微流控器官芯片及其在毒理學(xué)評(píng)價(jià)中的應(yīng)用與展望

蘇 曼，李 翔，華辰鳳，趙 閣，尚平平，趙俊偉，王 昇，謝復(fù)煒

中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào)450001

微流控芯片技術(shù)又稱芯片實(shí)驗(yàn)室（Lab-on-a-chip），即把樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成到一塊芯片上，用來實(shí)現(xiàn)常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)，是目前公認(rèn)的生物學(xué)研究主要技術(shù)平臺(tái)之一［1］。最初，微流控芯片被用于以微型色譜和毛細(xì)管電泳構(gòu)建“微全分析系統(tǒng)μ-TAS”或“芯片實(shí)驗(yàn)室”模型來代替實(shí)驗(yàn)室分析的傳統(tǒng)分析方法［2］。隨著微流控芯片技術(shù)的廣泛應(yīng)用，研究人員開始將其應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，利用微加工技術(shù)實(shí)現(xiàn)芯片上的細(xì)胞培養(yǎng)［3］，在微流控芯片上制造出能夠模擬人類器官主要功能的仿生系統(tǒng)，也稱為“器官芯片（Organ-on-chip）［4-5］”。器官芯片利用微流控技術(shù)可以產(chǎn)生精確可控的流體剪應(yīng)力、周期性變化的機(jī)械力和溶質(zhì)濃度梯度變化的灌注液體［6-7］。通過多種細(xì)胞的靈活組合，還可以在微流控芯片平臺(tái)上研究組織-組織、器官-器官的相互作用，從而模擬人體器官的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、微環(huán)境和生理功能［8-9］，其中微環(huán)境的模擬、組織-器官的相互作用模型以及類器官模型的可變性是器官芯片面臨的技術(shù)挑戰(zhàn)和未來致力的研究方向［10］。器官芯片在細(xì)胞三維培養(yǎng)方面具有的獨(dú)特優(yōu)勢，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)二維細(xì)胞培養(yǎng)模式難以實(shí)現(xiàn)人體組織器官復(fù)雜生理功能的局限，解決了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)周期長、成本高、難以預(yù)測人體對(duì)于各種藥物響應(yīng)的問題［11］，符合“21世紀(jì)毒理學(xué)”的愿景與策略，實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)研究的體外代替，在微納尺度上實(shí)現(xiàn)多維度的生命分析。

目前，肺［12］、肝［13］、腎［14-15］、腸［16］、神經(jīng)［17］和心臟［18］等器官芯片的構(gòu)建已經(jīng)實(shí)現(xiàn)。器官芯片通過與細(xì)胞生物學(xué)、工程學(xué)和生物材料等各個(gè)學(xué)科的技術(shù)相結(jié)合，可以模擬多種組織和器官微環(huán)境，反映人體器官的主要結(jié)構(gòu)和功能特征，已被應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)和環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域?；谖⒘骺匦酒诙拘栽u(píng)估中的優(yōu)勢，器官芯片將在煙草制品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本文中著重介紹了肺、腸、肝芯片以及多細(xì)胞組合的多器官芯片［19］的研究進(jìn)展和器官芯片在藥物毒性評(píng)估和環(huán)境毒理學(xué)中的應(yīng)用，在此基礎(chǔ)上展望了器官芯片在煙草制品毒理學(xué)評(píng)價(jià)領(lǐng)域的研究趨勢。

1 微流控器官芯片研究進(jìn)展

1.1 肺芯片

在以往的肺部疾病相關(guān)研究中已經(jīng)建立了許多體外模型和動(dòng)物模型，但是這些模型是否與臨床結(jié)果相一致還存在爭議［20-22］。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)廣泛使用的嚙齒動(dòng)物，由于種屬差異的存在，生理過程與人類有很大不同［23-24］。另一方面，現(xiàn)有的體外模型通常利用二維單層培養(yǎng)的細(xì)胞系或未分化的原代細(xì)胞，與實(shí)際生理環(huán)境差異大，而微流控芯片技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維培養(yǎng)，這為疾病研究的體外建模［25］和毒性評(píng)估［26］提供了新的平臺(tái)。目前已經(jīng)建立了小氣道疾病、肺水腫、哮喘和外源性肺損傷等模型［27］。

2010年，哈佛大學(xué)的Ingber研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了雙層夾膜結(jié)構(gòu)的肺芯片經(jīng)典模型［12］，這種仿生肺模型又被稱為“會(huì)呼吸的肺”，芯片上層為氣體腔室，培養(yǎng)肺泡上皮細(xì)胞；下層為液體層，培養(yǎng)血管內(nèi)皮細(xì)胞；中間由微孔膜分隔開，通過對(duì)兩側(cè)腔室的規(guī)律性抽吸帶動(dòng)細(xì)胞生長層的伸縮來模擬呼吸運(yùn)動(dòng)（圖1）。之后，Ingber課題組在該肺芯片上建立了肺水腫模型［28］，研究發(fā)現(xiàn)，在呼吸運(yùn)動(dòng)的存在下白介素-2（IL-2）對(duì)肺氣血屏障的損壞作用更為顯著。2018年，Ingber團(tuán)隊(duì)的Jain等［29］將原代肺泡上皮細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)在這種肺芯片模型上，用于評(píng)估血栓的形成，結(jié)果表明脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）通過激活肺泡上皮間接刺激血管內(nèi)血栓形成，為研究人類肺血栓形成機(jī)制提供了新方法。2016年，Ingber團(tuán)隊(duì)的Benam等［30］設(shè)計(jì)了一種“小氣道芯片”，包含上層氣液界面培養(yǎng)的原代細(xì)支氣管上皮細(xì)胞層和下層微血管內(nèi)皮細(xì)胞層，微血管通道內(nèi)流過含有中性粒細(xì)胞的培養(yǎng)液，可實(shí)時(shí)分析生理剪切力作用下內(nèi)皮細(xì)胞捕獲白細(xì)胞的情況。這種小氣道芯片可用于在體外模擬復(fù)雜、動(dòng)態(tài)的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步拓展了肺芯片技術(shù)在體外模型構(gòu)建中的應(yīng)用。2016年，大連醫(yī)科大學(xué)的Xu等［31］報(bào)告了一種用于研究肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的多器官芯片，該芯片包括一個(gè)上游的“肺”和3個(gè)下游器官：腦、骨骼、肝，CXCR4蛋白、RANKL蛋白、AFP蛋白等標(biāo)志物的過表達(dá)表示癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移后細(xì)胞受損，該芯片系統(tǒng)為模擬體內(nèi)腫瘤轉(zhuǎn)移的微環(huán)境和研究轉(zhuǎn)移過程中細(xì)胞-細(xì)胞相互作用提供了一種可靠的體外平臺(tái)。2018年，加拿大多倫多大學(xué)的Humayun等［32］設(shè)計(jì)了一種肺氣道芯片模型，發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長，人氣道平滑肌細(xì)胞（Human airway smooth muscle cells，HBSMCs）趨向于呈現(xiàn)出與體內(nèi)類似的縱向排列的情況。

圖1 肺芯片示意圖［12］Fig.1 Schematic diagram of a lung chip

1.2 腸芯片

口服藥物必須經(jīng)小腸才能進(jìn)入血液，腸是吸收代謝的重要器官，許多藥物在腸中發(fā)生首過作用［33-34］。腸芯片通過在體外復(fù)制腸絨毛的結(jié)構(gòu)或與基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)來模擬體內(nèi)腸道細(xì)胞的生理微環(huán)境［35］，以維持各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和代謝酶的表達(dá)。2010年，德國Saarland大學(xué)的Leonard等［36］建立了一個(gè)模擬腸道黏膜炎癥的三維細(xì)胞培養(yǎng)模型，人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2細(xì)胞與巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)狀態(tài)下，炎性細(xì)胞因子反應(yīng)強(qiáng)于單獨(dú)培養(yǎng)的Caco-2細(xì)胞。2013年，中科院大連化學(xué)物理研究所（大連化物所）的Li等［37］在膠原蛋白凝膠層上共培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞和經(jīng)甲氨蝶呤誘導(dǎo)后的人結(jié)腸腺癌細(xì)胞HT29-MTX細(xì)胞，凝膠中還摻入了基質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞），與單獨(dú)培養(yǎng)模型相比，跨膜電阻值較低，更接近體內(nèi)值。2017年，韓國Hongik大學(xué)的Choe等［38］設(shè)計(jì)了一種腸-肝共培養(yǎng)芯片，在動(dòng)態(tài)共培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出細(xì)胞色素P450代謝酶活性的顯著增強(qiáng)。2018年，大連化物所的Guo等［16］利用器官芯片模擬人腸道內(nèi)藥物的代謝（圖2），在涂敷I型膠原蛋白的硝酸纖維素膜上接種Caco-2細(xì)胞，融合后的腸上皮細(xì)胞保持了緊密連接蛋白ZO-1的持續(xù)表達(dá)以及絨毛蛋白、蔗糖酶異麥芽糖酶和堿性磷酸酶基因的高表達(dá)。一些研究人員將Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)在人工制造的膠原絨毛支架上，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形成類似于腸道絨毛的三維形狀［39-40］。另外，一些研究中還進(jìn)行了腸上皮細(xì)胞和其他細(xì)胞的共培養(yǎng)，如2019年，巴西Brazilian Biosciences National Laboratory的Marin等［41］設(shè)計(jì)了一種雙層腔室腸-肝微流控芯片，將Caco-2和HT-29兩種細(xì)胞混合共培養(yǎng)形成體外腸屏障，腸屏障上跨膜電阻值在21 d內(nèi)隨細(xì)胞分化程度的增大而增加。這些結(jié)果均顯示了共培養(yǎng)在腸芯片中對(duì)腸功能的促進(jìn)作用，但與真實(shí)的人體相比，腸芯片在吸收和代謝功能方面仍有一定的差距，另外腸道菌群的存在對(duì)于腸功能研究也具有非常重要的意義，未來腸芯片在對(duì)人體高度仿生方面仍然需要投入更多精力。

圖2 腸芯片示意圖［16］Fig.2 Schematic diagram of an intestinal chip

1.3 肝芯片

肝臟是藥物和其他外源性物質(zhì)毒性作用的主要靶器官［42］。傳統(tǒng)體外毒理學(xué)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)中，肝毒性的評(píng)估主要利用二維培養(yǎng)的永生化肝細(xì)胞系HepG2和原代肝細(xì)胞，這類模型的缺點(diǎn)是代謝活性較低，肝臟特異性功能下降較快［43］，三維培養(yǎng)條件下的肝芯片可模擬體內(nèi)肝組織的結(jié)構(gòu)和功能。

2016年，美 國 哈 佛 醫(yī) 學(xué) 院 的Bhise等［44］將HepG2/C3A細(xì)胞嵌入甲基丙烯酸水凝膠中制成球狀體排列在微流控芯片中，可通過檢測特定標(biāo)志物的變化來評(píng)估肝臟毒性。2017年，波蘭華沙理工大學(xué)的Zuchowska等［45］利用三維培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞球體來研究抗癌藥5-氟尿嘧啶（5-FU）的肝細(xì)胞毒性，表明肝芯片可用于藥物毒性評(píng)估。2018年，澳大利亞莫納什大學(xué)的Delalat等［46］利用含有微溝的硅芯片實(shí)現(xiàn)肝原代細(xì)胞的三維培養(yǎng)，芯片上的肝細(xì)胞表現(xiàn)出更高代謝酶活性，細(xì)胞色素酶CYP1A2、2E-1、3A-4活性水平以及白蛋白和尿素水平均高于二維細(xì)胞培養(yǎng)。2019年，德國海德堡大學(xué)的Theobald等［47］利用永生化肝細(xì)胞系HepG2和腎小管上皮細(xì)胞RPTC構(gòu)建了肝-腎微流控芯片，維生素D在芯片上能夠代謝活化并對(duì)人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞HL60產(chǎn)生毒性作用，證明芯片上的肝細(xì)胞具備一定的代謝功能。

以上這些芯片中模擬器官結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)對(duì)于芯片上細(xì)胞的代謝活性均具有積極的作用，但這些研究只是一種肝細(xì)胞的培養(yǎng)，對(duì)肝細(xì)胞的選擇比較單一。

肝臟中的代謝活動(dòng)和毒性反應(yīng)往往由多種細(xì)胞參與，非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存在對(duì)于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間信號(hào)分子的傳導(dǎo)以及肝細(xì)胞功能的增強(qiáng)非常重要。一些研究人員在芯片模型中引入非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞等），例如，2016年西北農(nóng)林科技大學(xué)的Ma等［48］利用HepG2和非實(shí)質(zhì)細(xì)胞HAECs的共培養(yǎng)開發(fā)了模擬肝小葉結(jié)構(gòu)的芯片裝置，肝酶測定結(jié)果表明，芯片上細(xì)胞能夠保持較高的基礎(chǔ)CYP1A1/2活性和UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UGT）活性，以及較強(qiáng)的藥物代謝能力。2017年，中科院力學(xué)研究所的Du等［49］利用肝竇內(nèi)皮細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的共培養(yǎng)在體外復(fù)制肝竇的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)另外3種非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的存在促進(jìn)了中性粒細(xì)胞在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的聚集。2019年，Draper實(shí)驗(yàn)室的Bale等［50］將原代肝細(xì)胞與庫普弗細(xì)胞共培養(yǎng)在一種雙層芯片中，肝細(xì)胞在7 d的連續(xù)培養(yǎng)中顯示出穩(wěn)定的蛋白分泌和代謝功能。2019年，大連理工大學(xué)的Deng等［13］設(shè)計(jì)了類似的多細(xì)胞肝竇結(jié)構(gòu)芯片（圖3），肝細(xì)胞保留了細(xì)胞色素P4501A1/2和UGT的酶活性，藥物肝毒性的測試結(jié)果與經(jīng)典的原代肝細(xì)胞孔板模型結(jié)果相似，這類多細(xì)胞衍生的肝臟模型為研究藥物肝毒性、藥物-藥物相互作用提供了一種替代方法。

圖3 肝芯片模型［13］Fig.3 A liver chip model

1.4 多器官芯片

多器官微流控芯片將不同器官和組織來源的細(xì)胞在芯片上培養(yǎng)，能在體外模仿體內(nèi)不同器官、組織之間的生理相互作用，在評(píng)價(jià)組織間相互作用方面具有優(yōu)勢［51］。2015年，德國柏林工業(yè)大學(xué)的Maschmeyer等［52］設(shè)計(jì)了共培養(yǎng)腸、肝、皮膚和腎細(xì)胞的多器官芯片，細(xì)胞在28天內(nèi)均保持高活性并能夠自發(fā)形成功能化的結(jié)構(gòu)。2016年，清華大學(xué)的Jie等［53］將Caco-2細(xì)胞、HepG2細(xì)胞、人神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞U521分別模擬腸道、肝和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在芯片上進(jìn)行共培養(yǎng)，在體外成功建立了芯片上藥物吸收和代謝模型。美國中佛羅里達(dá)大學(xué)的Oleaga等［54］使用無泵重力驅(qū)動(dòng)流體體系將功能性心臟、肝臟、骨骼肌和神經(jīng)細(xì)胞共培養(yǎng)14 d，用于研究4種藥物——阿霉素、阿托伐他汀、丙戊酸和對(duì)乙酰氨基酚的毒性作用。2016年，大連化物所的Li等［55］利用多層器官芯片裝置評(píng)估不同器官特異性細(xì)胞（肝臟細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞和正常胃細(xì)胞）中藥物代謝和細(xì)胞毒性效應(yīng)，研究發(fā)現(xiàn)卡培他濱對(duì)于腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但對(duì)正常胃細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性，這種體外模型不僅用于評(píng)價(jià)藥物在不同靶組織上的生物活性，也可用于不同細(xì)胞對(duì)受試物刺激的毒理學(xué)反應(yīng)研究。2020年，大連理工大學(xué)的黃恒順等［56］基于微流控技術(shù)構(gòu)建了腸-肝-乳腺多器官芯片并將其用于藥物的體外代謝動(dòng)力學(xué)-藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetics-pharmacodynamics,PK-PD）研究。類似的腸-肝芯片［40］也用來模擬脂肪酸在腸道和肝臟的吸收和積累。

多器官芯片的發(fā)展為未來的“人體芯片”提供了初級(jí)模型，但在還原人體復(fù)雜度方面的發(fā)展任務(wù)依然艱巨。

2 微流控器官芯片在毒理學(xué)中的應(yīng)用

2.1 藥物毒性評(píng)估

藥物毒性評(píng)估是器官芯片技術(shù)的重要應(yīng)用領(lǐng)域，器官芯片能夠在單個(gè)芯片系統(tǒng)中同時(shí)實(shí)現(xiàn)藥物的代謝和作用過程，為藥物開發(fā)和研究提供高通量平臺(tái)，這是二維細(xì)胞培養(yǎng)模型和動(dòng)物模型所不具備的［10］。

藥物引起的肝損傷是影響藥物研發(fā)和使用的最常見原因，肝芯片可作為藥物肝損傷體外評(píng) 價(jià) 的 有 效 工 具［57］。2012年，法 國Centre de Recherche de Royallieu的Prot等［58］利 用 肝 芯 片 評(píng)價(jià)對(duì)乙酰氨基酚對(duì)肝癌細(xì)胞的毒性作用，觀察到對(duì)乙酰氨基酚處理可引起鈣離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)、脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞凋亡等現(xiàn)象，證明了肝芯片在毒性預(yù)測研究方向的潛力。2015年，德國柏林工業(yè)大學(xué)的Maschmeyer等［52］設(shè)計(jì)了一種皮膚、腸、肝和腎共培養(yǎng)的多器官芯片系統(tǒng)，該芯片可以模擬口服藥物在體內(nèi)的作用方式，在模擬體內(nèi)藥物作用與毒性方面潛力非常大。2017年，韓國Hongik大學(xué)的Lee等［59］在含有肝臟和腫瘤細(xì)胞的多器官芯片中測定了木犀草素的抗癌活性，木犀草素經(jīng)HepG2細(xì)胞代謝后對(duì)Hela細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。

微流控芯片在其他靶器官的藥物毒性研究中也有應(yīng)用，如用于神經(jīng)毒性和腎毒性的研究。2014年，美國倫斯勒理工學(xué)院的Meli等［60］開發(fā)了用于人類神經(jīng)干細(xì)胞（hNSC）生長和分化的高通量分析的三維細(xì)胞微陣列系統(tǒng)，能夠用于篩選不同物質(zhì)對(duì)hNSC的毒性。2013年，美國塔夫斯大學(xué)的DesRochers等［61］在三維腎組織模型上比較順鉑、慶大霉素和阿霉素誘導(dǎo)的急性和慢性毒性，與二維細(xì)胞培養(yǎng)相比，三維組織培養(yǎng)系統(tǒng)具有能夠長期監(jiān)測細(xì)胞毒性的優(yōu)勢，并且對(duì)藥物劑量更加敏感。2013年，哈佛大學(xué)Ingber研究團(tuán)隊(duì)的Jang等［62］在芯片上培養(yǎng)原代腎上皮細(xì)胞用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)和腎毒性評(píng)估，與常規(guī)培養(yǎng)條件相比，芯片上毒性測試結(jié)果更接近體內(nèi)情況，在臨床前安全性研究的腎臟毒性評(píng)估中具有應(yīng)用潛力。

2.2 環(huán)境毒理學(xué)評(píng)價(jià)

由于環(huán)境污染物對(duì)人類的未知不良健康影響，迫切需要對(duì)其進(jìn)行篩選和評(píng)估。器官芯片系統(tǒng)可用于環(huán)境毒理學(xué)中污染物的毒理學(xué)預(yù)測和機(jī)制研究，目前，已經(jīng)出現(xiàn)了器官芯片在有機(jī)污染物化合物、顆粒物和金屬離子等方面的應(yīng)用研究。

環(huán)境污染物中的小分子化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)代謝后對(duì)靶器官產(chǎn)生毒性。2012年，法國里昂大學(xué)的Shintu等［63］利用微流控芯片與核磁共振氫譜（1H NMR）結(jié)合，研究了幾種毒性分子（氨氣、二甲基亞砜、對(duì)乙酰氨基酚）在肝臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)以及共培養(yǎng)條件下的器官特異性代謝反應(yīng)，并確定了這幾種分子暴露和毒性損傷的代謝標(biāo)志物。2018年，德國海德堡大學(xué)的Theobald等［64］提出了一種肺-肝臟芯片模型，用于研究黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）和苯并芘（B[a]P）的生物轉(zhuǎn)化和毒性作用。2020年，韓國Konyang大學(xué)的Dong等［65］在培養(yǎng)人肝細(xì)胞的微柱/微孔芯片平臺(tái)上研究了沙梨（Pyrus pyrifolia）提取物對(duì)典型環(huán)境污染物雙酚A毒性作用的影響，在沙梨提取物存在下雙酚A的毒性降低，雙酚A對(duì)HepG2細(xì)胞的半數(shù)致死濃度（IC50）從151 μmol/L變?yōu)?51 μmol/L，這可為物質(zhì)的相互作用研究提供一種新思路。

環(huán)境中顆粒物的暴露也是影響公共健康的重要因素之一。2018年，武漢理工大學(xué)的Li等［66］利用纖維素蛋白凝膠作為支架進(jìn)行了人肺成纖維細(xì)胞（HLF細(xì)胞）的三維培養(yǎng)，并進(jìn)行了納米級(jí)顆粒物的暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，納米顆粒物（Nano-particulate matter,NPM）與富含蛋白質(zhì)的液體接觸時(shí)形成的“蛋白冠”能夠降低NPM的細(xì)胞毒性，刺激HLF細(xì)胞的增殖，并可能導(dǎo)致肺纖維化。該結(jié)果為研究PM2.5誘導(dǎo)的肺功能受損（尤其是肺纖維化）提供了合適的體外模型。2018年，大連化物所的Zhang等［67］提出了一種共培養(yǎng)人肺上皮細(xì)胞和人血管內(nèi)皮細(xì)胞的三維人肺芯片模型，用于模擬人肺的納米顆粒暴露，在納米顆粒暴露（TiO2-NPs和ZnO-NPs）下，分析了上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)變化、ROS的產(chǎn)生和凋亡，該芯片能夠?qū)崿F(xiàn)納米顆粒毒理學(xué)影響的預(yù)測，可用于環(huán)境安全評(píng)估。2019年，武漢理工大學(xué)的Li等［68］基于纖維蛋白凝膠支架構(gòu)建了三維微血管結(jié)構(gòu)，用于研究室內(nèi)空氣中納米級(jí)顆粒物（Airborne nanoscale particles,ANPs）進(jìn)入血液后對(duì)凝血功能的影響，結(jié)果表明，ANPs可刺激人血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（Reactive oxygen species,ROS），并進(jìn)一步導(dǎo)致凝血因子（TF、TM和t-PA）的異常表達(dá)，為ANPs導(dǎo)致凝血異常提供了細(xì)胞層面上的解釋。

金屬離子也是環(huán)境污染物中的主要毒性物質(zhì)之一。2019年，臺(tái)灣大學(xué)的Tan等［69］開發(fā)了一種器官芯片用來評(píng)估暴露于金屬銅和鉈誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。與傳統(tǒng)靜態(tài)培養(yǎng)的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)相比，在芯片上可以通過增加剪應(yīng)力進(jìn)而增加細(xì)胞對(duì)金屬暴露的敏感性，為細(xì)胞毒性的定量分析提供更為靈敏的平臺(tái)。

2.3 煙草制品毒理學(xué)評(píng)價(jià)

卷煙燃吸產(chǎn)生的煙氣作為環(huán)境污染物的來源之一，其體外毒理學(xué)研究對(duì)于煙草制品危害性評(píng)價(jià)具有重要意義。相較于傳統(tǒng)的二維細(xì)胞培養(yǎng)模型，器官芯片在煙草制品毒性評(píng)估方面具有優(yōu)勢。2018年，東南大學(xué)的Zhang等［70］提出了一種可發(fā)生多液體梯度的微流體細(xì)胞系統(tǒng)，用于在高通量方式下研究卷煙煙氣有害成分B[a]P誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示，暴露后上皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的細(xì)胞萎縮、細(xì)胞骨架解體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）活化、活性氧增多、多種炎癥細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子-α、白介素-6、白介素-8）分泌。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和二維體外細(xì)胞模型中的結(jié)果一致，并且具有高通量的優(yōu)點(diǎn)。之后該課題組又在芯片上共培養(yǎng)了肺泡上皮細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)煙氣中兩種化學(xué)成分（B[a]P、煙堿）刺激的多種肺部反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（包括炎癥信號(hào)、細(xì)胞骨架、組織結(jié)構(gòu)和凋亡）進(jìn)行了檢測和定量評(píng)價(jià)［19］。2018年，大連化物所的Wang等［71］在微流控芯片上構(gòu)建了一種人源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSC）衍生的大腦類器官系統(tǒng)，研究了暴露于煙堿的大腦類器官的細(xì)胞凋亡，這種大腦類器官芯片為研究煙堿暴露引起的神經(jīng)發(fā)育障礙提供了合適的平臺(tái)。2017年，菲莫煙草公司的Iskandar等［72］構(gòu)建了基于氣液界面的人三維鼻黏膜上皮細(xì)胞體外模型，用來評(píng)估新型煙草制品THS煙草加熱系統(tǒng)2.2（THS2.2）產(chǎn)生的氣溶膠與參比卷煙3R4F產(chǎn)生的煙氣氣溶膠的毒理學(xué)影響的差異，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞毒性水平、組織形態(tài)變化、促炎因子分泌、纖毛功能受損以及轉(zhuǎn)錄組和miRNA表達(dá)譜紊亂增加等方面，3R4F卷煙煙氣氣溶膠的毒性影響均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于THS2.2氣溶膠。2019年，菲莫煙草公司的Poussin等［73］利用原代人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞建立了芯片上內(nèi)皮微血管的三維（3D）模型，用3D血管芯片模型來評(píng)估新型煙草制品THS2.2和參比卷煙3R4F對(duì)單核細(xì)胞粘附到內(nèi)皮微血管的影響，結(jié)果表明，與3R4F煙氣氣溶膠相比，THS 2.2氣溶膠對(duì)單核細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響降低，這為研究動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制以及與煙草制品的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性提供了替代性體外模型，同時(shí)也為新型煙草制品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供了新方法。2019年，吉林大學(xué)的Hou等［74］利用仿生肺芯片模型對(duì)上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)的共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)持續(xù)的煙氣暴露可引起肺氣-血屏障的破壞和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，證實(shí)了信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）是煙氣引起的炎癥發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵作用點(diǎn)，這提示微流控芯片可以作為卷煙煙氣誘發(fā)惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)研究的合適平臺(tái)。2016年，Ingber研究團(tuán)隊(duì)的Benam等［30］設(shè)計(jì)的小氣道芯片將呼吸運(yùn)動(dòng)模擬和卷煙煙氣暴露相結(jié)合，再現(xiàn)了體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并發(fā)現(xiàn)了新的吸煙引起的纖毛病理現(xiàn)象。2018年，鄭州煙草研究院的Liu等［75］設(shè)計(jì)并制作了一種可實(shí)現(xiàn)氣液雙梯度暴露的微流控芯片（圖4a），在瓊脂糖凝膠表面接種人肺腺癌細(xì)胞A549并形成氣液接觸界面，下層可形成4個(gè)液體梯度（圖4b），上層形成4個(gè)氣體梯度（圖4c），利用構(gòu)建的芯片平臺(tái)研究了卷煙煙氣暴露對(duì)A549細(xì)胞的氧化損傷，檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS變化（圖4d）。該芯片不僅實(shí)現(xiàn)了基于氣-液界面的細(xì)胞煙氣暴露，還能夠產(chǎn)生多個(gè)氣體和液體梯度，實(shí)現(xiàn)高通量分析，可用于卷煙煙氣的毒性效應(yīng)評(píng)估。

圖4 氣-液雙梯度全煙氣暴露芯片［75］Fig.4 Microfluidic liquid-air dual-gradient chip for whole smoke exposure

3 展望

器官芯片技術(shù)可以為體外培養(yǎng)的細(xì)胞、組織提供良好的生理環(huán)境，并增強(qiáng)其功能和對(duì)毒性物質(zhì)刺激的敏感性。盡管器官芯片在材料、細(xì)胞來源、通量和驗(yàn)證方面均面臨一些挑戰(zhàn)，但其已在毒理學(xué)評(píng)估中顯示出了巨大的應(yīng)用潛力。在未來發(fā)展中，多器官芯片以及“人體芯片”的發(fā)展將成為新的趨勢，開發(fā)“人體芯片”對(duì)促進(jìn)生理健康和藥物篩選研究意義重大。在模擬體內(nèi)結(jié)構(gòu)的條件下，如何精準(zhǔn)模擬體內(nèi)的微環(huán)境已成為芯片發(fā)展中的挑戰(zhàn)，基于仿生體內(nèi)微環(huán)境的機(jī)制研究將減小因?qū)嶒?yàn)數(shù)據(jù)從動(dòng)物向人群外推帶來的不確定度，更加直觀地反映疾病風(fēng)險(xiǎn)。

器官芯片技術(shù)有可能在煙草制品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究中發(fā)揮其優(yōu)勢，并替代動(dòng)物模型和常規(guī)細(xì)胞模型，如在卷煙煙氣的肺吸入毒性評(píng)價(jià)、吸煙相關(guān)疾病模型的建立與機(jī)制研究以及煙氣成分代謝動(dòng)力學(xué)等研究方面。以往煙草制品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的毒理學(xué)評(píng)價(jià)通常使用體外二維細(xì)胞培養(yǎng)模型或體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究煙草制品的健康影響，由于煙氣氣溶膠的復(fù)雜特性以及人體實(shí)際吸煙過程中長期低劑量的煙氣成分暴露特點(diǎn)，如何快速、準(zhǔn)確、科學(xué)地評(píng)估煙草制品的健康影響是當(dāng)前面臨的重要難題和挑戰(zhàn)。通過借助多學(xué)科的交叉合作，從材料學(xué)、分析化學(xué)、生物學(xué)、流體力學(xué)和生物信息學(xué)等領(lǐng)域可能實(shí)現(xiàn)突破創(chuàng)新：

（1）遵循“21世紀(jì)毒理學(xué)”和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)“3R原則”，設(shè)計(jì)研發(fā)例如肺芯片、肝芯片等單器官芯片和多器官組合芯片，模擬煙氣暴露和代謝的體內(nèi)微環(huán)境，建立基于器官芯片技術(shù)的吸煙相關(guān)疾病體外評(píng)估模型。

（2）整合器官芯片技術(shù)和多組學(xué)分析技術(shù)，開展煙氣有害成分的快速、高通量代謝動(dòng)力學(xué)研究和生物標(biāo)志物篩選，闡釋煙草相關(guān)疾病的有害結(jié)局路徑（AOP），在微納尺度上實(shí)現(xiàn)多維度的生命分析。