藝進行酶解驗證試驗，大果山楂汁的單寧脫除率為86.23%，高于正交試驗所有試驗組。由表4可知，單寧酶添加量對大果山楂汁單寧脫除率有顯著性影響，果膠酶和纖維素酶添加量對大果山楂汁單寧脫除率影響不顯著。

表3 復(fù)合酶比例正交試驗結(jié)果

表4 正交試驗方差分析表

2.3 單因素試驗結(jié)果

2.3.1 酶解溫度對大果山楂汁脫澀效果的影響

酶解溫度對大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖2所示。隨著溫度升高，大果山楂汁單寧脫除率隨之提高，酶解溫度50 ℃時，復(fù)合酶解的效果最好，大果山楂汁單寧脫除率達到最大值85.42%，進一步提高溫度，大果山楂汁單寧脫除率開始下降，這很可能是由于過高的溫度降低復(fù)合酶的酶活力，從而影響單寧、果膠和多糖的分解，因此選擇酶解溫度50 ℃左右進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖2 酶解溫度對大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.3.2 酶解pH對大果山楂汁脫澀效果的影響

酶解pH對大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖3所示。隨著pH提高，大果山楂汁單寧脫除率隨之上升，pH 5.5時，復(fù)合酶解的效果最好，大果山楂汁單寧脫除率達到最大值82.76%，進一步提高pH，大果山楂汁單寧脫除率開始下降，這很可能是由于繼續(xù)提高pH，超出復(fù)合酶的最適pH范圍，酶活力降低導致單寧、果膠和多糖的分解受到不利影響，因此選擇pH 5.5左右進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖3 pH對大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.3.3 酶解時間對大果山楂汁脫澀效果的影響

酶解時間對大果山楂汁單寧脫除率的影響如圖4所示。隨著酶解時間延長，大果山楂汁單寧脫除率隨之上升，酶解至2 h時，大果山楂汁單寧脫除率達到最大值84.06%，繼續(xù)酶解，大果山楂汁單寧脫除率沒有太大變化，這可能是由于隨著時間的延長，底物活化能逐漸減小，當?shù)竭_一定時間后底物活化能降至最低，即使時間再延長也很難進一步酶解底物，因此選擇酶解時間2 h左右進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

圖4 酶解時間對大果山楂汁單寧脫除率的影響

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與方差分析

大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果如表5所示。

表5 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化試驗方差分析結(jié)果見表6。模型的p值＜0.05，說明回歸性顯著，結(jié)果可信。失擬項p值＞0.05，說明該模型對大果山楂汁復(fù)合酶法脫澀工藝的分析和預(yù)測可靠。模型的一次項C（酶解時間）影響顯著，其余一次項影響均不顯著；二次項中酶解溫度影響顯著，其余二次項影響不顯著；交互項中酶解溫度與酶解pH交互作用影響顯著，其余交互項影響不顯著。

表6 響應(yīng)面試驗方差分析結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面分析

不同因素之間的交互作用對大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線如圖5，圖6和圖7所示。

圖6 酶解溫度與酶解時間交互作用對大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線

圖7 酶解pH與酶解時間交互作用對大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線

從3D響應(yīng)面圖可以看出各因素的交互作用對大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)值都是先隨各因素數(shù)值的增加而增加，響應(yīng)值達到極限后，隨著各因素數(shù)值增加，響應(yīng)值出現(xiàn)不同程度下降。從圖5中的等高線可以看出，酶解溫度與酶解pH之間的交互作用對大果山楂汁單寧脫除率具有顯著性影響，其他因素之間交互作用的影響不顯著，這與表6中交互項AB（酶解溫度與酶解pH）的分析結(jié)果一致。

圖5 酶解溫度與酶解pH交互作用對大果山楂汁單寧脫除率影響的響應(yīng)面及等高線

2.4.3 驗證試驗

采用Design Expert 8.0.6軟件對回歸模型進行預(yù)測分析，將大果山楂汁單寧脫除率值設(shè)置得盡可能大，得出最佳酶解條件：酶解溫度50.4 ℃、酶解pH 4.96、酶解時間2.5 h。單寧脫除率為90.53%。為便于操作，確定酶解條件：酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.0、酶解時間2.5 h。在此條件下進行3次驗證試驗，所得單寧脫除率均值為89.92%，與理論值90.53%無顯著性差異，表明該預(yù)測模型科學可行。

3 結(jié)論

單寧又被稱為植物多酚，是廣泛存在于果蔬中的一種多元酚類化合物。大果山楂中的單寧含量較高，特別是果皮和果核中的單寧含量明顯高于其他部位[12]。大果山楂汁在加工過程中，由于果皮和果核很難完全去除，很容易使其中的大量單寧進入果汁中，影響大果山楂汁的風味和品質(zhì)[13]。大果山楂汁的澀味主要是由于單寧與口腔中的蛋白質(zhì)結(jié)合生產(chǎn)沉淀，形成收斂感和干燥感而造成的[14]。除此之外，單寧中的酚羥基還可能被氧化成深色的鄰醌，導致大果山楂汁色澤不穩(wěn)定；單寧在酸性條件下還可能發(fā)生縮合，形成不溶性大分子從而使果汁變得渾濁[15]。因此，研究如何脫除單寧成為大果山楂汁加工過程中的關(guān)鍵控制點。

單寧酶是一類脂肪酶，又稱單寧?；饷?，可水解縮合單寧、沒食子單寧和沒食子酯鍵。美國、日本等在利用單寧酶提高果汁飲料冷溶性方面的研究較深入。Tsai等[16]研究采用纖維素酶、果膠酶、單寧酶處理茶飲料的效果，結(jié)果顯示采用單寧酶進行處理后，茶飲料的“冷渾”現(xiàn)象得到明顯改善。Chandini等[17]采用單寧酶處理茶飲料，可明顯降低茶飲料的兒茶素苦味閾值，改善飲料的苦澀味，口感較好。果膠酶是一類降解果膠基質(zhì)的酶的總稱[18-19]，主要作用于植物細胞壁中的果膠，破壞果膠與半纖維素組成的無定型結(jié)構(gòu)，有助于細胞中的有效成分釋出。纖維素酶是一類能夠水解纖維素中葡萄糖苷鍵的酶的總稱[20-21]，主要作用于植物細胞壁中的纖維素，與果膠酶一起協(xié)作破壞細胞壁，提高內(nèi)容物的溶出率。

大果山楂在成熟過程中，單寧與果膠相互接觸并結(jié)合，僅使用單寧酶處理大果山楂汁，單寧脫除率始終有限，這在朱一方等[8]的研究中得到驗證。試驗聯(lián)用單寧酶、纖維素酶和果膠酶處理大果山楂汁，破壞大果山楂細胞壁，使細胞內(nèi)單寧類物質(zhì)充分釋出，提高單寧酶作用時的底物濃度，大幅提高單寧脫除率，有效改善大果山楂汁的澀味。結(jié)果顯示，采用復(fù)合酶法處理大果山楂汁的脫澀效果優(yōu)于單酶處理法，最佳復(fù)合酶配比為果膠酶0.4 g/100 mL、單寧酶0.7 g/100 mL、纖維素酶0.6 g/100 mL。采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合酶法脫澀工藝，脫澀效果進一步提升，所得的最佳酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解pH 5.0、酶解時間2.5 h。此條件下大果山楂汁單寧脫除率為89.92%。