基于Box-Behnken法的靈芝孢子粉片劑配方優(yōu)化

張劍，弓志青，崔文甲，萬(wàn)婕，王文亮，李永生

1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所（濟(jì)南 250100）；2.山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250100）；3.農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（濟(jì)南 250100）

靈芝（Ganoderma lucidum）又稱“瑞草”“仙草”“還魂草”，屬于擔(dān)子菌門擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬，是我國(guó)重要的藥用真菌。自古以來(lái)，傳統(tǒng)中醫(yī)就將靈芝視為珍貴藥材，其有扶正固本、延年益壽之功效[1]。靈芝孢子粉是靈芝子實(shí)體發(fā)育成熟期從菌蓋中彈射出來(lái)的卵型生殖細(xì)胞，大小在4~10 μm[2]，含有多糖[3]、三萜[4]、甾醇[5]等多種生物活性成分，具有抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[6]、免疫調(diào)節(jié)[7]、保肝[8]、降血糖[9]、抗氧化[10-11]等藥理活性。因此，靈芝孢子粉成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，在保健市場(chǎng)上越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞[9,12]。

目前，靈芝孢子粉經(jīng)歷了未破壁靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉、去壁靈芝孢子粉三代技術(shù)變革，但其主要是以粉劑、顆粒劑、膠囊等劑型存在[12]，以上產(chǎn)品有容易吸潮變性、食用不便的缺點(diǎn)。片劑產(chǎn)品由于食用方便及便于攜帶，受到消費(fèi)者的喜愛(ài)。由于靈芝孢子粉富含油脂類物質(zhì)，分子間的凝聚力減弱，壓片時(shí)易造成松片，增加了片劑成型的難度；另外，其含有三萜類物質(zhì)，導(dǎo)致片劑發(fā)苦[13]，產(chǎn)品接受度低。為解決以上問(wèn)題，此次研究在遞次混合前處理及濕法造粒壓片技術(shù)的基礎(chǔ)上，以靈芝孢子粉、吸油劑、玫瑰粉的添加量為響應(yīng)因素，片劑外形、片重差異、硬度及脆碎度的綜合評(píng)分為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析優(yōu)化靈芝孢子粉片劑的配方，以期為靈芝孢子粉的進(jìn)一步綜合開發(fā)利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

破壁靈芝孢子粉（破壁率≥98%，聊城冠縣店子鎮(zhèn)）；玫瑰粉（山東濟(jì)南市平陰縣）；二氧化硅（佳味源實(shí)業(yè)有限公司）；甘露糖醇（河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司）；羧甲基纖維素鈉（南通泰利達(dá)新材料有限公司）；硬脂酸鎂（河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司）。以上均為食品級(jí)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

AR423CN電子天平：奧豪斯（上海）儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司）；YK-60搖擺式顆粒機(jī)（長(zhǎng)沙市中南制藥機(jī)械廠）；TDP-5T單沖壓片機(jī)（長(zhǎng)沙市中南制藥機(jī)械廠）；TA.XT.plus質(zhì)構(gòu)儀（超技儀器有限公司）；CS-I脆碎度檢查儀（天津市旭陽(yáng)儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程及操作要點(diǎn)

圖1 靈芝孢子粉片劑制作工藝流程圖

遞次混合法混合：根據(jù)試驗(yàn)配方，首先將靈芝孢子粉和吸油劑（二氧化硅與β-環(huán)狀糊精比例為1∶1）進(jìn)行研磨混合，充分吸附靈芝孢子粉中的油脂性物質(zhì)，再加入玫瑰粉及甘露糖醇，通過(guò)研磨獲得粒度均一的物料。

制軟材：將混勻的物料，加入適量黏合劑2%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na），制成“輕握成團(tuán)，輕壓即散”的軟材。

造粒：將軟材放入造粒機(jī)的料斗內(nèi)進(jìn)行造粒，其中篩網(wǎng)目數(shù)為0.850 mm（20目）。

干燥：在50 ℃烘箱中進(jìn)行干燥，烘至物料含水量在3.5%~5%即可。溫度不宜過(guò)高，否則會(huì)破壞靈芝孢子粉中的營(yíng)養(yǎng)成分。

整粒：將干燥后的顆粒與1%硬脂酸鎂混勻，再次放入造粒機(jī)中過(guò)0.850 mm（20目）的樣品篩進(jìn)行整粒。

壓片：將經(jīng)過(guò)整粒的物料放入壓片機(jī)進(jìn)樣斗中進(jìn)行壓片，其中填充壓力40 kN，填充深度12 mm。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選擇靈芝孢子粉添加量（10%，20%，30%，40%和50%）、吸油劑添加量（10%，15%，20%，25%和30%）、玫瑰粉添加量（0，5%，10%，15%和20%）為考察因素，以造粒后物料流動(dòng)性、片劑外觀、硬度和片重差異為檢測(cè)指標(biāo)，探討各因素變化對(duì)靈芝孢子粉片劑品質(zhì)的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇靈芝孢子粉添加量、吸油劑添加量、玫瑰粉添加量為因變量，以片劑綜合評(píng)分為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 單位：%

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 物料流動(dòng)性

采用固定漏斗法測(cè)定物料的休止角，評(píng)價(jià)物料的流動(dòng)性[14]。其中：當(dāng)休止角大于45°時(shí)，其流動(dòng)性較差；當(dāng)休止角小于40°時(shí)，其流動(dòng)性良好；當(dāng)休止角小于35°時(shí)，其流動(dòng)性極好。

1.3.2 片劑外觀

采用目測(cè)法直接對(duì)片劑進(jìn)行觀察評(píng)價(jià)，片劑應(yīng)色澤均勻，表面光潔，無(wú)碎粉。

1.3.3 片劑差異

采用稱量法，取20片靈芝孢子粉片，精確稱量每片質(zhì)量及總質(zhì)量，并計(jì)算平均片重。超出片重差異的不得多于2片，不得有1片超出限度的1倍。根據(jù)《中國(guó)藥典》規(guī)定，平均質(zhì)量超過(guò)0.3 g的片劑，質(zhì)量差異為±5%。

1.3.4 片劑硬度

為了便于試驗(yàn)的進(jìn)行及指標(biāo)的可評(píng)價(jià)性，采用兩種方式進(jìn)行硬度檢測(cè)。單因素試驗(yàn)：把制成的片劑從1 m高處自然掉落在2 cm厚的松木板上，碎片率不超過(guò)30%為合格[15]；響應(yīng)面分析：采用質(zhì)構(gòu)儀檢測(cè)片劑硬度。測(cè)試條件：SMSP/36R壓盤式探頭；測(cè)試模式，壓縮；位移距離3.000 mm；測(cè)試前速度1.00 mm/s；測(cè)試中速度0.30 mm/s；測(cè)試后速度10.00 mm/s；感應(yīng)力0.050 N；測(cè)定指標(biāo)，硬度。

1.3.5 片劑脆碎度

采用脆碎度檢測(cè)儀測(cè)定。測(cè)定條件：轉(zhuǎn)速25 r/min，轉(zhuǎn)動(dòng)100次。操作方法：取15片靈芝孢子粉片，用吹風(fēng)機(jī)吹去脫落的粉末，精密稱其質(zhì)量，置圓筒中轉(zhuǎn)動(dòng)100次后取出，同法除去粉末，精密稱其質(zhì)量，減少質(zhì)量不得大于1%，且不得檢出斷裂、龜裂及粉碎的片。

1.4 片劑綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)

以片劑外觀、片重差異、硬度和脆碎度為評(píng)分指標(biāo)，采用多指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)的方法進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[14,16]，相關(guān)指標(biāo)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

表2 片劑多指標(biāo)綜合評(píng)分表

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Designer-Expert.V8.0.6.0及Microsoft Office Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1.1 不同靈芝孢子粉添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響

物料的性質(zhì)關(guān)系到壓片過(guò)程的順利與否和片劑質(zhì)量的好壞。靈芝孢子粉富含油脂類物質(zhì)，表面張力較大，其流動(dòng)性和可壓性均比較差，不易進(jìn)行壓片。由表3可以看出，隨著靈芝孢子粉添加量的增加，物料的流動(dòng)性逐漸變差。片劑外觀也逐漸變得不光滑，并出現(xiàn)碎粉。片劑硬度也逐漸不符合要求，當(dāng)靈芝孢子粉添加量達(dá)到50%時(shí)，未能成片。結(jié)合片重差異性指標(biāo)，靈芝孢子粉的最佳添加量為30%。

表3 不同靈芝孢子粉添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響

2.1.2 不同吸油劑添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響

靈芝孢子粉中油脂類物質(zhì)含量較高，導(dǎo)致制粒時(shí)顆粒松散、流動(dòng)性差，壓片時(shí)會(huì)出現(xiàn)硬度不夠、難以成片的現(xiàn)象。為解決該問(wèn)題，選用具有吸附功能的輔料二氧化硅和β-環(huán)狀糊精作為吸油劑[17]，采用遞次混合預(yù)處理的方法吸附靈芝孢子粉中的油脂類物質(zhì)。由表4可以看出，隨著吸油劑添加量的增加，造粒后物料的流動(dòng)性逐漸增強(qiáng)，片劑的外觀、硬度及片重差異性均呈現(xiàn)一致的趨勢(shì)。綜合各個(gè)指標(biāo)，吸油劑的最佳添加量為20%。

表4 不同吸油劑添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響

2.1.3 不同玫瑰粉添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響

靈芝孢子粉中含有三萜類物質(zhì)，使其呈現(xiàn)出一種苦味[13]，這會(huì)影響靈芝孢子粉片劑的接受度。天然物質(zhì)玫瑰粉的加入可掩蓋靈芝孢子粉令人不悅的氣味，使片劑賦有淡淡的玫瑰花香。由表5可以看出，隨著玫瑰粉添加量的增加，物料流動(dòng)性逐漸增強(qiáng)，片劑的硬度也逐漸提高，片劑的表面逐漸變得光滑，但碎粉卻呈現(xiàn)由多到少再到多的變化，片重差異性則是添加量為10%時(shí)最佳。綜合各個(gè)指標(biāo)，玫瑰粉的最佳添加量為10%。

表5 不同玫瑰粉添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

為了篩選靈芝孢子粉片劑的最佳配方，以片劑綜合評(píng)定值Y為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。以靈芝孢子粉添加量A、吸油劑添加量B、玫瑰粉添加量C為因變量，以綜合評(píng)定值Y為響應(yīng)值建立方程，得到方程：Y=21.55-1.22A-0.32B+0.16C-1.24AB-0.68AC+0.17BC-2.18A2-2.19B2-3.67C2，該方程回歸系數(shù)R2=0.979 6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表7可以看出：模型的p＜0.000 1，說(shuō)明其具有極顯著性，回歸方程模型中失擬項(xiàng)p=0.062 9＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明得到的回歸模型比較理想，方程有極高可靠性；在試驗(yàn)的3個(gè)影響因素中，靈芝孢子粉添加量的單因素p值小于0.01，說(shuō)明對(duì)片劑綜合評(píng)定值的影響極顯著；相比較，靈芝孢子粉添加量與吸油劑添加量的交互作用對(duì)片劑綜合評(píng)定值也有顯著影響，但不如靈芝孢子粉添加量影響大；由F值可以看出，A、B、C三個(gè)因素對(duì)片劑綜合評(píng)定值的影響為A＞B＞C，即靈芝孢子粉添加量＞吸油劑添加量＞玫瑰粉添加量。

表7 方差分析結(jié)果

2.2.2 響應(yīng)面交互分析

三個(gè)因素的交互作用及其最佳工藝參數(shù)可以由響應(yīng)面的分析圖得出，如圖2~圖4所示。圖2為變量C取零時(shí)綜合評(píng)定值隨AB的變化圖。圖3為變量B取零時(shí)綜合評(píng)定值隨AC的變化圖。圖4為A取零時(shí)綜合評(píng)定值隨BC的變化圖。響應(yīng)面圖是由各個(gè)試驗(yàn)因素和響應(yīng)值Y構(gòu)成的三維空間圖，試驗(yàn)因素的交互作用強(qiáng)弱可以由等高線形狀看出，橢圓形等高線代表試驗(yàn)因素的交互作用影響顯著。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出靈芝孢子粉添加量與吸油劑添加量的交互作用影響顯著。

圖2 靈芝孢子粉添加量和吸油劑添加量對(duì)綜合評(píng)定值交互影響的響應(yīng)面與等高線

圖3 靈芝孢子粉添加量和玫瑰粉添加量對(duì)綜合評(píng)定值交互影響的響應(yīng)面與等高線

圖4 吸油劑添加量和玫瑰粉添加量對(duì)綜合評(píng)定值交互影響的響應(yīng)面與等高線

2.2.3 響應(yīng)面結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)

利用Design-Expert.V8.0.6.0軟件得到靈芝孢子粉片劑的最優(yōu)配方條件：靈芝孢子粉添加量27.09%、吸油劑添加量20.05%、玫瑰粉添加量10.25%，綜合評(píng)定值為21.73。考慮到實(shí)際操作的可行性，將最優(yōu)配方調(diào)整為靈芝孢子粉添加量27%、吸油劑添加量20%、玫瑰粉添加量10%，剩余由填充劑甘露糖醇補(bǔ)充。按此配方進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，綜合評(píng)定值的平均值為21.68，與預(yù)測(cè)值有較好擬合性，說(shuō)明響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)得到的靈芝孢子粉片配方具有實(shí)際參考價(jià)值。

3 討論

根據(jù)制備工藝的不同，可將壓片方法分為粉末直接壓片法、干法制粒壓片法及濕法制粒壓片法[18]。粉末直接壓片法要求物料具有良好的流動(dòng)性、可壓性及潤(rùn)滑性；干法制粒壓片法則需要較大壓力使物料達(dá)到所需要的密度，只適合特定的需要干法制粒的物料[19]。濕法制粒壓片法可有效改善物料的流動(dòng)性及可壓性，工藝比較成熟，重復(fù)性高，易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。結(jié)合靈芝孢子粉顆粒細(xì)小、質(zhì)地松軟、流動(dòng)性較差、富含油脂類物質(zhì)的物性學(xué)性質(zhì)，此次試驗(yàn)采用濕法制粒壓片法進(jìn)行壓片，大大提高了靈芝孢子粉的流動(dòng)性及可壓性。

片劑處方中輔料的選擇應(yīng)該結(jié)合主料的性質(zhì)特點(diǎn)，達(dá)到改善物料可壓性、流動(dòng)性的目的。靈芝孢子粉富含油性成分，制粒時(shí)會(huì)出現(xiàn)顆粒松散、流動(dòng)性差，壓片時(shí)會(huì)出現(xiàn)硬度不夠、難以成片的現(xiàn)象，因此需要選擇合適的輔料吸收油性成分后，再進(jìn)行造粒壓片[20]。二氧化硅是具有絮狀輕質(zhì)的白色粉末，具有很好的流動(dòng)性，在片劑生產(chǎn)中，常作為助流劑使用；β-環(huán)狀糊精具有特殊的穴狀分子結(jié)構(gòu)，可通過(guò)包合作用吸附油脂性物質(zhì)。此次試驗(yàn)采用遞次混合的方式首先將靈芝孢子粉與吸油劑（二氧化硅和β-環(huán)狀糊精）進(jìn)行混樣，對(duì)油脂性物質(zhì)進(jìn)行吸附，使造粒后靈芝孢子粉顆粒的流動(dòng)性增強(qiáng)，解決了靈芝孢子粉難以壓片成型的問(wèn)題。

靈芝孢子粉中含有三萜類物質(zhì)，使其呈現(xiàn)出一種苦味，這會(huì)影響靈芝孢子粉片劑的接受度。此次試驗(yàn)在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選天然物質(zhì)玫瑰粉作為復(fù)配材料，天然物質(zhì)玫瑰粉的加入可掩蓋靈芝孢子粉令人不悅的氣味，使片劑賦有淡淡的玫瑰花香，避免了矯味劑的添加，還增加了片劑的硬度，這可能是此次試驗(yàn)采用的玫瑰粉粒度比較小，填充了顆粒之間的空隙，進(jìn)而增加了片劑的硬度。

4 結(jié)論

在片劑處方確定的基礎(chǔ)上，分別考察靈芝孢子粉、吸油劑、玫瑰粉的添加量對(duì)片劑品質(zhì)的影響，以片劑外形、片重差異、硬度及脆碎度的綜合評(píng)定值為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)片劑配方進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，靈芝孢子粉片劑最佳配方為靈芝孢子粉添加量27%、吸油劑添加量20%（二氧化硅∶β-環(huán)狀糊精為1∶1）、玫瑰粉添加量10%、甘露糖醇添加量43%。在此條件下，靈芝孢子粉片劑的綜合評(píng)定值為21.68。片劑呈棕褐色，色澤均勻，表面光滑、完整，賦有玫瑰淡淡的花香，便于攜帶服用，發(fā)揮其增強(qiáng)人體免疫力的功效。該研究可為靈芝孢子粉片劑的生產(chǎn)提供一定的參考。