烘烤前后煙葉葡萄糖和氨基酸及Amadori化合物含量的差異分析

張 婕，趙會(huì)納，，朱文靜，武圣江，楊 慧，蘇賢坤，張孝廉，許冬青，雷 波*，

1.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)山地烤煙品質(zhì)與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽市龍灘壩路29號(hào)550081

2.貴州省煙草科學(xué)研究院煙草行業(yè)分子遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽市龍灘壩路29號(hào)550081

3.貴州省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，貴陽市龍灘壩路29號(hào)550081

美拉德反應(yīng)是煙葉烘烤過程中香味物質(zhì)形成的主要途徑之一［1-2］。Amadori化合物是美拉德反應(yīng)中醛糖和不同氨基酸通過縮合、脫水、重排得到的第一類穩(wěn)定產(chǎn)物［3-6］，在香氣、風(fēng)味和顏色的形成過程中起著核心作用［5,7-13］。不同氨基酸與葡萄糖反應(yīng)形成的Amadori化合物結(jié)構(gòu)不同，產(chǎn)生的香氣物質(zhì)種類和含量也存在差異，因此Amadori化合物的種類和含量與煙葉香型和品質(zhì)關(guān)系密切［14-15］。有研究表明，番茄、甜椒和洋蔥等蔬菜中的Amadori化合物的形成受生長、采收、熱加工過程等多種因素的影響，與其反應(yīng)底物（游離氨基酸種類、濃度、還原糖濃度）也密切相關(guān)［3,4,10-11］。因此，研究烘烤過程中糖和游離氨基酸含量變化及其通過美拉德反應(yīng)途徑的轉(zhuǎn)化規(guī)律對(duì)改善煙葉品質(zhì)具有積極作用。

有研究表明，烤后煙葉中的葡萄糖和果糖（還原糖）在一定范圍內(nèi)與煙葉感官品質(zhì)總體上呈正相關(guān)［16-17］。趙會(huì)納等［16］、楊立均等［18］對(duì)不同生態(tài)區(qū)、不同品種煙葉烘烤前后糖含量變化進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)還原糖在烤后煙葉中均大幅增加，而游離氨基酸種類較多；徐磊等［17］、過偉民等［19］研究表明，煙葉中游離氨基酸含量和組成在年份和產(chǎn)區(qū)間差異較大，多數(shù)游離氨基酸與煙葉品質(zhì)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，但在不同生態(tài)區(qū)間與品質(zhì)負(fù)相關(guān)的氨基酸種類不同。目前關(guān)于烘烤過程中游離氨基酸的研究主要集中于不同烘烤措施對(duì)煙葉中大分子蛋白質(zhì)向游離氨基酸轉(zhuǎn)化降解的變化規(guī)律方面［19-21］。過偉民等［19］研究發(fā)現(xiàn)，在烘烤過程中多數(shù)游離氨基酸含量表現(xiàn)為先上升后下降的趨勢(shì)，與品質(zhì)穩(wěn)定負(fù)相關(guān)的氨基酸多為美拉德反應(yīng)活性較強(qiáng)的氨基酸，其在烘烤中后期下降幅度也較大；王愛華等［20］、陳頤等［21］的研究結(jié)果均表明，適當(dāng)延長變黃期有利于促進(jìn)蛋白質(zhì)降解和游離氨基酸的生成，為烘烤后期生成香氣物質(zhì)提供了更多的反應(yīng)底物；陳頤等［22］試驗(yàn)認(rèn)為轉(zhuǎn)氨酶活性高可促進(jìn)游離氨基酸之間的轉(zhuǎn)化從而促進(jìn)烤后煙葉品質(zhì)的提高。

美拉德反應(yīng)作為烘烤過程產(chǎn)香的主要途徑，從氨基酸參與美拉德反應(yīng)活性的角度分析烘烤過程中煙葉游離氨基酸含量變化差異原因的報(bào)道較少［2,19］，而將Amadori化合物作為美拉德反應(yīng)關(guān)鍵物質(zhì)，研究其反應(yīng)底物糖和游離氨基酸在烘烤過程中變化及參與美拉德反應(yīng)的轉(zhuǎn)化規(guī)律尚鮮見報(bào)道。為此，采用半葉法研究了K326和畢納1號(hào)中部煙葉葡萄糖、游離氨基酸和Amadori化合物含量在烘烤前后的變化規(guī)律，比較了烘烤前后6種Amadori化合物及其相關(guān)氨基酸的轉(zhuǎn)化率在品種間的差異，旨在解析煙葉葡萄糖、游離氨基酸通過美拉德途徑的轉(zhuǎn)化規(guī)律，改善煙葉品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)在貴州省煙草科學(xué)研究院福泉基地進(jìn)行。品種為K326和畢納1號(hào)，于5月4日移栽，行距110 cm，株距55 cm，種植密度16 500株/hm2，施氮量97.5 kg/hm2，按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)規(guī)范進(jìn)行栽培管理。在煙株打頂后選取長勢(shì)一致且有代表性的煙株進(jìn)行掛牌，在煙株第11葉位（從下向上數(shù)）成熟時(shí)采用半葉法單葉取樣，所采集的新鮮煙葉一半經(jīng)液氮保存后真空冷凍干燥，另一半帶主脈烘烤。采用密集烘烤，烤房裝煙密度為75 kg/m3，將K326和畢納1號(hào)掛牌的煙葉樣品放在烤房第2層（從頂層算起）烘烤，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)取8片葉，共6次重復(fù)。

1.2 測(cè)定方法

參照文獻(xiàn)［23］的方法，采用中試型凍干機(jī)（PiloFD系列，美國西蒙國際公司）對(duì)液氮保存的新鮮煙葉進(jìn)行真空冷凍干燥；采用FED240型電熱恒溫箱（德國Binder公司）將烤后樣品于40℃烘干至恒質(zhì)量。

采用LC-MS/MS法［24］同時(shí)測(cè)定煙草樣品中的游離氨基酸與Amadori化合物含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。樣品前處理：準(zhǔn)確稱取煙葉樣品0.1 g于50 mL離心管中，加入0.1 mL濃度分別為39和16 mmol/mL的2-氨基丁酸（2-ABA）、纈氨酸-d8（Val-d8）內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液、20 mL超純水，超聲萃取10 min，取萃取液2 mL，8 000 r/min離心15 min，過0.22 μm微孔濾膜。

色譜條件：色譜柱為戴安Acclaim Explosive E2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A），0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液（B）；流速為400 μL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為2 μL；梯度洗脫：0~4.7 min，4%~35%A；4.7~8.7 min，35%~77%A；8.7~13.0 min，77%~100%A；13.1~19.0 min，1%~1%A。

質(zhì)譜條件：離子源為ESI源；檢測(cè)方式：正離子檢測(cè)；掃描方式：MRM；噴霧電壓：3 200 V；鞘氣流速4.2 L/min；輔助氣流速6.4 L/min；毛細(xì)管溫度275℃；氣化溫度150℃；碰撞室壓力0.133 Pa。

按照文獻(xiàn)［25］介紹的方法測(cè)定煙葉葡萄糖含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。

1.3 美拉德反應(yīng)程度評(píng)價(jià)

選擇6種具有較高美拉德反應(yīng)活性［4,7,11］且在烤后煙葉中含量差異較大的氨基酸［18-19,24］及其對(duì)應(yīng)的Amadori化合物用于美拉德反應(yīng)評(píng)價(jià)。以果糖-氨基酸（如：果糖-丙氨酸）的形式表示各不同游離Amadori化合物。參照Troise A D等［11］的方法，煙草樣品中游離氨基酸在美拉德反應(yīng)中的轉(zhuǎn)化率以某果糖-氨基酸含量占其與對(duì)應(yīng)游離氨基酸含量總和的百分比來評(píng)價(jià)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和簡(jiǎn)單相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 烘烤前后煙葉葡萄糖、游離氨基酸和6種Amadori化合物含量差異

2.1.1 烘烤前后煙葉葡萄糖含量差異

由表1可以看出，烘烤后畢納1號(hào)和K326煙葉中葡萄糖含量均極顯著增加，但烘烤前后葡萄糖含量在兩品種間差異不顯著。

表1 烘烤前后兩品種間煙葉葡萄糖含量的差異①Tab.1 Variance analysis on glucose contents in tobacco leaves before and after flue-curing between the two cultivars

2.1.2 烘烤前后煙葉游離氨基酸含量的差異

烘烤前后兩品種煙葉中16種游離氨基酸含量變化趨勢(shì)相似（表2）。其中烘烤后7種游離氨基酸（賴氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、纈氨酸、色氨酸）含量和游離氨基酸總量均極顯著增加，3種游離氨基酸（天冬氨酸、異亮氨酸和亮氨酸）含量均極顯著下降，1種游離氨基酸（精氨酸）含量顯著下降，3種游離氨基酸（絲氨酸、谷氨酸、酪氨酸）含量與烤前煙葉差異不顯著。此外，烘烤后K326煙葉中的苯丙氨酸含量極顯著增加，畢納1號(hào)煙葉中的蘇氨酸含量顯著降低。

表2 烘烤前后兩品種煙葉游離氨基酸含量的差異Tab.2 Variance analysis on free amino acid contents in tobacco leaves before and after flue-curing between the two cultivars

烘烤前后兩品種間游離氨基酸含量也存在一定差異，其中烘烤前K326煙葉中賴氨酸、谷氨酰胺和色氨酸含量極顯著高于畢納1號(hào)，脯氨酸和游離氨基酸總量顯著高于畢納1號(hào)，絲氨酸和苯丙氨酸顯著低于畢納1號(hào)；烘烤后K326煙葉的谷氨酸含量極顯著高于畢納1號(hào)，賴氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸和天冬酰胺及游離氨基酸總量顯著高于畢納1號(hào)。

2.1.3 烘烤前后煙葉中6種Amadori化合物含量的差異

由表3可以看出，畢納1號(hào)和K326煙葉中6種Amadori化合物均在烘烤過程中產(chǎn)生，在烘烤前的煙葉中均未檢測(cè)到，其含量高低與烤后煙葉中游離氨基酸含量高低順序總體一致，均以果糖-丙氨酸含量最高，果糖-亮氨酸含量最低，果糖-纈氨酸含量次低。但兩個(gè)品種間的Amadori化合物含量存在差異，其中K326煙葉中果糖-丙氨酸和果糖-纈氨酸含量極顯著低于畢納1號(hào)，果糖-亮氨酸和果糖-色氨酸顯著低于畢納1號(hào)。

表3 烘烤前后兩品種煙葉Amadori化合物的差異Tab.3 Variance analysis on Amadori compounds in tobacco leaves before and after flue-curing between the two cultivars

2.2 葡萄糖、游離氨基酸與Amadori化合物的相關(guān)性

由表4可以看出，葡萄糖和5種游離氨基酸（丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸和色氨酸）與其對(duì)應(yīng)的Amadori化合物均存在極顯著的正相關(guān)，亮氨酸與其對(duì)應(yīng)的美拉德反應(yīng)呈極顯著的負(fù)相關(guān)。

2.3 不同游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率及在品種間的差異

由表5可以看出，畢納1號(hào)和K326煙葉中的6種游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)的轉(zhuǎn)化規(guī)律相似，均以丙氨酸的轉(zhuǎn)化率最高（79.30%和69.35%），纈氨酸轉(zhuǎn)化率次之（68.73%和56.82%），脯氨酸轉(zhuǎn)化率最低（20.23%和14.82%），亮氨酸轉(zhuǎn)化率次低（39.50%和24.32%）。但游離氨基酸在品種間的轉(zhuǎn)化率不同，其中5種游離氨基酸的轉(zhuǎn)化率在品種間的差異均達(dá)到了顯著水平，畢納1號(hào)煙葉的脯氨酸、亮氨酸和色氨酸的轉(zhuǎn)化率極顯著高于K326，丙氨酸和纈氨酸顯著高于K326。

表5 6種游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率及兩品種間的差異分析Tab.5 Variance analysis on conversion rates of six free amino acids involved in the Maillard reaction and differences between the two cultivars

3 討論

本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，烘烤后K326和畢納1號(hào)煙葉葡萄糖和游離氨基酸總量均極顯著增加，其中游離氨基酸總量的增加主要受烤后煙葉中脯氨酸含量大量增加的影響，各游離氨基酸之間含量差異較大且變化趨勢(shì)不同，這與前人研究結(jié)果一致［19］。本試驗(yàn)中考察的6種游離氨基酸均在烘烤過程中參與了美拉德反應(yīng)，6種Amadori化合物均在烘烤過程中產(chǎn)生，其含量變化與烤后煙葉中游離氨基酸含量變化總體趨勢(shì)一致，說明烘烤過程中淀粉降解生成的葡萄糖含量充足，底物氨基酸含量的差異是影響Amadori化合物含量差異的主要因素。對(duì)于葡萄糖、游離氨基酸與Amadori化合物的相關(guān)分析也表明，葡萄糖含量與6種Amadori化合物含量均呈正相關(guān)，游離氨基酸含量差異是導(dǎo)致Amadori化合物含量差異的主要原因。

不同游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率差異明顯。丙氨酸與纈氨酸的轉(zhuǎn)化率較高、脯氨酸最低，這與前人報(bào)道的丙氨酸與纈氨酸參與美拉德反應(yīng)活性較高、脯氨酸活性較低的結(jié)果相符［4,7,19］。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，雖然在煙葉烘烤過程中脯氨酸和丙氨酸大量生成，且脯氨酸含量遠(yuǎn)高于其他氨基酸，但由于其轉(zhuǎn)化率最低，導(dǎo)致其生成的Amadori化合物含量略低于丙氨酸。可見，游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)后的轉(zhuǎn)化率受到其自身含量及美拉德反應(yīng)活性的雙重影響［1,4］，這可能也是導(dǎo)致脯氨酸含量與煙葉品質(zhì)相關(guān)性不顯著的原因之一［4,7］。

兩品種中的葡萄糖與丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸的含量在烘烤前后無顯著差異，但這3種游離氨基酸參與美拉德反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率及生成的Amadori化合物含量均為畢納1號(hào)顯著高于K326。在煙葉烘烤過程中，美拉德反應(yīng)不僅受到氨基化合物和羰基化合物含量和類型的影響［1,4］，環(huán)境溫度、加熱時(shí)間、細(xì)胞內(nèi)pH及含水率等也是重要的影響因素［2,3,5,26］。因此，在烘烤條件一致的情況下，這些物質(zhì)含量及轉(zhuǎn)化率的差異可能是由于不同品種間的遺傳特性（細(xì)胞內(nèi)pH及含水率）的差異所致［5,11］，但仍有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

烘烤后煙葉葡萄糖和游離氨基酸總量均極顯著增加，其中游離氨基酸總量的增加主要來自于脯氨酸的貢獻(xiàn)。6種Amadori化合物均在烘烤過程中產(chǎn)生，不同氨基酸生成Amadori化合物的轉(zhuǎn)化率不同，其中丙氨酸的轉(zhuǎn)化率最高，纈氨酸次之，脯氨酸最低；畢納1號(hào)5種游離氨基酸的轉(zhuǎn)化率均顯著高于K326?？竞鬅熑~中生成Amadori化合物含量的高低受到反應(yīng)底物氨基酸的含量及其美拉德反應(yīng)活性的雙重影響。品種間遺傳特性差異也對(duì)烤后煙葉美拉德反應(yīng)底物轉(zhuǎn)化和Amadori化合物含量產(chǎn)生顯著影響。