振動脅迫對雙孢菇褐變與抗氧化能力的影響

陳代良，陳杭君，劉瑞玲，韓延超，吳偉杰，郜海燕

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室，杭州 310021）

0 引 言

雙孢菇（Agaricus bisporus）又稱白蘑菇，是世界上種植最廣泛的食用菌，富含維生素B3、煙酸、葉酸、礦物元素等營養(yǎng)成分，風味獨特且具有較強的抗氧化性，為低脂、低熱量、高蛋白的健康食物。然而，雙孢菇子實體含水率高，采后貯藏與運輸過程中呼吸作用旺盛，極易失水萎蔫；其外表面沒有顯著的保護組織，極易受到機械損傷，導致子實體褐變直至腐爛變質(zhì)，最終降低雙孢菇的食用品質(zhì)和商品價值[1]。

隨著中國果蔬電商物流產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，雙孢菇在國內(nèi)遠距離運輸銷售的需求快速增長，其物流形式主要是汽車公路運輸。通常認為運輸過程中的振動脅迫是造成果蔬機械損傷的主要原因[2-3]，振動脅迫不僅影響果蔬外觀，也會影響其貯藏品質(zhì)[4-5]。目前，研究振動脅迫對果蔬的影響主要通過模擬運輸技術實現(xiàn)。例如，肖越等[6]在4 Hz條件下對巨峰葡萄（Vitis viniferaL.）進行5 min的模擬運輸振動試驗發(fā)現(xiàn)與未振動處理組相比，無包裝振動處理的葡萄內(nèi)部損傷較為嚴重，口感下降；周然等[7]通過模擬車輛運輸技術發(fā)現(xiàn)振動頻率為2～5 Hz時會在運輸過程中產(chǎn)生較高的振動能量。

振動時間、振動頻率以及振動加速度是運輸過程中影響果蔬品質(zhì)的主要因素，其中振動時間影響較為直接，與運輸距離呈正相關，振動時間越長，果蔬間相互摩擦碰撞的次數(shù)越多，會對果蔬表皮組織造成即時損傷，這種損傷會逐步傳遞至果蔬內(nèi)部，造成延時損傷。盧立新等[8]模擬實際公路運輸，研究了振動脅迫對梨果實（Pyrusspp.）品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)運輸振動對梨果實的損傷隨時間的增加而增大。許時星等[9]通過對藍莓（Vacciniumspp.）進行模擬運輸振動發(fā)現(xiàn)，果實的衰老速度隨振動時間的增加而延長，振動時間越久，品質(zhì)劣變越快。本文研究了冷藏運輸條件下振動脅迫對雙孢菇貯藏品質(zhì)和抗氧化能力的影響，揭示抗氧化性與貯藏品質(zhì)的關系，并明確雙孢菇表皮的損傷情況，旨在為開發(fā)物流減震包裝技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

雙孢菇采自浙江省嘉善縣寧遠農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，品種為W192。在基地采收后即運往實驗室，在(2±1)℃、相對濕度90%～95%條件下放入冷庫預冷12 h，挑選菇形圓整、色澤潔白、未開傘、無機械損傷、菌蓋直徑35～40 mm的雙孢菇作為試驗材料。

1.2 儀器與設備

郵政4號標準泡沫箱（外部長度、寬度、高度分別為34 cm×22 cm×18 cm，內(nèi)部長度、寬度、高度分別為30 cm×18 cm×14 cm，壁厚2 cm，容量7.5 L），翼洋泡塑工廠；M/MN-100R型模擬運輸振動試驗臺，上海睦尼實驗設備有限公司；TA.XT.Plus物性測定儀，英國 Stable Micro Systems 公司；Thermo Biofuge startos型冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司；DK-8D恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；WFZ UV-2802型紫外分光光度計，UNICO（上海）儀器有限公司；ME103E電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CR-400手持色差儀，日本KONIC MINOLTA公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將運輸模擬振動試驗臺移至冷庫中，冷庫環(huán)境設置為（4±1）℃、相對濕度90%～95%。雙孢菇分為4組，每組5 kg樣品，用郵政4號標準泡沫箱盛放，由于汽車運輸振動頻率集中在2～5 Hz，本試驗振動試驗臺每分鐘振動200次（振動頻率3.33 Hz），以不做振動處理的雙孢菇為對照組，另3組同時置于振動臺開始振動，分別振動8、16和24 h后取下放在冷庫中貯藏，每3 d取一次樣，測量雙孢菇相關貯藏品質(zhì)指標，貯藏15 d，共取樣6次。

1.3.2 菌蓋色澤測定

使用色差儀在雙孢菇菌蓋部位隨機測定L*值、a值和b值并記錄，每個處理組測定5次。褐變指數(shù)（BI值：Browning Index）的計算方法[10]按照以下公式計算：

其中

ΔE表示與理想雙孢菇色澤（L*=97、a=－2、b=0）相比，雙孢菇顏色的變化程度，用以下公式進行計算。

式中L*為亮度值；a為紅綠色度值；b代表黃藍色度值。

1.3.3 細胞膜滲透率測定

參考曹建康等[11]的方法并有所改動。使用打孔器從雙孢菇菌蓋上挖取組織后，切成厚度為2 mm厚的均勻薄片，稱取該薄片2 g置于25 mL試管中，加入25 mL去離子水，在搖床上震蕩30 min后，用電導率儀測定溶液電導率，記為P1（μs/cm）；再放入水浴鍋煮沸10 min，加水到原刻度并冷卻至室溫，測定溶液電導率，記為P2（μs/cm）；測定去離子水電導率，記為P0（μs/cm）。按（4）式計算相對電導率P，表示果肉膜透性。

1.3.4 總酚含量測定

參考曹建康等[11]的方法。稱取2 g菇肉，加入少許預冷后體積分數(shù)為1%的HCl-甲醇溶液，在冰浴條件下研磨勻漿后，轉(zhuǎn)入20 mL刻度試管中，于4 ℃避光提取20 min，收集濾液，波長280 nm處測定溶液的吸光度值，對比吸光度（Y1）與沒食子酸濃度（X1,μmol/g）的標準曲線：Y1=0.8734X1+0.013 4，R2=0.999 9，計算出每克果蔬組織的總酚含量（μmol/g）。

1.3.5 維生素C含量測定

參考曹建康等[11]的分光光度計法并有所改動。反應體系為1 mL提取液和1 mL濃度為50g /L的三氯乙酸溶液，測定并記錄該體系在534 nm處的吸光度值，對照吸光度（Y2）與維生素C含量（X2,μg）的標準曲線：Y2=0.0098X2+ 0.027 6，R2=0.998 0，計算雙孢菇中維生素C含量，以100 g鮮樣所含的維生素C質(zhì)量表示（mg/100 g）。

1.3.6 谷胱甘肽含量測定

參考曹建康等[11]的方法并有所改動。反應體系為1 mL上清液、1 mL pH值 7.7的磷酸緩沖液和0.5 mL 4 mmol/L二硫代硝基苯甲酸溶液，在25 ℃條件下保溫反應10 min，測定其在波長412 nm處的吸光度，對照吸光度（Y3）與谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量（X3,μmol）的標準曲線：Y3=39.346X3-0.1201，R2=0.999 7，計算出谷胱甘肽的含量（μmol/g）。

1.3.7 相關酶活性測定

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase, PPO）和過氧化物酶（Peroxidase, POD）活性的測定參照姜愛麗等[12]的方法；過氧化氫酶（Catalase, CAT）的測定參考曹建康等[11]的方法；谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase, GR）的測定方法參考Foyer等[13]的方法；抗壞血酸還原酶（Ascorbate peroxidase, APX）活性的測定參考Wang等[14]的方法，以上酶活測定分別以每克樣品每分鐘在相應波長下吸光值變化為1個酶活單位，結(jié)果以U/（g·min）表示。超氧化物歧化酶（Superoxidase dismutase, SOD）的測定參考Tang等[15]的方法，以每分鐘每克鮮重果蔬組織的反應體系對氮藍四唑光化還原的抑制為50%時為一個SOD活性單位，結(jié)果表示為U/（g·min）。

1.3.8 DPPH自由基清除率測定

DPPH自由基清除率的測定方法參照Wang等[16]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism8軟件制圖。采用 IBM SPSS statistics 20對數(shù)據(jù)進行分析，使用單因素方差分析法進行數(shù)據(jù)顯著性分析，P＜0.05 表示差異顯著；使用Pearson法進行數(shù)據(jù)相關性分析，所有數(shù)值均為3次平行測定的算術平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 振動時間對雙孢菇表皮損傷及色澤的影響

由圖1可知，貯藏3 d后，未進行振動處理的對照組雙孢菇表皮上未發(fā)現(xiàn)明顯的機械損傷，振動8 h處理組表皮出現(xiàn)輕微的摩擦褐變現(xiàn)象，振動處理16 h出現(xiàn)的局部摩擦褐變面積更大且褐變程度更深，振動處理24 h組的機械損傷范圍最大并且褐變程度最深，說明振動處理時間越長對雙孢菇造成的機械損傷越大。

雙孢菇的色澤是影響消費者接受度的重要屬性之一[17]，一般認為，亮度值L*在80以上的雙孢菇會被絕大多數(shù)消費者接受[18]。由圖2a可以看出，隨著貯藏時間的增加雙孢菇L*值減小，對照組的L*值下降速度小于振動處理組。貯藏3 d后，振動處理24、16和8 h的雙孢菇L*值由初始時91.76急劇下降至82.15，85.90和85.30，而對照組雙孢菇L*值則由初始時91.76緩慢下降至90.64，變化較為平緩。

BI值表示雙孢菇表面的褐變程度，從圖2b可以看出，經(jīng)過振動處理的雙孢菇色澤均隨貯藏時間的增加褐變程度加大，并且振動處理組的BI值都高于對照組，振動時間越長，褐變程度越大，貯藏15 d后，振動24 h組的BI值為38.07，對照組的褐變指數(shù)為24.87，振動24 h組的BI值是對照組的1.53倍。

ΔE值表示雙孢菇色澤與理想色澤變化程度，雙孢菇ΔE值越高，褐變程度越大。由圖2c可知，對照組的ΔE值始終比處理組低（P＜0.05），貯藏15 d后，對照組與振動處理8、16、24 h組的的ΔE值分別是：20.80、22.63、24.48和32.69，其中振動處理24 h組是對照組的ΔE值的1.57倍。

L*值和ΔE值的變化均表現(xiàn)出和BI值一致的結(jié)果，貯藏和振動處理時間越長，雙孢菇的亮度越低，色澤變化越大，說明振動脅迫促進雙孢菇表面色澤褐變，且振動處理時間越長表面褐變程度越高。

2.2 振動時間對細胞膜滲透率的影響

細胞膜能夠維持細胞的微環(huán)境和正常代謝，膜透性的增加會導致細胞電解質(zhì)外滲，細胞膜透性與膜的完整程度呈負相關[19]。由圖3可知，貯藏過程中對照組和振動處理組細胞膜滲透率均呈上升趨勢，振動時間越長細胞膜滲透率上升越快，其中振動處理組與對照組差異顯著（P＜0.05），說明振動脅迫促進膜系統(tǒng)的破壞，加劇了細胞電解質(zhì)外滲。

2.3 振動時間對非酶抗氧化物質(zhì)含量的影響

酚類物質(zhì)對雙孢菇的采后品質(zhì)主要有兩方面的影響，一是作為重要的抗氧化物質(zhì)，能夠清除自由基，增強果蔬抗氧化功能[20]，再者是作為底物參與雙孢菇的酶促褐變反應[21]。圖4a結(jié)果表明，雙孢菇總酚含量隨貯藏時間延長呈下降趨勢，振動處理時間越長總酚含量下降越快，振動處理6 d，對照組與振動處理8、16、24 h組的總酚含量分別為3.17、3.02、2.87和2.86μmol/g；當雙孢菇貯藏到第15天時，對照組的總酚含量分別是振動處理8、16、24 h組的1.19倍、1.23倍和1.51倍，振動處理組與對照組存在顯著差異（P＜0.05），說明振動脅迫增加了酚類物質(zhì)的消耗，降低了雙孢菇的抗氧化性。

抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，與其他活性氧清除系統(tǒng)共同作用，清除體內(nèi)的活性氧自由基，谷胱甘肽可將脫氫抗壞血酸還原生成維生素C，維生素C能夠清除H2O2[22]，是重要的非酶抗氧化物質(zhì)。圖4b顯示，最初維生素C含量為5.32 mg/100 g，振動處理并貯藏15 d后，對照組、振動處理8、16、24 h組的抗壞血酸含量分別降為2.45、2.25、2.00和1.82 mg/100 g，對照組與振動處理組維生素C含量差異顯著（P＜0.05）。由圖4c可知，貯藏15 d后對照組和振動處理8、16、24 h組GSH含量由試驗最初的7.00μmol/g，分別降至2.48、2.20、1.81和1.30μmol/g，其中對照組與貯藏16、24 h組差異顯著（P＜0.05）。試驗研究結(jié)果表明振動處理會加速維生素C和GSH這類非酶抗氧化物質(zhì)的消耗，并且振動處理時間越長含量越低，這與李洋等[19]研究振動脅迫對藍莓品質(zhì)的影響得到的結(jié)果是一致的。

2.4 振動時間對抗氧化酶活性的影響

2.4.1 振動時間對PPO和POD的影響

多酚氧化酶可以使單酚羥基轉(zhuǎn)化為鄰苯二酚，也可以催化鄰苯二酚氧化成為醌類物質(zhì)，這種醌類物質(zhì)不穩(wěn)定，容易進一步形成黑色素，是雙孢菇酶促褐變和品質(zhì)劣變的主要原因之一[23]。如圖5a所示，隨著貯藏時間的延長，雙孢菇PPO活力逐漸增強，貯藏6 d，對照組和振動處理8、16、24 h組PPO酶活分別為5.15、6.21、6.58和7.54 U/(g·min)，對照組PPO酶活顯著低于其他各振動處理組（P＜ 0.05），且增長速度較為平緩，這說明振動脅迫使PPO酶活加大，振動處理時間越長，PPO酶活上升越快。

POD既能清除過氧化氫和脂類氫過氧化物，在活性氧代謝系統(tǒng)中起重要作用；也能催化類黃酮、酚類物質(zhì)的氧化和聚合，導致組織褐變[24]。由圖5b可以看出，各組POD酶活都在貯藏3 d后到達峰值，總體趨勢為先上升后下降，相對來講，振動處理組POD酶活上升更加急劇，下降也更快，對照組的POD酶活變化則比較平緩，在貯藏到第9天以后，對照組POD酶活大于振動處理組（P＜0.05）。

2.4.2 振動時間對SOD和CAT的影響

SOD和CAT是果蔬衰老過程中的保護酶，通過清除細胞內(nèi)活性氧而增強細胞抗氧化性[25]，SOD將超氧陰離子分解為H2O2，再進一步由CAT將H2O2分解為水和氧氣[26]。圖6a顯示，各組雙孢菇在貯藏期間SOD活性先增加后降低。對照組處理的SOD活性變化較為平緩，振動處理組前期活性較高，可能是因為振動脅迫刺激了雙孢菇的抗逆反應，增高了SOD活性，貯藏3 d后振動處理組SOD酶活迅速下降，9 d后低于對照組SOD酶活（P＜0.05）；如圖6b所示，各組雙孢菇CAT活性在貯藏期間呈下降趨勢，對照組CAT酶活始終高于振動處理組（P＜0.05），且振動處理時間越長CAT活性下降越快。

2.4.3 振動時間對GR和APX的影響

谷胱甘肽還原酶（GR）和抗壞血酸還原酶（APX）是抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)中的重要組成部分，GR能將氧化型谷胱甘肽還原成GSH，而GSH在APX的作用下將脫氫抗壞血酸還原成還原性抗壞血酸[27]。由圖7a可知，各組雙孢菇在貯藏期間GR酶活逐漸降低，其中對照組GR酶活始終高于振動處理組（P＜0.05），且振動處理越久，GR酶活下降越快，貯藏15 d，對照組GR酶活是振動24 h組的2.37倍。由圖7b可知，APX酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，振動處理組在第3天到達峰值，而對照組在第6天才到達峰值，說明振動脅迫促進了雙孢菇APX酶活峰值提前到來，第6天之后，對照組APX酶活始終高于振動處理組（P＜0.05）。

2.5 振動時間對DPPH自由基清除率的影響

雙孢菇采后衰老與活性氧的代謝平衡密切相關。植物代謝過程會產(chǎn)生自由基，引起生物大分子物質(zhì)的氧化損傷，同時自由基的積累會損傷組織細胞膜，引起代謝紊亂[28]。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，廣泛用于測定抗氧化劑清除自由基的能力[29]。由圖8可以看出，雙孢菇DPPH自由基清除能力隨振動處理時間增加而降低，貯藏15 d，對照組和振動處理8、16、24 h組的DPPH清除率分別是82.39%、81.34%、80.36%和79.86%，振動處理24 h組與對照組差異顯著（P＜0.05）。

2.6 不同振動時間雙孢菇貯藏期間不同指標間的相關性分析

由表1數(shù)據(jù)可知，雙孢菇褐變指標、抗氧化相關酶指標和非酶抗氧化物質(zhì)相互間大部分呈高度相關（P＜0.01），表明雙孢菇的褐變程度與抗氧化性密切相關，抗氧化能力越強則褐變程度越低，其中維生素C、GSH含量與L*值、BI值以及ΔE值均呈極顯著相關（P＜0.01），說明維生素C和GSH含量是雙孢菇受振動脅迫后褐變的關鍵指標。PPO、CAT、SOD、GR酶活與BI呈顯著或極顯著相關，其中POD和APX主要在貯藏中期發(fā)揮抗氧化作用，在貯藏前期和后期的抗氧化能力較弱，因此其酶活呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而褐變相關指標都呈現(xiàn)為單調(diào)下降或上升的趨勢，造成POD、APX與褐變指標相關性不顯著。

表1 振動脅迫對雙孢菇貯藏品質(zhì)影響的相關性分析Table 1 Correlation analysis of effects of vibration stress on storage quality of Agaricus bisporus

3 討 論

雙孢菇菌蓋顏色變化在采后主要表現(xiàn)為褐變，是影響其品質(zhì)最大且最為直觀的指標之一，細胞膜滲透率通過電解質(zhì)外滲程度反映組織的衰老程度[30]。本試驗結(jié)果顯示，雙孢菇在振動處理后菌蓋表面迅速褐變，之后變化較為平緩，說明振動脅迫對雙孢菇褐變影響較大，原因是其外表保護層較為脆弱，模擬運輸過程中菇體之間發(fā)生摩擦，造成表皮機械損傷，引起受傷組織周圍的細胞產(chǎn)生更多酚類[21]，增加的酚類物質(zhì)可參與組織的愈傷過程，同時也在多酚氧化酶的作用下生成黑色物質(zhì)。另外觀察發(fā)現(xiàn)，振動導致了雙孢菇外表皮較嚴重的機械損傷，這個結(jié)果啟示我們可以通過增加緩沖包裝減少機械損傷，從而提高雙孢菇的品質(zhì)。

總酚、維生素C和GSH是植物體內(nèi)重要的非酶抗氧化物質(zhì)，本試驗中含量均隨貯藏時間增加而下降，維生素C變化趨勢與許時星等[9]研究振動脅迫對藍莓貯藏品質(zhì)時的結(jié)果一致，但藍莓中總酚含量先升后降，與本試驗結(jié)果有所不同，推測原因是藍莓尚未達到后熟階段，前期總酚含量上升，而本試驗雙孢菇已接近后熟，因此沒有出現(xiàn)前期總酚含量上升的情況，這與陶菲[31]的研究結(jié)果一致。

SOD、CAT、GR和APX都是抗氧化酶。本試驗中SOD和APX酶活呈先上升后下降的趨勢，這與謝丹丹[32]研究振動脅迫對獼猴桃生理品質(zhì)的影響結(jié)果一致，貯藏一段時間后，對照組酶活大于振動處理組，而振動處理組貯藏前期酶活峰值大于對照組是雙孢菇應對外界脅迫的一種逆境反應。GR和CAT酶活變化呈總體下降趨勢，且對照組的酶活始終大于振動處理組，說明振動脅迫降低了雙孢菇的抗氧化性能，這點也通過DPPH自由基清除率的變化趨勢表現(xiàn)出來。

對上述指標進行相關性分析，結(jié)果顯示大多數(shù)褐變指標與抗氧化指標呈極顯著相關，推測雙孢菇在振動脅迫的逆境條件下，由于機械損傷或者振動本身導致其原本的活性清除機制平衡被打破。SOD、APX等抗氧化酶在一段時間內(nèi)為應對逆境活性升高，以清除由于振動脅迫出現(xiàn)過多的自由基；CAT、GR等抗氧化酶則表現(xiàn)為活性降低，從而引起自由基的積累和膜脂過氧化，膜系統(tǒng)被破壞，各個系統(tǒng)之間相對獨立的狀態(tài)被打破；PPO與酚類物質(zhì)相結(jié)合，產(chǎn)生黑色物質(zhì)，引起雙孢菇褐變，最終影響營養(yǎng)和商品價值。事實上，許多抗氧化物質(zhì)直接參與雙孢菇的褐變進程，例如維生素C作為一種強還原劑，既是一種抗氧化物質(zhì)也可以用作護色劑；POD既能夠作為抗氧化酶清除過氧化氫，也能夠催化類黃酮和酚類物質(zhì)生成黑色物質(zhì)。

4 結(jié) 論

1）本試驗研究了不同振動時間對雙孢菇貯藏品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示振動脅迫對雙孢菇采后采后的損傷是逐漸累積的，振動時間越久貯藏品質(zhì)劣變越快，應當將運輸時間控制在合理范圍內(nèi)，避免運輸時間過長。

2）分析不同振動時間對雙孢菇表皮損傷情況發(fā)現(xiàn)，運輸振動會對雙孢菇表皮造成機械損傷，振動時間越長，菇蓋表皮摩擦機械損傷越大且褐變程度越深，應當采取措施減少固體之間的摩擦，減少運輸過程中的機械損傷。

3）通過分析各個指標間的相關性，發(fā)現(xiàn)雙孢菇的褐變程度與非酶抗氧化物質(zhì)含量（維生素C、GSH、總酚）、抗氧化酶活性（PPO、SOD、CAT和GR）以及DPPH自由基清除率等抗氧化指標密切相關，抗氧化能力下降越快，則其褐變程度越深，這表明可以通過維持雙孢菇的抗氧化能力從而保持貯運品質(zhì)。

綜上所述，雙孢菇實際運輸過程中，應當避免運輸時間過長的情況，減少菇體受到的機械損傷，并通過技術手段維持其抗氧化系統(tǒng)正常運轉(zhuǎn)，如采用低溫冷藏運輸或者使用緩沖包裝減少運輸途中菇體的相互碰撞，減緩采后衰老并降低機械損傷，從而保持雙孢菇的貯運品質(zhì)。