結(jié)腸癌患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

王曉燕，肖超，肖佑，潘燎，肖戈

結(jié)腸癌是我國常見惡性腫瘤，隨著人們生活水平的不斷提高，結(jié)腸癌已躍居城市惡性腫瘤發(fā)病率第2位(33.17/10萬)、死亡率第4位(15.98/10萬)[1]。我國結(jié)直腸癌患者早期診斷及治療率偏低，積極推動規(guī)范的結(jié)直腸癌早診早治是進(jìn)一步改善我國結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵[2]。結(jié)腸鏡是目前篩查、診斷結(jié)直腸癌的主要手段，但結(jié)腸鏡屬于有創(chuàng)檢查，不便于在人群體檢中廣泛應(yīng)用。癌胚抗原和多種糖類抗原等傳統(tǒng)的腫瘤標(biāo)志物特異度較低，不利于單獨(dú)作為結(jié)直腸癌的診斷依據(jù)[3]。因而，尋找一種早期診斷并能夠提示結(jié)腸癌患者預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物顯得尤為重要。微小RNA (microRNA，miRNA) 是近年來關(guān)注到的小分子非編碼單鏈RNA，通過與靶基因轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)位點相結(jié)合，抑制靶基因的表達(dá)，從而參與腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡等過程；此外，miRNA在腫瘤中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。近年來發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p、miR-376c-3p在宮頸癌、肝癌、胃癌及乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)異常升高[4-7]，通過促進(jìn)腫瘤血管新生及腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，有望作為腫瘤早期診斷及預(yù)后評估的生物學(xué)指標(biāo)。本研究通過分析結(jié)腸癌患者血清中miR-221-3p及miR-376c-3p表達(dá)，分析兩者在結(jié)腸癌中的臨床意義，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年5月—2018年5月湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院肛腸科診治結(jié)腸癌患者104例(結(jié)腸癌組)和非腫瘤結(jié)腸病患者56例(良性疾病組)，以門診行健康查體50例為健康對照組。結(jié)腸癌組男68例，女36例，年齡38～76(59.2±7.0)歲。良性疾病組男37例，女19例，年齡41～77(59.5±6.8)歲。健康對照組男35例，女15例，年齡40～78(60.5±6.3)歲。3組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)通過(倫批號：2018-HN-0032)，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 結(jié)腸癌組病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①初次發(fā)現(xiàn)；②結(jié)腸癌診斷符合“中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范”標(biāo)準(zhǔn)[8]；③術(shù)前無腫瘤治療史。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病理及隨訪資料不完整；②有其他惡性腫瘤史；③合并結(jié)直腸的急慢性感染性疾病。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-221-3p、miR-376c-3p基因表達(dá)檢測：取各組受試者晨起空腹肘靜脈血約5 ml，靜置30 min，離心取上層血清進(jìn)行檢測。應(yīng)用總RNA提取試劑盒(北京索萊寶公司)檢測血清總RNA水平，以Narodrop1000檢測RNA濃度后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書(北京索萊寶公司)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。將產(chǎn)物cDNA進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。miR-221-3p、miR-376c-3p及內(nèi)參U6引物序列見表1?？傮w系20 μl，包括模板1 μl，引物2 μl，Master Mix 10 μl，ddH2O 7 μl。反應(yīng)程序：95℃ 3 min、95℃ 20 s、60℃ 15 s，共40個循環(huán)。結(jié)果以2-ΔΔCt值法表示。以miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)量的平均數(shù)5.43、6.17為界，分為高表達(dá)亞組和低表達(dá)亞組。

表1 miR-221-3p、miR-376c-3p基因檢測引物序列

1.3.2 隨訪情況：結(jié)腸癌患者自出院后開始隨訪，每個月進(jìn)行一次電話隨訪，隨訪時間36個月，隨訪截止至2021年5月31日，隨訪終點為患者死亡或隨訪時間結(jié)束。隨訪患者生存等情況。

2 結(jié) 果

2.1 3組血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)比較 血清miR-221-3p、miR-376c-3p水平比較，結(jié)腸癌組>良性疾病組>健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

表2 3組血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)比較

2.2 結(jié)腸癌患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)的相關(guān)性 Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果顯示，血清miR-221-3p與miR-376c-3p表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.567，P=0.000)。

2.3 血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)在不同臨床/病理特征中比較 結(jié)腸癌Duke分期C～D期、腫瘤低分化及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)均高于Duke分期A～B期、腫瘤高中分化及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.01)，而在患者性別、年齡及腫瘤大小中比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表3。

表3 結(jié)腸癌患者血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)在不同臨床/病理特征中比較

2.4 血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)對結(jié)腸癌預(yù)后的影響 104例結(jié)腸癌患者隨訪3～36(21.1±4.3)月，死亡61例，3年生存率為41.3%(43/104)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，血清miR-221-3p高表達(dá)亞組患者3年總體生存率為21.1%(11/52)，明顯低于低表達(dá)亞組的61.5%(32/52),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=7.134，P=0.000)；血清miR-376c-3p高表達(dá)亞組患者3年總體生存率為23.5%(12/51)，低于低表達(dá)亞組的58.5%(31/53),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.736，P=0.002)，見圖1。

圖1 不同血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)結(jié)腸癌患者生存曲線

2.5 血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)對結(jié)腸癌患者預(yù)后分析 以結(jié)腸癌患者生存預(yù)后為因變量(1=死亡，0=存活，t=生存時間)，納入miR-221-3p(賦值1=高表達(dá)，0=低表達(dá))、miR-376c-3p(賦值1=高表達(dá)，0=低表達(dá))為自變量，COX分析結(jié)果顯示，血清miR-221-3p、miR-376c-3p高表達(dá)是影響結(jié)腸癌預(yù)后的危險因素，見表4。

表4 影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的危險因素分析

3 討 論

目前結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率有逐漸升高的趨勢[9]。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，研發(fā)出新的靶向治療藥物，如酪氨酸激酶抑制劑等，一定程度上可改善結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后[10]。腫瘤分期、腫瘤分化及淋巴轉(zhuǎn)移均是影響結(jié)腸癌預(yù)后的危險因素。但結(jié)腸癌是一種異質(zhì)性較高的腫瘤，臨床上發(fā)現(xiàn)，相同腫瘤Duke分期的結(jié)腸癌患者對治療的敏感性不一致，部分患者存在治療抵抗，并快速發(fā)生腫瘤進(jìn)展轉(zhuǎn)移[11]。深入研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找影響腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的關(guān)鍵基因，對于結(jié)腸癌患者的預(yù)后判斷及個體化治療選擇，具有重要意義。

miRNAs是長度介于20～25個核苷酸的無蛋白編碼功能的調(diào)節(jié)分子，通過參與構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物發(fā)揮調(diào)控靶基因表達(dá)的功能。以往被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)的“轉(zhuǎn)錄垃圾”，隨著近年來研究的深入，發(fā)現(xiàn)miRNAs不僅參與人類正常的生長發(fā)育、衰老等過程，還在心血管疾病、腫瘤及炎性反應(yīng)等人類多種疾病中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能[12-15]。近年來研究表明，多種腫瘤中存在大量miRNAs如miR-221-3p、miR-376c-3p等的表達(dá)異常，并能夠通過調(diào)控下游癌基因或抑癌基因的表達(dá)，影響腫瘤的進(jìn)展[16-18]。miR-221-3p編碼基因位于Xp11.3，研究表明，miR-221-3p在宮頸癌、肝癌等多種惡性腫瘤表達(dá)上調(diào)[4-5，19]，作為促癌基因發(fā)揮腫瘤促進(jìn)的功能。本研究中，結(jié)腸癌患者血清中miR-221-3p過表達(dá)。目前結(jié)腸癌中尚無研究報道m(xù)iR-221-3p表達(dá)上調(diào)的機(jī)制。但miRNA的活性及功能往往受到上游長鏈非編碼RNA(LncRNA)的調(diào)控，因此，推測miR-221-3p的高表達(dá)可能與LncRNA的表達(dá)異常有關(guān)。Chen等[20]報道，LncGAS5能夠作為內(nèi)源性競爭RNA，作為分子支架結(jié)合并抑制miR-221-3p的表達(dá)，腫瘤中LncGAS5的表達(dá)降低導(dǎo)致miR-221-3p顯著升高，激活下游Wnt信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-221-3p高表達(dá)與結(jié)腸癌Duke分期(C～D)、低分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示高表達(dá)miR-221-3p促進(jìn)結(jié)腸癌進(jìn)展。miR-221-3p生物學(xué)功能的發(fā)揮主要是通過調(diào)控下游基因的表達(dá)實現(xiàn)的。如腫瘤細(xì)胞高表達(dá)miR-221-3p通過外泌體釋放到腫瘤微環(huán)境中，通過抑制血小板反應(yīng)蛋白-2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管新生，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移[4]。此外，尚有學(xué)者證實[21]，miR-221-3p參與調(diào)控多種癌基因表達(dá)，腫瘤發(fā)生時miR-221-3p表達(dá)水平上調(diào)，導(dǎo)致下游靶基因SOCS3下調(diào)，從而通過JAK/STAT信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。鑒于miR-221-3p高表達(dá)與不良的臨床病理參數(shù)有關(guān)，miR-221-3p高表達(dá)可能影響患者生存預(yù)后。生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p高表達(dá)的結(jié)腸癌患者生存預(yù)后較差，多因素COX分析結(jié)果進(jìn)一步證實，血清miR-221-3p高表達(dá)是患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素。因此，結(jié)腸癌患者血清miR-221-3p高表達(dá)參與腫瘤惡性進(jìn)展，是判斷結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的標(biāo)志物。

miR-376c-3p的編碼基因位于14q32.31。以往報道表明，miR-376c-3p在不同的人類惡性腫瘤中發(fā)揮不同的生物學(xué)功能，具有腫瘤的特異性，如miR-376c-3p在乳腺癌、口腔鱗癌中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)控RAN2A的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的干性維持，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[7，22]。本研究中，結(jié)腸癌患者血清中miR-376c-3p高表達(dá)。其表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，腫瘤中miR-376c-3p的表達(dá)受到環(huán)狀RNA PIP5K1A的表達(dá)調(diào)控，環(huán)狀RNAPIP5K1A能夠與 miR-376c-3p結(jié)合，提高miR-376c-3p的穩(wěn)定性，兩者協(xié)同促進(jìn)下游癌基因鋅指蛋白146的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p高表達(dá)與不良的臨床病理特征包括腫瘤Duke分期(C～D)、低分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示miR-376c-3p表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。有學(xué)者在胃癌研究中發(fā)現(xiàn)，SYF2作為一種G1/S期轉(zhuǎn)換的抑制性調(diào)節(jié)因子，具有抑制細(xì)胞增殖的作用，miR-376c-3p通過靶向抑制mRNA剪接因子SYF2的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展[6]。此外，miR-376c-3p通過靶向HOXB7促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的裂變、增殖、遷移和侵襲，并抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致惡性腫瘤的進(jìn)展[22]。本研究進(jìn)一步分析結(jié)腸癌中miR-376c-3p表達(dá)的臨床預(yù)后價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-376c-3p高表達(dá)的結(jié)腸癌患者生存預(yù)后較差，并且是結(jié)腸癌患者不良生存預(yù)后的獨(dú)立危險因素，表明miR-376c-3p是一種新的判斷結(jié)腸癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。臨床上可以根據(jù)血清miR-376c-3p表達(dá)水平對結(jié)腸癌患者的預(yù)后進(jìn)行評估預(yù)測，進(jìn)而選擇個體化的治療方案，以提高臨床治療效果。

腫瘤中存在大量miRNA表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響疾病進(jìn)展。本研究中，結(jié)腸癌患者血清miR-221-3p與miR-376c-3p表達(dá)呈正相關(guān)。分析其機(jī)制，可能與兩者在結(jié)腸癌中發(fā)揮協(xié)同作用有關(guān)。Yang等[24]報道，miR-221-3p能夠通過靶向抑制抑癌基因Bcl-2的表達(dá)，而促進(jìn)促癌基因Bad的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p通過LINC00152，能夠促進(jìn)調(diào)控下游Bcl-2的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤凋亡的發(fā)生。因此，miR-221-3p和miR-376c-3p在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過程中可能發(fā)揮協(xié)同作用。但兩者的具體作用機(jī)制仍有待深入探索。

綜上所述，結(jié)腸癌患者血清中miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)升高，miR-221-3p與miR-376c-3p表達(dá)之間呈正相關(guān)。血清miR-221-3p、miR-376c-3p表達(dá)與腫瘤分期、分化程度及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，是新的結(jié)腸癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

王曉燕：設(shè)計研究方案，實施研究過程，論文撰寫;肖超：提出研究思路，分析試驗數(shù)據(jù)，論文審核;肖佑：資料搜集整理，實施研究過程;潘燎、肖戈：實施研究過程，參與撰寫