自噬相關(guān)基因Beclin1、LC3在妊娠期糖尿病患者胎盤組織表達(dá)及臨床意義

王洪偉，關(guān)紅瓊，王茹，黃曉妹

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是常見的妊娠期并發(fā)癥，隨著人們飲食、生活習(xí)慣的改變，GDM發(fā)病率有上升的趨勢[1]。GDM不僅增加了孕婦發(fā)生不良妊娠結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)也增加了孕婦妊娠后2型糖尿病和心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2]。因此，研究與GDM發(fā)生有關(guān)機(jī)制具有重要的意義。自噬廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，是細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑，參與細(xì)胞生長分化、廢物清除及結(jié)構(gòu)重建等多種生理過程。自噬失調(diào)與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，研究表明，高糖水平可增強(qiáng)絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬[3]。Beclin1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain3，LC3)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因[4-5]，現(xiàn)檢測GDM患者胎盤組織Beclin1、LC3表達(dá)水平，并分析二者與GDM患者一般資料之間的關(guān)系，探討自噬在GDM發(fā)病機(jī)制中的可能作用，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年4月—2021年2月在海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)的GDM患者95例為研究對象(GDM組)，年齡23～37(29.84±3.58)歲，孕周36～40(38.17±1.83)周。同期選取在醫(yī)院行剖宮產(chǎn)的正常妊娠孕婦95例為對照組，年齡21～38(29.27±4.31)歲，孕周36～41(38.62±2.01)周。2組孕婦均為單胎妊娠，年齡及孕周比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：[2019]倫審核第13號(hào))，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) GDM患者參照“妊娠合并糖尿病診治指南(2014)”[6]中關(guān)于GDM診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕前無糖尿病，妊娠期為首次診斷；②既往無不良妊娠史；③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并腎病等其他妊娠期并發(fā)癥；②患有自身免疫性疾??；③合并甲狀腺、垂體等內(nèi)分泌疾病。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 臨床資料收集：收集2組孕婦體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)水平，以及分娩時(shí)新生兒體質(zhì)量等資料。

1.3.2 胎盤樣本處理：孕婦分娩后30 min內(nèi)獲取胎盤組織，稱取胎盤質(zhì)量。取胎盤母體面中央組織2 cm×2 cm×2 cm組織塊，生理鹽水漂洗，留取一部分保存至-80 ℃冰箱，其余用4%多聚甲醛固定12 h，梯度酒精脫水30 min，石蠟包埋。

1.3.3 胎盤組織中Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)檢測：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測，以RNA提取試劑盒(天根生化科技北京有限公司)對胎盤組織中RNA進(jìn)行提取，檢測RNA濃度，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性 95℃ 5 min，變性 95 ℃ 30 s，退火 60℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成，引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Beclin1、LC3 mRNA的相對表達(dá)量。

表1 胎盤組織中Beclin1、LC3 mRNA引物序列

1.3.4 胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)檢測：采用免疫組織化學(xué)法檢測，石蠟標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫蠟至水，PBS清洗，抗原修復(fù)，室溫封閉1 h。加入兔抗人Beclin1、LC3單抗(英國Abcam公司)，4 ℃孵育過夜，加入山羊抗人IgG二抗(英國Abcam公司)(稀釋比1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，加入DAB染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行染色，蘇木素復(fù)染，酸酒精短暫分化后，脫水、透明、封片。細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性。采用免疫反應(yīng)積分(IRS)法對染色結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分。陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：無陽性細(xì)胞 0分，占比<25%記1分，25%≤占比≤50%記2分，50%<占比≤75%記3分，占比>75%記4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色0分，淺黃色1分，黃褐色2分，棕褐色3分。IRS=陽性細(xì)胞百分比評(píng)分×陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分，以IRS≤3分為陰性，IRS>3分為陽性。

1.3.5 妊娠結(jié)局：記錄孕婦和胎兒健康狀況，如發(fā)生產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒等為不良妊娠結(jié)局。

2 結(jié) 果

2.1 2組臨床資料和不良妊娠結(jié)局比較 與對照組比較，GDM組年齡、孕周差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，BMI、FPG、FINS、胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發(fā)生率均顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 GDM組與對照組臨床資料和不良妊娠結(jié)局比較

2.2 2組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平比較 與對照組比較，GDM組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，見表3。

表3 GDM組與對照組胎盤組織Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平比較

2.3 2組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)比較 Beclin1、LC3均在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。與對照組比較，GDM組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)率均顯著升高(P<0.01)，見表4、圖1。

圖1 對照組與GDM組胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)比較(免疫組織化學(xué)染色，×200)

表4 GDM組與對照組胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白表達(dá)比較 [例(%)]

2.4 胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)在GDM患者不同臨床資料和不良妊娠結(jié)局中比較 Beclin1及LC3蛋白表達(dá)在GDM患者年齡、孕周、BMI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Beclin1及LC3蛋白陽性表達(dá)GDM患者FPG、FINS、胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發(fā)生率均高于Beclin1、LC3蛋白陰性表達(dá)GDM患者(P<0.05)，見表5。

表5 胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)在GDM患者不同臨床資料和不良妊娠結(jié)局中比較

2.5 Logistic回歸分析影響GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素 以GDM患者是否發(fā)生不良妊娠結(jié)局為因變量，排除年齡等混雜因素后，以胎盤組織Beclin1、LC3蛋白表達(dá)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果表明,胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)是GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素(P<0.01)，見表6。

表6 Logistic回歸分析影響GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素

3 討 論

GDM是指孕婦妊娠期間首次發(fā)生或出現(xiàn)糖尿病，影響GDM發(fā)生的危險(xiǎn)因素包括超重、肥胖、高齡、家族糖尿病史等[7]。正常妊娠過程中，母體會(huì)通過一系列的生理變化以滿足胎兒生長的需要，胰島素敏感性降低是重要的代謝適應(yīng)，在妊娠后期，孕婦處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，使血糖稍微升高，促進(jìn)葡萄糖通過胎盤運(yùn)輸，促進(jìn)胎兒的生長[8]。目前主要認(rèn)為胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致的糖耐量受損是引起GDM發(fā)生的主要原因[9-10]。本研究結(jié)果表明，GDM患者FPG、FINS均顯著高于正常妊娠孕婦。胎盤是母體與胎兒物質(zhì)交換的主要器官，GDM可導(dǎo)致胎盤細(xì)胞功能、血管發(fā)生異常，導(dǎo)致胎盤發(fā)生病理性變化，從而影響子宮內(nèi)胎兒的正常生長發(fā)育[11]。本研究結(jié)果表明，GDM患者胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及產(chǎn)后出血、羊水過多、胎兒窘迫、巨大兒發(fā)生率均顯著高于正常妊娠孕婦，提示GDM發(fā)生過程中胎盤形成異常，可能會(huì)導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，具體機(jī)制有待深入研究。

自噬是在缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化還原應(yīng)激等狀態(tài)下，維持細(xì)胞內(nèi)能量穩(wěn)態(tài)的過程，自噬失調(diào)與包括糖尿病在內(nèi)的代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[12]。Akcora等[13]研究表明，與正常妊娠孕婦比較，子癇前期孕婦自噬活性增加。Tu等[14]研究表明，抑制自噬能夠減輕糖尿病腎病大鼠的胰島素抵抗。Beclin1、LC3蛋白均是自噬的標(biāo)志性蛋白，Beclin1基因位于人染色體17q21，其編碼的Beclin1蛋白是自噬發(fā)生與調(diào)控的主要蛋白之一，其通過調(diào)節(jié)自噬前體的形成，引導(dǎo)相關(guān)蛋白定位于自噬體膜，其還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬與凋亡之間的平衡[15-16]。LC3定位于前自噬泡和自噬泡膜表面，與自噬體的形成有關(guān)，是表示自噬程度的特異性蛋白[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，GDM組胎盤組織中自噬基因Beclin1、LC3 mRNA表達(dá)水平及蛋白陽性表達(dá)率顯著高于對照組，且Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)GDM患者FPG、FINS水平高于陰性表達(dá)患者，提示自噬可能與GDM的發(fā)生有關(guān)，與Li等[18]研究結(jié)果相似，猜測是因?yàn)楦哐且种铺ケP血管生成，導(dǎo)致GDM患者胎盤組織缺血、缺氧，細(xì)胞中活性氧水平增加，激活自噬。正常自噬能夠維持細(xì)胞功能和組織結(jié)構(gòu)，而過度自噬會(huì)引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，引起胎盤發(fā)育異常，導(dǎo)致組織缺血、缺氧、營養(yǎng)缺乏，引發(fā)胎盤功能障礙，增加巨大兒等不良妊娠結(jié)局發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[19]。Li等[18]研究表明,GDM患者胎盤中白介素-6(IL-6)、IL-8等炎性因子及自噬相關(guān)基因7(ATG7)和Beclin1表達(dá)顯著升高，胎盤中炎性反應(yīng)和自噬的發(fā)生會(huì)增加新生兒感染的風(fēng)險(xiǎn)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GDM組胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)患者胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量及不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率均高于Beclin1、LC3蛋白陰性表達(dá)患者，提示自噬可能與胎盤異常生長及不良妊娠結(jié)局有關(guān)。Logistic回歸分析結(jié)果表明，胎盤組織Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)是GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素，原因可能是高糖水平可能引發(fā)胎盤的自噬，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局的發(fā)生，具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

綜上所述，GDM患者胎盤組織中自噬基因Beclin1、LC3表達(dá)顯著升高，胎盤組織中Beclin1、LC3蛋白陽性表達(dá)是GDM患者發(fā)生不良妊娠結(jié)局的危險(xiǎn)因素，自噬可能與GDM的發(fā)生及不良妊娠結(jié)局有關(guān)。由于本研究僅從臨床水平上分析了胎盤組織中Beclin1、LC3的表達(dá)情況，下一步還需結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討自噬在GDM發(fā)生發(fā)展中的可能機(jī)制。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王洪偉：設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，論文撰寫；關(guān)紅瓊：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；王茹：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；黃曉妹：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析