基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方對(duì)少弱精癥大鼠雌激素受體的影響

李新陽(yáng)， 孫自學(xué)

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.河南省中醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

目前，不孕不育已成為全球性的公共問(wèn)題，約有20%的育齡夫婦受其困擾，男性因素中的少弱精子癥既是男性不育的主要原因之一，也是諸多生殖健康機(jī)構(gòu)的重要研究課題[1]。少精子癥(Oligospermia)是指禁欲3～5 h后檢查精液，精子密度小于20×106/mL[2]；弱精子癥(Asthenospermia)則是指男性禁欲2～7 d后檢查精液，前向運(yùn)動(dòng)精子百分率<32%或(前向運(yùn)動(dòng)+非前向運(yùn)動(dòng))精子百分率<40%，且精子濃度<15×106/mL[3]，二者合稱少弱精子癥，是引起男性不育最常見(jiàn)的病因之一。男性精子生成障礙是環(huán)境因素和遺傳因素相互作用的結(jié)果，主要由生殖道感染、內(nèi)分泌激素紊亂、精索靜脈曲張、免疫異常及理化等復(fù)雜因素引起[4]。

《諸病源候論》曰：“丈夫無(wú)子者，其精清如水，冷如冰鐵，皆為無(wú)子之候”。因此，中醫(yī)認(rèn)為少弱精子癥與古籍中“精少”“精冷”“精清”類似，其主要病機(jī)多為腎中精氣受損，致腎陰、腎陽(yáng)平衡失調(diào)，從而形成陰陽(yáng)俱損的表現(xiàn)。病因由于先天不足、房勞過(guò)度、內(nèi)傷七情、飲食不節(jié)等，影響生殖功能，故本病治則多以滋陰補(bǔ)陽(yáng)、補(bǔ)腎填精為主。益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方，由菟絲子、淫羊藿、黃芪、黨參、枸杞子、川牛膝、熟地黃等藥物組成，是河南省中醫(yī)院孫自學(xué)教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)腎填精、健脾益氣、活血通絡(luò)之效。運(yùn)用中醫(yī)學(xué)“腎藏精，主生殖”“陰為體，陽(yáng)為用”理論，以該方治療少弱精子癥增強(qiáng)其補(bǔ)腎填精療效。方中菟絲子、淫羊藿具有補(bǔ)益腎陽(yáng)、固精縮尿之功效，黃芪、黨參則能固表補(bǔ)中益氣，枸杞子滋腎補(bǔ)肝，川牛膝逐瘀通絡(luò)，熟地黃滋陰補(bǔ)血，此為益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方中主要藥物。在現(xiàn)代藥理學(xué)研究中諸藥也具有抗氧化、抑制生精細(xì)胞凋亡等作用，這些對(duì)于精子的生成、成熟都具有重要意義[5]。為進(jìn)一步研究益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方的功效，本研究擬采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對(duì)接技術(shù)，從分子水平分析益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方中有效成分，預(yù)測(cè)其作用靶點(diǎn)及相關(guān)信號(hào)通路，并設(shè)計(jì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，以期能闡明益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精子癥的作用機(jī)制。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 藥物活性成分篩選及活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以“菟絲子”“淫羊藿”“枸杞子”“黃芪”“熟地黃”“黨參”“川牛膝”“白術(shù)”“陳皮”為關(guān)鍵詞，從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)[6](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)和中醫(yī)藥整合藥理學(xué)研究平臺(tái)[7](Integrative Pharmacology-based Research Platform of Traditional Chinese Medicine,TCMIP)中檢索上述9味藥材的化學(xué)成分，并以生物利用度(OB)≥30%、藥物相似度(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行活性成分篩選。

1.2 益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精癥相關(guān)靶點(diǎn)篩選 以關(guān)鍵詞“Oligospermia”“Asthenospermia”在PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.pharmgkb.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)中檢索，得到少弱精子癥相關(guān)靶點(diǎn)，并與活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，相同靶點(diǎn)即為益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精子癥潛在靶點(diǎn)。采用Cytoscape v3.7.2軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)-疾病可視化聯(lián)系。

1.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精子癥潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)進(jìn)行分析，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape v3.7.2軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)Degree值進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)分析。

1.4 基因本體論(GO)功能、京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路分析 使用R語(yǔ)言軟件3.6.3版程序包Cluster Profiler 3.1.2，對(duì)益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精子癥的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，設(shè)置閾值P<0.05，繪制柱狀圖與氣泡圖。

1.5 分子對(duì)接 根據(jù)“益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方-有效成分-靶點(diǎn)-少弱精癥”網(wǎng)絡(luò)與益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精癥潛在靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Degree值分析結(jié)果，KEGG富集分析結(jié)果結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)ESR1，即雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)為益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精癥的核心靶點(diǎn)(ERα在2個(gè)網(wǎng)絡(luò)中的Degree值分別為19、56)。將ERα對(duì)應(yīng)的活性成分根據(jù)Degree值，篩選出排名前三的活性分子分別為柚皮素(naringenin)、芒柄花黃素(formononetin)、川陳皮素(nobiletin)。

在PDB和PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中，分別獲取ERα的PDB格式文件和ERα原配體雷洛昔芬(raloxifene)、naringenin、formononetin、nobiletin的SDF文件，采用Pymol軟件對(duì)ERα蛋白去水、加氫后，利用Autodock Vina1.1.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接。以ERα與原配體的結(jié)合能為參考，將結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol作為活性成分配體與核心蛋白受體具有較好契合力的篩選標(biāo)準(zhǔn)[8]，結(jié)合能越低，結(jié)合活性越強(qiáng)，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。

2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.1 材料

2.1.1 藥物 菟絲子、枸杞子、熟地黃、淫羊藿、黃芪、黨參、炒白術(shù)、陳皮、川牛膝均由河南省中醫(yī)院中藥房提供，預(yù)先加水浸泡40 min，武火煎煮至沸騰，文火分別濃縮至5.6、2.8、1.4 g/mL，置于-4 ℃冰箱至保存。益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方臨床用量大致為菟絲子25 g、枸杞子15 g、熟地黃15 g、淫羊藿15 g、黃芪30 g、黨參15 g、炒白術(shù)15 g、陳皮12 g、川牛膝15 g，參照《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》換算，得到大鼠等效劑量為14.13 g/kg。

2.1.2 試劑 注射用環(huán)磷酰胺(批號(hào)9K344A，德國(guó)Baxter Oncology GmbH公司)；兔多抗ERα(批號(hào)Ab3575，英國(guó)Abcam公司)；兔多抗GAPDH(批號(hào)AB-P-R001，杭州賢至生物科技有限公司)；HRP標(biāo)記兔抗羊二抗(批號(hào)BST12H03A60)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(批號(hào)BST13L04A54)(武漢博士德生物工程有限公司)。

2.1.3 儀器 恒溫水浴箱(太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；AE160型精密天平秤[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；BX-51型生物顯微鏡(日本Olympus公司)；MK-3酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)；蛋白印跡電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

2.1.4 動(dòng)物 50只雄性SPF級(jí)健康成年SD大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(晉)2015-000。

2.2 方法

2.2.1 分組與造模 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取40只腹腔注射環(huán)磷酰胺35 mg/kg，連續(xù)5 d，建立少弱精癥大鼠模型；剩余10只腹腔注射等量生理鹽水，作為空白組。造模大鼠再隨機(jī)分為模型組及益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方高、中、低劑量組，每組10只。

2.2.2 給藥 空白組大鼠第6天開(kāi)始，連續(xù)2周灌胃給予生理鹽水；模型組大鼠造模成功后，第6天開(kāi)始連續(xù)2周灌胃給予生理鹽水；益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方高、中、低劑量組造模成功后，第6天開(kāi)始連續(xù)2周分別灌胃給予益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方28、14、7 g/kg(相當(dāng)于臨床劑量的2、1、0.5倍)。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 睪丸、附睪臟器指數(shù) 末次給藥12 h后，測(cè)定各組大鼠體質(zhì)量，腹腔注射水合氯醛麻醉，取雙側(cè)睪丸、附睪，迅速稱定質(zhì)量，同只大鼠臟器質(zhì)量取雙側(cè)平均值，臟器指數(shù)=(臟器質(zhì)量/體質(zhì)量)×100%。

2.3.2 精液質(zhì)量 末次給藥12 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉，取附睪，置于3 mL、37 ℃生理鹽水中，組織剪剪碎，靜置1 min后37 ℃恒溫水浴5 min，輕輕搖晃使精子充分游出與生理鹽水混勻，采用GDYN-SCA型全自動(dòng)精子質(zhì)量分析系統(tǒng)分析精子濃度與活力。

2.3.3 Western blot檢測(cè)睪丸ERα蛋白表達(dá) 提取睪丸組織總蛋白，在-20 ℃下保存，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD值計(jì)算直線回歸方程，計(jì)算樣品蛋白濃度，經(jīng)制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫?fù)u床封閉2 h，加入ERα(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，清洗后加入二抗(1∶50 000)，37 ℃搖床孵育2 h，清洗多余二抗，ECL顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

3.1.1 成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò) 從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)OB與DL共篩選得到益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方有效成分120個(gè)，見(jiàn)圖1。在PharmGkb、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中共篩選得到413個(gè)少弱精癥靶點(diǎn)，與有效成分對(duì)應(yīng)的257個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，得到17個(gè)益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精子癥的潛在靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape軟件將“益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”進(jìn)行可視化，見(jiàn)圖2～3。

圖1 “中藥-有效成分”網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 “益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方-有效成分-靶點(diǎn)-少弱精子癥”網(wǎng)絡(luò)圖

3.1.2 靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將17個(gè)潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)分析，并保存結(jié)果為tsv格式，再將其導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，網(wǎng)絡(luò)圖靶點(diǎn)中面積越大，Degree值越大，即為在網(wǎng)絡(luò)中為關(guān)鍵靶點(diǎn)，見(jiàn)圖4。

圖3 “益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方-少弱精子癥”共同靶點(diǎn)交集圖

圖4 益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精子癥潛在靶點(diǎn)蛋白互作圖

3.1.3 GO功能注釋分析及KEGG富集分析 GO功能注釋分析結(jié)果顯示，潛在靶點(diǎn)共富集出1 002個(gè)條目，涉及生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)三個(gè)方面，見(jiàn)圖5。KEGG富集分析結(jié)果共得到37條通路，見(jiàn)圖6，包含雌激素信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、p53信號(hào)通路等。

圖5 GO功能注釋分析(前10個(gè)條目)

圖6 KEGG富集分析(前30條通路)

3.1.4 分子對(duì)接 ERα蛋白與其原配體Raloxifene的結(jié)合能為-11.8 kJ/mol，naringenin、formononetin、nobiletin與ERα蛋白的結(jié)合能分別為-8.4、-7.1、-6.3 kJ/mol，均具有較好契合力，見(jiàn)圖7～8。

注：左側(cè)為局部圖，右側(cè)為整體圖。

注：左側(cè)為局部圖，右側(cè)為整體圖。

3.2 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

3.2.1 睪丸、附睪臟器指數(shù) 與空白組比較，模型組大鼠睪丸、附睪臟器指數(shù)降低(P<0.01)；與模型組比較，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方低劑量組大鼠睪丸、附睪指數(shù)無(wú)明顯變化(P>0.05)，而中、高劑量組均升高(P<0.05，P<0.01)，以高劑量組更明顯(P<0.01)，見(jiàn)圖9。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2.2 精子濃度與活力 與空白組比較，模型組大鼠精子濃度與活力均下降(P<0.01)；與模型組比較，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方低、中、高劑量組大鼠精子濃度與活力均升高(P<0.05，P<0.01)，以中、高劑量組更為顯著(P<0.01)，見(jiàn)圖10。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3.2.3 睪丸組織ERα蛋白表達(dá) 與空白組比較，模型組大鼠ERα蛋白表達(dá)降低(P<0.01)；與模型組比較，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方低、中、高劑量組大鼠ERα蛋白表達(dá)均升高(P<0.01)，見(jiàn)圖11～12。

圖11 各組大鼠睪丸ERα蛋白表達(dá)(電泳圖)

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。

4 討論

少弱精子癥已成為目前男性不育的關(guān)注焦點(diǎn)，但其具體病理機(jī)制尚未明確。近50%的不孕不育夫婦檢查后發(fā)現(xiàn)男性精液參數(shù)存在異常，其中少弱精子癥就占75%[9]。隨著不育男性逐漸增加，嚴(yán)重影響患者的身心健康以及和伴侶的家庭和諧。

中醫(yī)認(rèn)為少弱精子癥是以腎精虧虛為本，夾雜濕熱、血瘀、痰濁、氣滯等，本標(biāo)結(jié)合則為該病的基本病機(jī)。益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方由河南省中醫(yī)院內(nèi)制劑，主要用于補(bǔ)腎填精、健脾益氣、活血通絡(luò)，方中主要藥物菟絲子、淫羊藿、黃芪、黨參、枸杞子、川牛膝、熟地黃都是中藥復(fù)方中的常用經(jīng)典藥物，臨床也應(yīng)用廣泛。研究發(fā)現(xiàn)，含有菟絲子、淫羊藿、枸杞子等藥物的黃精贊育膠囊可明顯改善少弱精子癥大鼠睪丸組織形態(tài)，提高精子活力和數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)性腺軸功能恢復(fù)[10]；由李曰慶教授研制含有菟絲子-枸杞子藥對(duì)的補(bǔ)腎生精丸對(duì)腺嘌呤損傷造成的生精損傷大鼠生精細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制是通過(guò)抗氧化作用增強(qiáng)超氧化物歧化酶(SOD)活性、降低一氧化氮合酶(NOS)活性；影響一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)水平，同時(shí)也可抑制細(xì)胞凋亡[11-12]；淫羊藿育寶湯以淫羊藿為君藥采用以補(bǔ)腎溫陽(yáng)法可有效改善腎陽(yáng)虧虛型男性不育患者精液異常狀況，從而提升其授孕能力[13]；黃芪注射液也可通過(guò)ER發(fā)揮療效[14]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)腎同時(shí)給以活血化瘀藥物對(duì)少弱精子癥也存在一定療效[15]。

經(jīng)過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理方法篩選并結(jié)合大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，與益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方有效靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)度最高的是雌激素信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路、p53信號(hào)通路。研究顯示，雌激素在男性生殖中發(fā)揮重要作用，且睪丸和精液中含量很高，其受體廣泛分布于男性生殖系統(tǒng)睪丸、前列腺等器官中[16]。ERα在雄性生殖系統(tǒng)中的作用逐漸受到關(guān)注，其可通過(guò)配體依賴和非依賴途徑對(duì)雄性生殖功能起重要調(diào)節(jié)作用，可影響精子的發(fā)生和成熟[17]。研究發(fā)現(xiàn)，ERα敲除(ERαKO)小鼠模型附睪尾部出現(xiàn)明顯精子數(shù)量減少，運(yùn)動(dòng)活性降低等表現(xiàn)[18]。通過(guò)敲除成年雄性小鼠ERα基因后發(fā)現(xiàn)，該基因敲除小鼠睪丸發(fā)生萎縮，精子形態(tài)明顯異常且數(shù)目減少、并且生殖能力下降，最終導(dǎo)致不育現(xiàn)象[19]。雌激素作為生殖系統(tǒng)疾病關(guān)鍵激素，其相關(guān)受體ERα對(duì)于男性不育中少弱精子癥也存在重要影響。

通過(guò)GO富集分析得出，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方中有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的生物過(guò)程及分子功能中，數(shù)目最多為小分子代謝過(guò)程的調(diào)控、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)類固醇激素的反應(yīng)。其中氧化應(yīng)激會(huì)引起類固醇合成相關(guān)酶的活性下降，從而對(duì)生殖重要激素——睪酮的合成和代謝產(chǎn)生影響；且睪丸氧化應(yīng)激損傷同樣會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡[20]。這些靶點(diǎn)均能對(duì)生殖相關(guān)性腺激素睪酮起調(diào)節(jié)作用，證實(shí)益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方對(duì)治療男性不育相關(guān)疾病少弱精子癥存在一定療效。

經(jīng)上述研究并結(jié)合分子對(duì)接結(jié)果顯示，ERα為益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方治療少弱精癥的核心靶點(diǎn)。方中活性成分柚皮素、芒柄花黃素、川陳皮素與ERα蛋白均具有較好契合力，結(jié)合活性強(qiáng)且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

為進(jìn)一步驗(yàn)證益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方對(duì)少弱精子癥作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)研究益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方對(duì)少弱精子癥大鼠睪丸、附睪臟器指數(shù)，精子濃度與活力，睪丸組織ERα蛋白表達(dá)的調(diào)控作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方中、高劑量組睪丸指數(shù)、附睪指數(shù)、精子濃度與活力表達(dá)均呈升高趨勢(shì)，且以益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方高劑量組顯著，并且益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方低、中、高劑量組還可增高ERα蛋白表達(dá)。由此推測(cè)，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方可通過(guò)調(diào)控ERα表達(dá)達(dá)到改善精液質(zhì)量的目的，對(duì)少弱精子癥具有治療效果。

綜上，益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方對(duì)少弱精子癥具有明確的作用效果。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，研究益腎通絡(luò)補(bǔ)氣方對(duì)少弱精子癥的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制，為中藥復(fù)方治療少弱精子癥機(jī)制研究提供了方法借鑒，也對(duì)臨床運(yùn)用中藥復(fù)方治療少弱精子癥提供重要理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。