外泌體在胰腺癌診療應(yīng)用中的研究進(jìn)展

李宗倍,李華志,郭春海,崔宏力

李宗倍,李華志,郭春海,崔宏力,清華大學(xué)附屬垂楊柳醫(yī)院普外科 北京市 100022

0 引言

長(zhǎng)期以來(lái)細(xì)胞間相互作用的主要方式為受體和配體的相互作用或直接的細(xì)胞間相互作用.1987年Johnstone等[1]在研究機(jī)體紅細(xì)胞轉(zhuǎn)變過(guò)程中，在細(xì)胞外發(fā)現(xiàn)了一種由網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)囊泡小體，其參與介導(dǎo)細(xì)胞間的廣泛信息傳遞，將其命名為外泌體;外泌體可由源自機(jī)體多種不同類型細(xì)胞釋放，遍布于血液、尿液、腦脊液、唾液等體液中;在腫瘤微環(huán)境中外泌體的含量尤為豐富，其內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、免疫逃逸、微環(huán)境建立等密切相關(guān)[2，3]，近年來(lái)由其介導(dǎo)的新的細(xì)胞間信息傳遞和物質(zhì)交換途徑越來(lái)越受到學(xué)者們的關(guān)注.

1 外泌體在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制

在生理?xiàng)l件下，外泌體作為細(xì)胞間信號(hào)傳遞的主要調(diào)節(jié)因子，起到促進(jìn)細(xì)胞間信號(hào)傳遞的作用.在病理?xiàng)l件中，這種信號(hào)傳遞機(jī)制對(duì)于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有其特殊性.（1）胰腺癌微環(huán)境中包含大量間質(zhì)組織，約占總體積的90%[4].大量的間質(zhì)組織使胰腺癌細(xì)胞處于高度免疫抑制狀態(tài)，利于胰腺癌細(xì)胞的免疫逃逸和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5].胰腺星狀細(xì)胞（pancreatic stellate cells，PSCs）是一種重要的胰腺間質(zhì)細(xì)胞，最初處于靜息狀態(tài)，當(dāng)受到外界刺激后可轉(zhuǎn)化為活化狀態(tài)的肌成纖維細(xì)胞，而肌成纖維細(xì)胞可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及刺激腫瘤血管生成[6];（2）腫瘤源性外泌體一方面可通過(guò)改變基質(zhì)細(xì)胞靶點(diǎn)和表型，如正常的成纖維細(xì)胞向腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）轉(zhuǎn)變，繼而形成了有利于腫瘤生成的微環(huán)境[7];另一方面可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期基因、黏附分子、趨化因子配體、血管形成等基因mRNA的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移前微環(huán)境[8].此外肝臟庫(kù)普弗細(xì)胞通過(guò)攝取來(lái)自胰腺癌的富含巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）的外泌體，進(jìn)而激活纖維化途徑，亦可形成支持胰腺癌轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[9];（3）腫瘤源性外泌體可破壞并重構(gòu)血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)促使腫瘤細(xì)胞侵入血液循環(huán)或生成新生腫瘤血管，而達(dá)到遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[10];（4）外泌體參與機(jī)體內(nèi)多種生理過(guò)程的調(diào)控和免疫監(jiān)視，在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著不可或缺的作用[11];（5）Ostenfeld等[12]研究發(fā)現(xiàn)高轉(zhuǎn)移潛能腫瘤源性外泌體富含腫瘤抑制的miRNA，腫瘤細(xì)胞通過(guò)舍棄外泌體內(nèi)的抑癌基因，從而獲得轉(zhuǎn)移潛能.

2 胰腺癌的外泌體腫瘤標(biāo)志物

CA-199作為胰腺癌的腫瘤標(biāo)志物由來(lái)已久，然而其特異性與靈敏性均較低.外泌體內(nèi)包含宿主細(xì)胞所特有的生物活性物質(zhì)，可反映來(lái)源細(xì)胞的病理生理狀況，且腫瘤源性外泌體所負(fù)載的信息物質(zhì)和正常細(xì)胞源性外泌體間存在較大差異[13]，當(dāng)腫瘤源性外泌體攜帶有宿主細(xì)胞的致癌特異性物質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)中，通過(guò)檢測(cè)此類外泌體上的特異性腫瘤信號(hào)物質(zhì)，有望成為診斷胰腺癌的特異血清學(xué)標(biāo)志物.

2.1 外泌體來(lái)源蛋白 美國(guó)研究者M(jìn)elo等[14]研究發(fā)現(xiàn)腫瘤源性外泌體表面特異性地聚集著一種蛋白多糖磷脂酰肌醇聚糖-1（glypican-1，GPCI），在胰腺癌患者的血液中也可檢測(cè)到GPCI陽(yáng)性的外泌體，且具有較高的特異性和敏感性，并借此可與健康人群和胰腺良性疾病患者進(jìn)行區(qū)分[15].

2.2 外泌體來(lái)源基因 Zhang等[16]研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌患者血液中的外泌體含有大量腫瘤遺傳信息物質(zhì)，涵蓋了基因拷貝數(shù)擴(kuò)增、基因突變和基因融合，經(jīng)過(guò)富集提純后，腫瘤源性外泌體中的突變基因如KRAS、TP53、CDKN2A、SMAD4的檢測(cè)靈敏度高于血中游離腫瘤DNA的檢測(cè);PSCs釋放的含有miR-21的外泌體，可通過(guò)促進(jìn)胰腺癌上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，進(jìn)而增強(qiáng)其增殖能力[17-19];Que等[20]在研究胰腺癌患者血清外泌體時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-17-5p基因的表達(dá)水平高于正常對(duì)照組;因此，通過(guò)檢測(cè)胰腺癌患者血清中外泌體內(nèi)的特異基因表達(dá)水平，有望成為檢測(cè)胰腺癌的一種潛在的非侵襲性診斷和篩選方式.

此外，選擇敏感的蛋白和miRNA標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可提高胰腺癌早期診斷的特異性和靈敏度.研究表明，由5種蛋白質(zhì)（CD44v6、Tspan8、EpCAM、MET和CD104）和4種miRNAs（miR-1246、miR4644、miR-3976和miR-430）的組合在區(qū)分胰腺癌患者、急慢性胰腺炎患者和胰腺良性腫瘤患者中的敏感性為1.00，特異性為0.80[21].

3 胰腺癌高危因素與外泌體的關(guān)系

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）主要起源于胰腺導(dǎo)管上皮，其病因復(fù)雜、早期診斷困難、手術(shù)切除率低，對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，長(zhǎng)期以來(lái)困擾著臨床醫(yī)生，因此探索病因、關(guān)注高危人群、收集少見(jiàn)病例、分析誤診原因等是提高胰腺癌早期診斷率的重要方式.在中華醫(yī)學(xué)會(huì)胰腺外科學(xué)組發(fā)布的《中國(guó)胰腺癌診治指南（2021）》中指出，與胰腺癌發(fā)生相關(guān)的危險(xiǎn)因素主要有肥胖、2型糖尿病、吸煙、酗酒等，其中5-10%患者存在遺傳易感性[22].

長(zhǎng)期吸煙、酗酒等均可導(dǎo)致正常胰腺細(xì)胞產(chǎn)生不同程度的應(yīng)激反應(yīng)，研究表明[23]，當(dāng)正常胰腺細(xì)胞受到內(nèi)環(huán)境變化影響時(shí)，可通過(guò)釋放外泌體對(duì)應(yīng)激反應(yīng)作出相應(yīng)應(yīng)答，且釋放的外泌體組成、功能等與受應(yīng)激因素有關(guān)，以此來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞間信息傳遞.當(dāng)胰腺細(xì)胞長(zhǎng)期持續(xù)處于應(yīng)激狀態(tài)致基因突變時(shí)，外泌體即可將相應(yīng)生物學(xué)信息傳遞給其他正常細(xì)胞，最終導(dǎo)致原癌基因的激活及細(xì)胞依賴性生長(zhǎng)能力的喪失，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生.

葡萄糖作為細(xì)胞最重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，其不足和過(guò)量均會(huì)引起細(xì)胞應(yīng)激，并可通過(guò)釋放外泌體對(duì)其產(chǎn)生應(yīng)答.Ling等[24]發(fā)現(xiàn)高糖應(yīng)激時(shí)腎小管上皮細(xì)胞釋放的外泌體可促進(jìn)其內(nèi)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)，從而抑制腎小球系膜細(xì)胞的增殖并促進(jìn)上皮向間質(zhì)的轉(zhuǎn)化.長(zhǎng)久以來(lái)，人們普遍認(rèn)為糖尿病與胰腺癌存在緊密聯(lián)系，部分學(xué)者認(rèn)為其可能是胰腺癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[25].是否糖代謝異常通過(guò)外泌體傳遞信息進(jìn)而導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生，目前尚無(wú)關(guān)于此類的研究，筆者相信通過(guò)收集并研究分析胰腺癌合并糖尿病患者血液中的特異性外泌體及相關(guān)生物信號(hào)傳遞途徑，有利于規(guī)避胰腺癌的發(fā)生.

4 外泌體在胰腺癌治療中的應(yīng)用

4.1 外泌體的免疫調(diào)節(jié)功能在胰腺癌治療中的應(yīng)用 目前越來(lái)越多的研究表明外泌體具有免疫調(diào)節(jié)功能.Zitvogel等[26]發(fā)現(xiàn)，由樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）分泌的攜帶有腫瘤特異抗原的外泌體作為腫瘤疫苗可使荷瘤小鼠的腫瘤消退.DC源性外泌體表面含有具有抗原提呈作用的主要組織相容性復(fù)合體（major histo-compatibility complex，MHC），使其具有相應(yīng)的特異性，研究表明，DC源性外泌體誘導(dǎo)的抗腫瘤機(jī)制主要是通過(guò)刺激T細(xì)胞增殖分化來(lái)實(shí)現(xiàn)的;腫瘤源性外泌體可將腫瘤特異抗原提呈至DC，通過(guò)激活細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞從而產(chǎn)生有效的治療和保護(hù)效應(yīng)，且這種免疫效應(yīng)不受MHC的約束[27].

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一類廣泛存在于機(jī)體多種組織中，具有自我修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)能力的多向分化潛能非造血祖細(xì)胞，目前廣泛應(yīng)用于多種疾病的研究中[28，29].MSCs通過(guò)細(xì)胞旁分泌方式釋放的外泌體參與一系列生理病理過(guò)程，同時(shí)對(duì)免疫系統(tǒng)也起著重要的調(diào)節(jié)作用.葉濤等研究發(fā)現(xiàn)外泌體聯(lián)合Wnt3a蛋白可定向誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）分化及歸巢，促進(jìn)成熟肉芽組織沉積，加速創(chuàng)面血管形成，進(jìn)一步促進(jìn)組織創(chuàng)面修復(fù).2013年，Bruno等[30]研究發(fā)現(xiàn)MSCs源性的外泌體可以抑制肝癌（HepG2）、Kaposi肉瘤、卵巢癌、（Skov-3）細(xì)胞體內(nèi)體外的增殖以及生長(zhǎng).雖然目前還未有MSCs源性外泌體在胰腺癌中的相關(guān)研究報(bào)道，但外泌體在機(jī)體免疫應(yīng)答、細(xì)胞遷移、細(xì)胞分化、腫瘤侵襲等過(guò)程中發(fā)揮的作用是毋庸置疑的，筆者相信隨著對(duì)MSCs源性外泌體修復(fù)特性及多向分化潛能的不斷深入研究，必將為胰腺癌患者帶來(lái)新的治療前景.

4.2 外泌體作為載體在胰腺癌中的應(yīng)用 外泌體作為機(jī)體自身分泌的一種囊性小泡，具有低免疫原性、穩(wěn)定性高、滲透性好、具有一定靶向性等特點(diǎn)，在體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞可以主動(dòng)攝取人工置入的外泌體，并誘導(dǎo)細(xì)胞毒性反應(yīng)[31]，因此外泌體可作為機(jī)體天然的內(nèi)源性載體.目前外泌體可攜帶的物質(zhì)包括（1）基因（mRNA、miRNA、siRNA）當(dāng)體內(nèi)其他細(xì)胞攝取這些含有RNA的外泌體后，通過(guò)其在受體細(xì)胞中翻譯表達(dá)及調(diào)控相應(yīng)蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮抗腫瘤作用[32];（2）蛋白和抗原;（3）化療藥物，如多柔比星和姜黃素利用外泌體達(dá)到靶向的作用[33];（4）一些免疫調(diào)節(jié)劑，如白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、白細(xì)胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等，可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞而非在腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)下的免疫抑制.此外有研究表明，通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境的pH值或者干擾與腫瘤外泌體分泌相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，可抑制外泌體介導(dǎo)的藥物外排，從而更好的發(fā)揮藥物的作用.

4.3 外泌體在胰腺癌轉(zhuǎn)化治療耐藥中的機(jī)制及作用 轉(zhuǎn)化治療是局部進(jìn)展期胰腺癌治療的重要手段之一，然而胰腺癌對(duì)化療藥物敏感性差且易產(chǎn)生耐藥性，因此，探討胰腺癌的耐藥機(jī)制，進(jìn)而尋求克服或逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的方法尤為重要.胰腺癌微環(huán)境是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的局部病理環(huán)境，其內(nèi)包含大量腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞及腫瘤源性、基質(zhì)細(xì)胞源性外泌體，此類外泌體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì)如核酸（DNA、lncRNA、miRNAs、mRNAs）、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等，通過(guò)釋放其內(nèi)容物增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞表型或誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性.（1）Richards等[34]在胰腺癌患者吉西他濱化療過(guò)程中發(fā)現(xiàn)CAFs可通過(guò)分泌外泌體來(lái)提高snail和miRNA-146a基因的高表達(dá)，從而促進(jìn)胰腺癌上皮細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性;（2）外泌體脂質(zhì)一方面可通過(guò)CXC趨化因子受體4（C-X-C motif chemokine receptor 4，CXCR4）/基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1α（stromal cell-derived factor 1α，SDF1α）信號(hào)通路誘導(dǎo)人胰腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[35，36];另一方面還可通過(guò)抑制Notch1途徑直接誘導(dǎo)人胰腺癌SOJ-6細(xì)胞凋亡[37，38];（3）凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）雖可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其在多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯不足[39].來(lái)源于胰腺癌的外泌體中含有IAP的相關(guān)mRNA，通過(guò)抑制IAP的表達(dá)使化療過(guò)程中胰腺癌細(xì)胞質(zhì)中IAP蛋白或mRNA的水平基本保持不變或中度上調(diào)，進(jìn)而增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性.miRNA-155是一個(gè)典型的多功能miRNA，通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性氧解毒酶的高表達(dá)，以提高化療過(guò)程中胰腺癌細(xì)胞的存活率和耐藥性[40].以上眾多研究均表明外泌體有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞耐藥的特性，利用這一特性可提高腫瘤治療的療效.一方面利用外泌體對(duì)藥物產(chǎn)生的抵抗作用，當(dāng)移除腫瘤中的某種耐藥性外泌體后，可能會(huì)提高腫瘤的治療效果.CAFs占據(jù)了胰腺導(dǎo)管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinomas，PADC）的主要部分，研究者通過(guò)應(yīng)用抑制CAFs釋放外泌體的藥物后發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)的上皮細(xì)胞存活率明顯下降，表明CAFs外泌體是PDAC細(xì)胞化療耐藥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，通過(guò)阻斷其釋放可降低PADC細(xì)胞存活率，從而規(guī)避對(duì)化療藥物的耐藥性，進(jìn)而提高腫瘤治療的敏感性[41，42].另一方面，利用外泌體作為載體傳遞抗miRNA或通過(guò)抑制外泌體釋放來(lái)逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性從而提高化療療效[43].

5 胰腺癌的預(yù)后與隨訪

胰腺癌手術(shù)切除率低，術(shù)后易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后極差，死亡率高.研究表明在胰腺癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移前，可分泌多種外泌體到周圍微環(huán)境中或釋放到血液循環(huán)中至遠(yuǎn)隔器官內(nèi)，干預(yù)和改變遠(yuǎn)隔器官的預(yù)轉(zhuǎn)移微環(huán)境（premetastatic niche）的形成[44，45].因此外泌體可用于胰腺癌的預(yù)后觀察，相比于其他腫瘤標(biāo)記物，其敏感性高，能夠早期預(yù)測(cè)腫瘤發(fā)生.在血清外泌體對(duì)胰腺癌細(xì)胞的診斷研究中發(fā)現(xiàn)，外泌體中l(wèi)ncRNA CCAT1檢測(cè)胰腺癌的敏感度、特異性和準(zhǔn)確性方面均顯著高于CA19-9（P＜0.05），可作為預(yù)測(cè)胰腺癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[46].此外，Jung等[47]研究表明來(lái)源于胰腺癌的富含CD44v6的外泌體，與胰腺癌淋巴結(jié)及肺組織的早期轉(zhuǎn)移有關(guān).

隨著物聯(lián)網(wǎng)時(shí)代的快速發(fā)展，建立外泌體與胰腺癌及高危人群的隨訪電子檔案，通過(guò)應(yīng)用大數(shù)據(jù)、微信等電子媒介設(shè)備，綁定患者住院及治療信息，可實(shí)時(shí)了解患者病情變化，并可加強(qiáng)對(duì)出院患者的遠(yuǎn)程診療.

6 總結(jié)與展望

研究外泌體在胰腺癌診療中的應(yīng)用，以期提高胰腺癌的早期診斷率、提高R0切除率、改善胰腺癌對(duì)吉西他濱等化療藥的耐藥性，進(jìn)而提高5年生存率.

越來(lái)越多的研究表明外泌體作為一種新型生物學(xué)標(biāo)志物在胰腺癌早期診斷和病情監(jiān)測(cè)方面有著巨大潛在價(jià)值，其作為胰腺癌化療藥物的運(yùn)送載體亦有著極具潛力的研究前景;然而目前關(guān)于外泌體在胰腺癌中的研究仍處于基礎(chǔ)階段，雖然外泌體的提取方法很多，但尚無(wú)一種方法能同時(shí)保證其含量、純度和生物活性;受制于技術(shù)手段等方面原因外泌體還未真正進(jìn)入臨床應(yīng)用，筆者相信隨著研究的不斷深入及技術(shù)條件的完善，外泌體終會(huì)發(fā)揮其應(yīng)有價(jià)值，為胰腺癌患者的治療帶來(lái)新的希望.