HGF/Met/JNK信號通路介導的細胞自噬在肝硬化癌變進程中的作用

彭全斌,朱書淵,汪望月

彭全斌,朱書淵,麗水市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省麗水市 323000

汪望月,浙江省人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市 310014

0 引言

肝硬化是由酒精性肝病和慢性肝炎等肝病引起的彌漫性的慢性肝損傷，若不及時治療，可進一步發(fā)展為肝癌，這是慢性肝病的自然過程.目前對于肝硬化進展為肝癌的細胞和分子機制知之甚少.近年研究發(fā)現(xiàn)，肝癌干細胞樣細胞（hepatocarcinoma stem cell-like cells，CSCs）具有較強的自我更新和腫瘤發(fā)生能力，在肝硬化進展至肝癌的進程發(fā)揮關鍵作用[1].研究顯示[2，3]，Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導通路可能參與維持了正常干細胞的自我更新和祖細胞的增殖或分化，而Axin2作為靶基因，在信號級聯(lián)反應中起負調(diào)節(jié)因子的作用.學者研究發(fā)現(xiàn)[4]，Wnt信號維持的肝Axin2+細胞具有自我更新的能力并發(fā)揮肝干細胞的作用，而若Axin2基因敲除或發(fā)生突變將促進或維持肺癌[5]、卵巢癌[6]、骨肉瘤[7]和肝癌[8]中的癌癥干細胞樣特征.因此，我們推測肝臟Axin2+細胞可能作為肝硬化進展為肝癌過程中的肝臟CSCs的重要標志物.

自噬是細胞生長、發(fā)育、成熟和分化的重要生理過程，在細胞處于應激狀態(tài)時，可產(chǎn)生細胞內(nèi)營養(yǎng)、生長因子和能量，以支持細胞存活，若營養(yǎng)缺乏，缺氧或缺血[9]等應激狀態(tài)持續(xù)存在，可導致細胞的死亡.研究發(fā)現(xiàn)[10]，細胞自噬過程中所產(chǎn)生的細胞因子或生長因子可獨立激活內(nèi)源性信號刺激細胞繁殖和增殖，甚至促進細胞干性.由于肝硬化、肝細胞纖維化等病理變化不斷損傷肝細胞[11]，可導致細胞的異常自噬.因此，自噬可能在肝硬化進展為肝癌過程中發(fā)揮重要作用.

研究表明[12，13]，分化簇90（cluster of differentiation 90，CD90）被證實是肝臟CSCs更穩(wěn)定的標志物.因此，在本研究中，我們將肝臟Axin2+CD90+細胞鑒定為肝硬化的CSCs，并觀察了肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/Met/JNK信號通路介導的細胞自噬在肝硬化進展至肝癌期間的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 從肝血管瘤患者中共收集8例非肝硬化手術(shù)標本和血樣;2007-09，在本院收集了18例酒精相關，30例慢性乙型肝炎相關肝硬化活檢樣本.這些患者隨訪至2015-12.來自患者的3例外科肝癌樣本與酒精相關的肝硬化，通過手術(shù)收集來自乙型肝炎相關肝硬化患者的8個肝癌樣本.這些組織樣品立即用于隨后的實驗，或者在活組織檢查或手術(shù)切除后固定在多聚甲醛和石蠟包埋中.根據(jù)世界衛(wèi)生組織標準進行肝癌的組織病理學診斷.排除纖維板層肝癌，膽管癌和合并肝膽管癌.本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準.從每位患者獲得書面知情同意書.

1.2 方法

1.2.1 動物模型:為了建立肝硬化至肝癌進展的模型，8 wk齡雄性Sprague Dawley大鼠每周兩次腹膜內(nèi)注射50 mg/kg二乙基亞硝胺（N0258-1G;美國Sigma-Aldrich公司），持續(xù)8 wk.給大鼠喂食常規(guī)飲食4 wk.對大鼠進行活組織檢查以評估肝硬化和自噬狀態(tài)的存在.大鼠也接受c-Met抑制劑Tepotinib（EMD1214063，15 mg/kg;Selleck），每周兩次通過腹膜內(nèi)注射給藥4 wk.在適當?shù)那闆r下，將一組正常大鼠或具有媒介物注射的大鼠作為對照.在最終處理后，在另外8 wk和11 wk時間點的觀察后殺死大鼠.整個實驗期為20 wk.

1.2.2 流式細胞術(shù):取小塊肝組織（1 mm3）在超凈臺中采用2 mL無菌注射器的推動桿于10 cm培養(yǎng)皿中進行研磨后，經(jīng)過40 μm的濾網(wǎng)過濾后，PBS洗滌兩遍后用于流式上機.使用BD Accuri C6（美國BD Biosciences公司）通過流式細胞術(shù)測定人Axin2+CD90+，Axin2+CD133+和Axin2+Epcam+細胞.來自每種類型的人肝硬化肝臟的Axin2+和Axin2-細胞被分類并在體外進一步分析.

1.2.3 球囊細胞形成測定:分選的人Axin2+CD90+，Axin2+CD90-和Axin2-CD90-細胞以1000個細胞/孔的密度在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)/F12培養(yǎng)基（美國HyClone公司）補充2%B27（美國Invitrogen公司），100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，20 ng/mL表皮生長因子和20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子（美國PeproTech公司）使用超低附著六孔板（美國Corning公司）2 wk.每3 d將細胞暴露于新鮮培養(yǎng)基中.計算形成的直徑＞75 μm的球體.

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡:自噬標記物微管相關蛋白輕鏈（microtubule-associated protein light chain，LC3）-I/LC3-Ⅱ和P62及肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）表達通過蛋白質(zhì)印跡在上述分選的細胞和不同的人和大鼠肝臟樣品中檢測，有或沒有處理.還進行蛋白質(zhì)印跡以檢測上述分選細胞Met和JNK的磷酸化.

1.2.5 免疫組化及細胞凋亡分析:在最后一次處理后4 wk（最后一次二乙基亞硝胺注射后12 wk），切割具有不同自噬狀態(tài)和不同處理的4 μm厚的大鼠肝硬化肝臟橫切面，并進行TUNEL（中國南通碧云天生物技術(shù)研究所）和Ki-67（碧云天）染色.

統(tǒng)計學處理樣本量通過使用網(wǎng)站上的兩個比例比較公式計算:http://powerandsamplesize.com/Calculators/.所有數(shù)據(jù)均以mean±SD表示.在用Bartlett檢驗證明方差同質(zhì)性之后，使用單向方差分析，然后在適當?shù)那闆r下使用Student-Newman-Keuls檢驗來評估統(tǒng)計學顯著性.P＜0.05的值被認為是統(tǒng)計學上顯著的.所有實驗至少重復三次.

2 結(jié)果

2.1 肝硬化進展為肝癌與異常自噬有關 我們首先通過Western-blotting檢測了不同肝硬化和進展為肝癌的肝硬化標本的自噬水平的變化，結(jié)果如圖1所示，從圖中可見，相較于正常肝組織對照，肝硬化患者的自噬水平顯著升高（全部P＜0.05），而自噬水平的下降與肝硬化進展為肝癌有關.這些結(jié)果顯示在肝硬化進展為肝癌期間，Axin2+細胞向Axin2+CD90+細胞的轉(zhuǎn)變與異常自噬有關.Axin2/增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）+CD90+細胞存在于具有異常自噬的人肝硬化樣本中，其進一步發(fā)展成維持Axin2/EGFP+CD90+細胞的肝癌.

圖1 Western-blotting分析人肝硬化樣本的自噬水平. A:在肝硬化進展為肝癌期間自噬相關蛋白的蛋白表達條帶圖;B:自噬相關蛋白表達量的柱形圖.LC3-Ⅱ:微管相關蛋白輕鏈;1:正常肝組織;2:酒精性肝硬化肝組織;3:乙肝肝硬化肝組織;4:因酒精性肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織;5:因乙肝肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織.aP＜0.05,與正常對照組織比較;bP＜0.05,與因酒精性肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織比較;cP＜0.05,與因乙肝肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織比較.

2.2 自噬依賴性HGF表達是肝硬化的參與者 我們進一步通過Western-blotting分析上述人肝硬化樣本的HGF水平.結(jié)果如圖2所示，根據(jù)肝硬化中的自噬狀態(tài)首先對所有樣品進行分層，發(fā)現(xiàn)肝硬化異常自噬樣本中HGF的產(chǎn)生顯著增加.這些結(jié)果顯示自噬依賴性HGF表達是肝硬化中產(chǎn)生Axin2+CD90+細胞所必需的.

圖2 Western-blotting分析人肝硬化樣本的HGF水平. HGF:肝細胞生長因子.1:正常肝組織;2:酒精性肝硬化肝組織;3:乙肝肝硬化肝組織;4:因酒精性肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織;5:因乙肝肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織.aP＜0.05,與正常對照組織比較;bP＜0.05,與因酒精性肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織比較;cP＜0.05,與因乙肝肝硬化轉(zhuǎn)化的肝細胞癌肝組織比較.

2.3 自噬相關HGF/Met/JNK信號通路用于在肝硬化中將Axin2+細胞轉(zhuǎn)變成Axin2+CD90+細胞 我們通過Western-blotting分析不同種類人肝硬化樣本的自噬相關的HGF/Met/JNK途徑分子水平，結(jié)果如圖3所示，從圖中可見，Axin2-細胞和Axin2+細胞從不同類型的人肝硬化肝臟中分選，所述肝硬化肝臟根據(jù)自噬狀態(tài)和HGF表達首先分層后發(fā)現(xiàn)p-Met、t-Met及p-JNK在水平在自噬增強的Axin2陽性細胞中顯著升高（全部P＜0.05）.自噬相關的HGF/Met/JNK信號通路用于在肝硬化中將Axin2+細胞轉(zhuǎn)變成Axin2+CD90+細胞.

圖3 Western-blotting分析不同種類人肝硬化樣本的自噬相關的HGF/Met/JNK途徑分子水平.A:酒精性肝硬化肝組織中自噬相關蛋白及HGF/Met/JNK信號途徑相關蛋白的表達;B:乙肝肝硬化肝組織中自噬相關蛋白及HGF/Met/JNK信號途徑相關蛋白的表達;aP＜0.05,與空白對照;bP＜0.05,與Anxin+自噬未激活細胞比較.HGF:肝細胞生長因子.

2.4 c-Met抑制劑EMD1214063能夠?qū)Ω斡不笫蟀l(fā)揮治療效應 我們進一步建立大鼠肝硬化模型后，采用c-Met抑制劑EMD1214063干預肝硬化大鼠，結(jié)果如圖4所示，Ki-67染色顯示，治療8 wk和11 wk后細胞增殖顯著減少（全部P＜0.05），而TUNEL染色的結(jié)果顯示細胞的c-Met抑制劑EMD1214063對肝細胞的凋亡并無明顯影響.

圖4 EMD1214063在肝硬化大鼠模型中治療8 wk和11 wk后減少細胞增殖.A:肝組織的Ki-67染色及TUNEL染色圖片;B:肝組織Ki-67染色的陽性細胞計數(shù)圖;C:TUNEL染色的細胞凋亡計數(shù)圖.aP＜0.05與對照大鼠比較.

2.5 EMD1214063抑制肝硬化大鼠模型中的HGF/Met/JNK信號傳導 我們采用Western印跡分析第8周和第11周肝硬化大鼠肝組織中HGF/Met/JNK信號通路的表達，結(jié)果顯示，p-Met、p-JNK及HGF在11 wk的大鼠中顯著降低，而t-Met、p-JNK及HGF在8 wk的大鼠中顯著降低（圖5）.

圖5 EMD1214063抑制肝硬化大鼠模型中的c-MET信號傳導. A:肝硬化大鼠肝組織c-MET信號傳導途徑相關蛋白的表達條帶圖;B:p-Met蛋白相對表達量的柱形圖;C:t-Met蛋白相對表達量的柱形圖;D:p-JNK及總JNK蛋白相對表達量的柱形圖;E:HGF蛋白相對表達量的柱形圖.HGF:肝細胞生長因子;JNK:c-Jun氨基末端激酶.aP＜0.05與對照大鼠比較.

3 討論

肝硬化對肝癌的發(fā)生具有很高的風險.在這項研究中，我們通過確定肝硬化肝臟中肝臟CSC樣細胞的起源，提出了從肝硬化到肝癌的新進展.我們發(fā)現(xiàn)肝Axin2/EGFP+CD90+細胞來源于Axin2/EGFP+細胞，在具有異常自噬的人和大鼠肝硬化肝臟中獲得CSC特性，并促成肝癌發(fā)生.由于HGF表達的增加或減少，肝硬化肝臟中自噬的誘導或抑制通過誘導或減少來自Axin2/EGFP+細胞的肝Axin2/EGFP+CD90+細胞的產(chǎn)生來促進或預防肝癌發(fā)生.進一步的細胞學實驗顯示肝硬化中自噬依賴性HGF表達激活肝Axin2/EGFP+細胞中的Met/JNK信號傳導，導致向Axin2/EGFP+CD90+CSC樣細胞的轉(zhuǎn)變.HGF敲低或抑制肝硬化中Met/JNK傳導的活化阻止了Axin2/EGFP+CD90+細胞的形成和進一步的肝癌發(fā)生.我們的研究結(jié)果表明，在肝硬化中CSCs產(chǎn)生的機制中，HGF/Met/JNK的自噬依賴性激活在肝癌發(fā)生中起著至關重要的作用，破壞該過程可提供一種有希望的治療方法來預防肝硬化進展為肝癌.

肝臟CSC是癌細胞的一小部分，表達干細胞相關轉(zhuǎn)錄因子Sox2和Oct4，具有自我更新，分化和腫瘤發(fā)生的強大能力[1].目前，肝臟CSCs起源的機制及其在肝癌發(fā)生中的作用尚不清楚.理論上推測肝臟CSCs起源于正常干細胞[13]，最近的一項研究表明，肝臟Axin2+細胞可以自我更新以響應Wnt/β-連環(huán)蛋白刺激[4].在本研究中，我們使用肝硬化分選肝細胞.干性反應標記物Axin2，以及充分記錄的CSC標記物CD90，其在肝臟CSC中顯示穩(wěn)定表達，在不同細胞系中不變[13].我們發(fā)現(xiàn)這些肝臟Axin2+CD90+細胞表達高水平的Sox2和Oct4并且能夠在體外形成球體以及在體內(nèi)產(chǎn)生腫瘤異種移植物.此外，與具有很少或沒有Axin2+CD90+細胞的肝硬化肝臟相比，具有高百分比的肝Axin2+CD90+細胞的肝硬化肝臟進展為肝癌.此外，這些Axin2+CD90+細胞也存在于腫瘤異種移植物和肝癌組織中，其表現(xiàn)出CSC的不對稱自我更新分裂性狀[14].除了從Axin2Cre獲得的肝EGFP+CD90+細胞獲得的類似結(jié)果之外:Rosa26EGFP具有EGFP標記的Axin2細胞的肝硬化大鼠肝臟，減少大鼠肝硬化中EGFP+CD90+細胞數(shù)量的治療顯著阻止肝癌發(fā)生.這些發(fā)現(xiàn)表明肝臟Axin2+CD90+細胞在肝硬化進展為肝癌期間承擔CSC的責任.

目前的研究進一步證明肝硬化中Axin2+細胞產(chǎn)生的肝Axin2+CD90+細胞依賴于Met/JNK信號傳導的激活.以往的研究表明，JNK和STAT3信號傳導對于平滑肌肉瘤的腫瘤發(fā)生，膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新[18]和非小細胞肺癌的CSC特性至關重要[15].但是，我們發(fā)現(xiàn)Met的活化作為上游受體酪氨酸激酶對于激活下游JNK信號傳導并誘導Axin2/EGFP+細胞中的CD90表達至關重要.通過藥理學抑制劑抑制肝硬化中的Met/JNK信號傳導能夠減少分選的肝Axin2/EGFP+細胞向Axin2/EGFP+CD90+細胞的轉(zhuǎn)變并預防肝癌發(fā)生.盡管Wnt/β-catenin信號在多種癌癥中全面參與誘導和維持CSC表型[16，17]，之前的研究發(fā)現(xiàn)β-catenin在肝Axin2/EGFP+CD90-細胞和Axin2/EGFP+CD90+中均有顯著表達.來自肝硬化的細胞和β-連環(huán)蛋白表達不受磷酸化Met的調(diào)節(jié)，表明肝Axin2/EGFP+細胞向Axin2/EGFP+CD90+細胞轉(zhuǎn)變不需要Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導.相反，Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導是正常肝臟中肝臟Axin2+細胞自我更新所必需的[4]，并且β-連環(huán)蛋白在Axin2/EGFP-細胞中不表達，但在Axin2/EGFP+細胞中表達，仍然表現(xiàn)出一定程度Sox2和Oct4的表達和克隆性，表明Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導負責維持Axin2+細胞的正常干性特征，并且Met/JNK信號傳導負責Axin2/EGFP+CD90+細胞在肝臟中的肝硬化和致瘤性.雖然Axin2的表觀遺傳失調(diào)會通過調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導而影響CSC樣性狀，但之前研究的數(shù)據(jù)也表明[5，6]，在沒有失調(diào)的情況下，Axin2/β-catenin信號為其他信號提供了干細胞背景.產(chǎn)生肝臟CSC.此外，除了在肝Axin2/EGFP-細胞中不存在Met磷酸化之外，肝Axin2/EGFP-細胞中的Met表達也顯著低于Axin2/EGFP+細胞中的Met表達.該發(fā)現(xiàn)表明，Met的充分表達可能是其磷酸化和下游JNK信號傳導的激活的先決條件，以誘導Axin2/EGFP+細胞向Axin2/EGFP+CD90+細胞的轉(zhuǎn)變.

LC3被認為是自噬的標志，其作為可溶性LC3-Ⅰ和脂質(zhì)化LC3-Ⅱ存在.LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為LC3-Ⅱ并在自噬體與溶酶體融合后降解.因此，LC3-Ⅱ是LC3的可靠標記，并且LC3-Ⅱ的量與自噬體的數(shù)量相關，其能夠用于預測自噬活性[18].之前Lee等人[19]的研究顯示LC3能夠用于肝癌的預測.另外，自噬銜接蛋白p62能夠用于識別泛素化蛋白聚集體，并通過與LC3的結(jié)合將它們與自噬體聯(lián)系起來，而自噬體是選擇性自噬過程中溶酶體降解所必需的載貨過程.有研究顯示[20]p62參與到肝癌的發(fā)生發(fā)展調(diào)控中.

HGF是Met磷酸化的配體.我們的結(jié)果顯示Met和下游JNK和STAT3都在來自肝硬化的Axin2/EGFP+細胞中被磷酸化，具有顯著的HGF表達.通過shRNA干擾抑制肝硬化肝臟中HGF的表達，有效抑制EGFP+細胞中的Met和JNK磷酸化，消除其向EGFP+CD90+細胞的轉(zhuǎn)變，減少肝癌發(fā)生，表明肝硬化肝臟中EGFP+CD90+CSCs的產(chǎn)生和肝癌的發(fā)生.HGF/Met/JNK依賴性方式.肝臟Axin2/EGFP-和Axin2/EGFP+細胞中的β-連環(huán)蛋白表達不受肝硬化中HGF表達的調(diào)節(jié)，這進一步暗示HGF/Met/JNK信號傳導是造成腫瘤發(fā)生過程中致瘤性的主要原因.Axin2+CD90+CSCs在肝硬化中的作用.然而，肝臟Axin2+/EGFP+細胞中HGF/Met/JNK信號傳導的激活以及隨后轉(zhuǎn)變成Axin2+/EGFP+CD90+細胞依賴于肝硬化中的自噬.由于病理改變，肝硬化肝臟患有慢性營養(yǎng)不良損傷[11]，導致自噬，通過營養(yǎng)和生長因子的產(chǎn)生支持細胞存活對抗營養(yǎng)[9]我們發(fā)現(xiàn)異常自噬的誘導來影響肝硬化肝臟[21].自噬存在能夠進一步誘導肝硬化肝臟中HGF的表達.肝硬化中的自噬缺乏抑制了HGF表達，然后未能激活Axin2+細胞中的Met/JNK信號傳導.最重要的自噬缺陷或干擾通過抑制HGF/Met/JNK信號通過抑制Axin2+CD90+CSCs的產(chǎn)生，有效地預防肝硬化中的肝癌發(fā)生，支持自噬誘導促進腫瘤性肝結(jié)節(jié)的觀點[22].

4 結(jié)論

本研究存在一定的不足，由于研究時間較短，很難在短期內(nèi)收集到大量的病例，由于大部分患者均為手術(shù)切除病例，部分活檢病例在實驗前均經(jīng)患者及家屬同意進行取樣，因此，組織樣本量是足夠進行實驗，由于但樣本數(shù)量較少，可能會對實驗結(jié)果造成偏倚，在下一步的研究中我們將進一步擴大病例數(shù)進行研究.

總之，HGF/Met/JNK信號通路介導的細胞自噬參與到肝硬化癌變進程中，并且c-Met抑制劑能夠在肝硬化進程中發(fā)揮治療作用.

文章亮點

實驗背景

肝硬化是由酒精性肝病和慢性肝炎等肝病引起的彌漫性的慢性肝損傷，若不及時治療，可進一步發(fā)展為肝癌，這是慢性肝病的自然過程.目前對于肝硬化進展為肝癌的細胞和分子機制知之甚少.

實驗動機

自噬在肝硬化進展至肝癌的病理進程中發(fā)揮重要作用，探求其具體發(fā)病機制，為肝癌的防治提供新的靶點.

實驗目標

觀察肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）/Met/JNK信號通路介導的細胞自噬在肝硬化進展至肝癌期間的作用，旨在探求肝硬化進展至肝癌的發(fā)病機制.

實驗方法

選擇非肝硬化手術(shù)標本及酒精相關、慢性乙型肝炎相關肝硬化活檢樣本及外科肝癌樣本，同時，運用二乙基亞硝胺建立大鼠肝硬化模型，并運用EMD1214063干預.Western-blotting檢測人和大鼠肝組織自噬狀態(tài)、HGF的水平及HGF/Met/JNK信號途徑分子的變化.評估大鼠肝組織中細胞增殖和凋亡.

實驗結(jié)果

肝硬化肝臟根據(jù)自噬狀態(tài)和HGF表達首先分層后發(fā)現(xiàn)p-Met、t-Met及p-JNK在水平在自噬增強的Axin2陽性細胞中顯著升高（全部P＜0.05）.p-Met、p-JNK及HGF在11 wk的大鼠中顯著降低，而t-Met、p-JNK及HGF在8 wk的大鼠中顯著降低.

實驗結(jié)論

HGF/Met/JNK信號通路介導的細胞自噬與肝硬化癌變進程密切相關，且c-Met抑制劑能夠在肝硬化進程中發(fā)揮治療作用.

展望前景

HGF/Met/JNK信號通路介導的細胞自噬可能是肝硬化癌變進程中的重要機制，并且c-Met抑制劑可能為防治肝硬化進展至肝癌提供了新的藥物選擇.