煙草NtCAD基因克隆與表達(dá)分析

趙利杰，王 中，羅朝鵬，謝小東，張劍鋒，李澤鋒，李 鋒，楊 軍，武明珠

中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào)450001

木質(zhì)素是維管植物細(xì)胞壁的主要成分，在植物體內(nèi)具有增強(qiáng)細(xì)胞壁機(jī)械強(qiáng)度、運(yùn)輸水分和礦物質(zhì)以及抵御病蟲害等作用［1-3］，根據(jù)木質(zhì)素單體的不同可將木質(zhì)素分為S型、G型和H型3種類型［4］。肉桂醇脫氫酶（Cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）是合成木質(zhì)素的關(guān)鍵酶［5］，在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的作用下，CAD可催化羥基肉桂醛轉(zhuǎn)化為羥基肉桂醇，即單木酚醇［6］。木質(zhì)素的組分和含量在CAD基因的調(diào)控下會(huì)發(fā)生變化［7］。擬南芥AtCAD4和AtCAD52個(gè)基因同時(shí)突變后，木質(zhì)素含量下降94%［8］；高粱SbCAD突變體植株中，木質(zhì)素含量下降15%~25%［9］；松樹LpCAD自然突變體植株中，松柏醛含量增加，木質(zhì)素含量下降9%［10］；玉米ZmCAD突變體植株中，G和S型木質(zhì)素含量下降，木質(zhì)素含量下降20%［11］；楊樹CAD基因通過(guò)反義和共抑制法處理后，醛類組分增加，木質(zhì)素含量不變［12］；苜蓿CAD基因在反義抑制調(diào)控下，S型木質(zhì)素含量下降，木質(zhì)素含量不變［13］。CAD蛋白結(jié)構(gòu)含有3個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，包括Zn離子催化中心［Zn1，GHE（X）2G（X）5G（X）2V］、Zn離子結(jié)合位點(diǎn)［Zn2，GD（X）10C（X）2C（X）2（X）7C］和NADP（H）輔酶結(jié)合位點(diǎn)［G（X）GGV（L）G］［14-16］。根據(jù)CAD核苷酸和蛋白序列的同源性系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將CAD基因的類型劃分為三類［17］。第一類CAD基因主要存在于裸子植物和被子植物中［18］，又被稱為bona fideCAD，直接參與木質(zhì)素的合成，第二類和第三類主要是被子植物的CADs基因，在裸子植物中也存在第三類CADs基因［19］。第二類CADs中不同基因的功能具有差異性，除參與木質(zhì)素合成，還與植物抗逆性密切相關(guān)［20］。第三類CADs基因在木質(zhì)素合成過(guò)程中的作用不大，通常在一些非木質(zhì)化的組織中可檢測(cè)到這類酶的活性［21］。

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙葉中木質(zhì)素含量與其品質(zhì)密切相關(guān)。木質(zhì)素類物質(zhì)含量較高的煙葉，其品質(zhì)相對(duì)較差［22］，主要原因是木質(zhì)素在燃燒時(shí)產(chǎn)生刺激性氣味，掩蓋煙葉的香氣［23-24］。此外，在熱分解時(shí)木質(zhì)素會(huì)產(chǎn)生一種能引起澀口感覺(jué)并有致癌作用的物質(zhì)兒茶酚［22,25］。目前關(guān)于煙草CAD基因的研究相對(duì)較少，本研究中以普通煙草K326的cDNA為模板克隆得到1個(gè)NtCAD基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和煙草不同組織的表達(dá)模式分析，并分析低溫（4℃）脅迫和脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理后該基因的表達(dá)情況，旨在揭示NtCAD基因功能，為煙葉品質(zhì)的提升提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 煙草材料

K326種子用15% NaClO消毒15 min后，用滅菌水反復(fù)沖洗5次，播種于無(wú)菌的二分之一MS培養(yǎng)基中。幼苗長(zhǎng)出4片真葉時(shí)，移栽到二分之一MS（無(wú)瓊脂）中進(jìn)行培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)出6片真葉后，選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗進(jìn)行低溫（4℃）和10 μmol/L脫落酸（ABA）處理，在0、3、6、12、24 h處理后取樣，每處理取3株幼苗，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

田間試驗(yàn)在湖南郴州桂陽(yáng)縣煙草基地進(jìn)行，供試品種為K326。煙苗長(zhǎng)至5片真葉時(shí)于清明節(jié)前后移栽，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的6株煙草，在盛花期采集幼葉葉片、成熟葉葉片、側(cè)根、須根、莖節(jié)、莖稈、花蕾及花組織，每個(gè)組織采集6份，用于分析NtCAD基因在煙草不同組織中的表達(dá)情況。

1.2 煙草總RNA提取和cDNA合成

煙草總RNA用GenePure Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒（北京密碼子生物科技有限公司）提取。用超微量核酸蛋白測(cè)定儀［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］測(cè)定RNA的濃度和完整性，RNA反轉(zhuǎn)錄具體步驟參照PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］的說(shuō)明書。

1.3 煙草NtCAD基因全長(zhǎng)克隆

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載并得到的擬南芥的CAD基因序列，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（www.tobaccodb.org）中進(jìn)行Blast比對(duì)。利用Primer Premier 6對(duì)相似性最高的基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物（上游引物：5'-TTTCTGCTCTAAAAC AATCGT-3'，下游引物：5'-AGCCTTGTATAATAGTG AACC-3'）。以煙草幼苗的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)總體系20 μL（cDNA 2 μL、Taq PCR Starmix 10 μL、上下游引物各1 μL、ddH2O 6 μL）。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。

使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，用DNA純化試劑盒（北京全式金生物有限公司）對(duì)目的片段進(jìn)行回收，回收得到的產(chǎn)物連接pMD19-T simple vector［寶生物工程（大連）有限公司］并轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（北京擎科生物科技有限公司），經(jīng)驗(yàn)證陽(yáng)性后，將菌液送至華大生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 煙草NtCAD蛋白生物信息學(xué)分析

ORF（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）分析煙草NtCAD的基因序列，ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分 析NtCAD蛋 白 的 蛋 白序列，PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件，SMART軟 件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）分析NtCAD蛋白的結(jié)構(gòu)域，Protscale軟件（https://web.expasy.org/protscale/）分析NtCAD蛋白的親水性及疏水性，PSORT軟件（https://www.genscript.com/psort.html）分析NtCAD蛋白的亞細(xì)胞定位，PSIPRED軟 件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測(cè)NtCAD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，SWISS-MODEL軟件（http：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測(cè)NtCAD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使用NCBI Blast在線工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行CAD核酸和氨基酸序列的同源性比對(duì)并下載相關(guān)序列，使用MEGA 7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用DNAMAN軟件對(duì)CAD氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 煙草NtCAD基因表達(dá)分析

以煙草盛花期不同組織和不同條件處理下的cDNA為模板，用qPCR方法分析NtCAD基因的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)NtCAD基因序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（上游：5'-TCTGATGGCAAACCTACCCA A-3'，下游：5'-TTCAATGGGCTGTACACTGTC-3'）。反應(yīng)總體系20 μL（cDNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，10 μL qPCR SuperMix，6 μL ddH2O）。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性5 s，60℃退火20 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3次生物學(xué)重復(fù)，相對(duì)表達(dá)量用2-△△CT公式計(jì)算［26］。分別以成熟葉葉片和不同處理0 h為對(duì)照（表達(dá)量設(shè)為1），該基因在不同組織或不同處理時(shí)間的表達(dá)量與對(duì)照組的比值為該基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草NtCAD基因克隆

以煙草幼苗cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增，切膠回收，驗(yàn)證克隆后得到1條單一條帶，長(zhǎng)度約為1 200 bp左右的，與預(yù)期的PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度一致（圖1）。測(cè)序得到一條全長(zhǎng)為1 074 bp的CDS序列，編碼357個(gè)氨基酸。

圖1 NtCAD基因的PCR電泳圖Fig.1 PCR electrophoretogram of NtCAD gene

2.2 煙草NtCAD蛋白生物信息學(xué)分析

利用NCBI Blastp對(duì)克隆得到基因的氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，結(jié)果顯示其與牽?；ǎ↖pomoea nil）、咖啡（Coffea arabica）的CAD氨基酸序列相似性分別為86.80%和84.31%，所以將其命名為NtCAD。

利用MEGA 7.0用鄰接法構(gòu)建NtCAD和其他物種的CAD氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果顯示：NtCAD與辣椒（Capsicum annuum）CaCAD、三 裂 葉 薯（Ipomoea triloba）ItCAD和 牽 牛 花（Ipomoea nil）InCAD的親緣關(guān)系最為接近。進(jìn)化樹顯示NtCAD屬于GroupⅠ（第一類），該類基因直接參與并促進(jìn)木質(zhì)素的合成。

圖2 植物CAD同源蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of plant CAD homologous proteins

用SMART在線軟件對(duì)NtCAD進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域檢測(cè)，顯示NtCAD具有一個(gè)完整的醇脫氫酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)輔酶分子結(jié)構(gòu)域。用DNAMAN對(duì)煙草NtCAD和其他物種CADs氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果顯示：不同物種CAD氨基酸序列均存在Zn離子催化位點(diǎn)［Zn1，GHE（X）2G（X）5G（X）2V］、Zn離子結(jié)合位點(diǎn)［Zn2，GD（X）10C（X）2C（X）2（X）7C］和NADPH輔酶結(jié)合位點(diǎn)即［G（X）GGV（L）］保守的功能結(jié)構(gòu)域（圖3）。說(shuō)明CAD在不同的物種中，其底物結(jié)合位點(diǎn)均具有保守性。

圖3 不同植物CAD蛋白序列的比對(duì)Fig.3 Alignment of CAD protein sequences in different plants

分析發(fā)現(xiàn)NtCAD預(yù)測(cè)蛋白分子量為38.99 kDa，等電點(diǎn)為5.54，共有44個(gè)氨基酸殘基（Asp+Glu）帶負(fù)電荷、35個(gè)氨基酸殘基（Arg+Lys）帶正電荷。預(yù)測(cè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為26.87%，表明NtCAD蛋白為穩(wěn)定性蛋白。其親水最大值為-2.800，疏水最大值為2.433，表明該蛋白為親水性蛋白。預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)中。

NtCAD蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其主要由23.81%的α-螺旋、43.14%的不規(guī)則卷曲、8.12%的β-轉(zhuǎn)角和24.93%的延伸鏈構(gòu)成（圖4）。NtCAD和AtCAD5的氨基酸序列相似性78.65%，以擬南芥AtCAD5蛋白為模板，用SWISS-MODEL對(duì)NtCAD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，得到該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)圖（圖5）。在擬南芥木質(zhì)素的合成過(guò)程中AtCAD4和AtCAD5起關(guān)鍵作用［8］，推測(cè)NtCAD也具備和AtCAD5相似的功能。

圖4 NtCAD蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Secondary structure prediction on NtCAD protein

圖5 NtCAD蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Tertiary structure prediction on NtCAD protein

2.3 煙草NtCAD基因表達(dá)分析

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析煙草盛花期NtCAD基因在不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)盛花期不同組織中NtCAD基因均有表達(dá)，花蕾、側(cè)根和須根中NtCAD的表達(dá)量較高，葉片（成熟葉）和莖（莖稈、莖節(jié)）中的表達(dá)量相對(duì)較低（圖6）。

圖6 NtCAD基因在煙草盛花期不同組織中的表達(dá)Fig.6 Expression of NtCAD gene in different tissues at full-bloom stage of tobacco

通過(guò)分析煙草NtCAD基因啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)NtCAD啟動(dòng)子區(qū)域含有參與低溫（LTR）和脫落酸（ABA）應(yīng)答的順式作用元件。低溫（4℃）處理3 h，NtCAD基因的表達(dá)量顯著升高，處理12 hNtCAD基因的表達(dá)量最高，和對(duì)照比上升了5.04倍（圖7A）。激素ABA處理后，NtCAD基因的表達(dá)量呈周期性變化趨勢(shì)，3 h表達(dá)量較對(duì)照值顯著升高，6 h和12 h有所下降，24 h表達(dá)量顯著升高，和對(duì)照比上升了1.97倍（圖7B）。

圖7 NtCAD基因在不同處理下的表達(dá)Fig.7 Expression of NtCAD gene under different treatments

3 討論

從煙草中克隆得到的NtCAD基因CDS長(zhǎng)1 074 bp，共編碼357個(gè)氨基酸。NtCAD氨基酸序列具有CAD基因保守的結(jié)構(gòu)域，其蛋白三維結(jié)構(gòu)和底物結(jié)合位點(diǎn)也具有高度保守性［17］。NtCAD與擬南芥AtCAD4、AtCAD5在進(jìn)化上屬于同一分支，親緣關(guān)系較近，均屬于GroupⅠ類基因［14］，該類CAD基因能夠直接調(diào)控木質(zhì)素的合成［18］。

NtCAD基因在煙草盛花期各個(gè)組織中都有表達(dá)，但在花蕾和根中的表達(dá)量相對(duì)較高，在莖和葉片的表達(dá)量相對(duì)較低。此外，在其他植物中也發(fā)現(xiàn)CAD基因存在組織特異性表達(dá)的情況，例如擬南芥AtCAD4基因在根中的表達(dá)量較高，莖中的表達(dá)量相對(duì)較低，AtCAD5在木質(zhì)化程度較高的擬南芥根部具有較高的表達(dá)量［20,27］；高粱SbCAD在莖中的表達(dá)量較高，葉片中幾乎不表達(dá)［28］；馬尾松CAD基因在側(cè)枝中表達(dá)量最高，根，葉和芽的表達(dá)量較低［29］；胡蘿卜DcCAD基因在葉片中的表達(dá)量顯著高于葉柄和根［30］，推測(cè)與這與CAD基因的功能多樣性有關(guān)。

對(duì)煙草NtCAD基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其有響應(yīng)低溫和ABA處理的順式作用元件。

對(duì)煙草幼苗進(jìn)行低溫和ABA處理，兩種處理均能上調(diào)NtCAD基因的表達(dá)，說(shuō)明NtCAD基因可以響應(yīng)非生物脅迫。丹參SmCAD的表達(dá)可以被茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)［31］；胡蘿卜DcCAD基因在低溫（4℃）處理2 h后，表達(dá)量顯著升高［30］；甘薯IbCAD1的表達(dá)可被ABA、水楊酸（SA）和MeJA誘導(dǎo)［32］。推測(cè)不同的CAD基因，對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)不同。

4 結(jié)論

從煙草K326中采用基因克隆方法得到NtCAD基因，系統(tǒng)發(fā)育以及蛋白結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示其屬于CAD基因GroupⅠ。NtCAD基因的表達(dá)具有特異性，在煙草盛花期的花蕾和根中的表達(dá)量較高。低溫和ABA處理能夠誘導(dǎo)NtCAD的表達(dá)，說(shuō)明該基因還參與煙草非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程。