芒果葉提取液生物合成納米TiO2工藝優(yōu)化及其抗菌性能

許青蓮，黃銳函，李宣林,2，邢亞閣，稅玉儒,2，吳 林，于晉澤

?農(nóng)產(chǎn)品加工工程?

芒果葉提取液生物合成納米TiO2工藝優(yōu)化及其抗菌性能

許青蓮1，黃銳函1，李宣林1,2，邢亞閣1※，稅玉儒1,2，吳 林1，于晉澤3

（1. 西華大學食品與生物工程學院，成都 610039；2. 西華大學宜賓研究院，宜賓 644004；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術研究中心（天津），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384）

為了將生物合成法制得的納米粒子應用于果蔬保鮮中，該研究以芒果葉提取液和偏鈦酸（TiO(OH)2）為原材料，采用生物合成法制備納米二氧化鈦（titanium dioxide，TiO2）粒子。以單因素試驗為基礎，通過響應曲面分析法優(yōu)化了納米TiO2生物合成工藝，研究了其抗菌性能。優(yōu)化合成工藝為：TiO(OH)2添加量0.65 g，反應時間10.2 h，灼燒時間2 h，灼燒溫度786 ℃。納米TiO2的光誘導降解率為96.24%，與理論值標準偏差為0.6%。X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）結(jié)果顯示，生物合成的納米TiO2為銳鈦礦型。掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）顯示，生物合成后改性的納米TiO2粒徑分布在10～30 nm，無明顯聚集體。紫外（Ultraviolet，UV）光誘導，生物合成改性的納米TiO2（<0.05）對青霉菌表現(xiàn)出明顯的抑制作用。該制備工藝可為光誘導抗菌性納米TiO2的合成提供理論參考。

貯藏；品質(zhì)控制；納米二氧化鈦；光誘導；生物合成；抗菌性

0 引 言

高腐爛率對果蔬的貯藏構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)，導致其營養(yǎng)損失、微生物增長[1]，每年都有因貯藏不當而造成新鮮農(nóng)產(chǎn)品的巨大損失?？墒承酝磕ぃ‥dible Coatings and Films，ECF）和氣調(diào)包裝等保鮮技術可以用于農(nóng)產(chǎn)品儲存和貨架期間保證其產(chǎn)品質(zhì)量[2-4]。作為光誘導抑菌劑[5]，已有研究表明，納米TiO2對細菌、真菌、霉菌都有抑制作用，將其添加到包裝材料中，可使包裝材料也具有抑菌性，從而減緩果蔬的腐敗[6-8]。邢亞閣等[9]在殼聚糖載體中添加納米TiO2，形成殼聚糖/納米TiO2復合保鮮膜，有效地抑制了金黃色葡萄球菌的生長。Lin等[10]將淀粉和聚乙烯醇與納米TiO2制成復合膜，該復合膜對大腸桿菌、李斯特菌均表現(xiàn)出抑制效果。但有關納米TiO2對芒果青霉病主要致病菌青霉菌的抑制研究較少。

納米TiO2的制備方法主要有液相法和氣相法[11]。但近年來，隨著可再生材料和無毒化學品需求的增長，納米材料的生物合成方法越來越受到人們的關注。與細菌和真菌相比較，采用植物提取物制備出的納米顆粒粒徑更小并且合成速度更快。已經(jīng)有不少研究表明，可以利用植物提取物合成納米TiO2顆粒。Saravanan等[12]以蕨類植物提取物為原料，采用綠色合成方法制備TiO2，結(jié)果顯示，通過控制試驗條件可以較容易地制備出均勻性高，比表面積大，聚集度小的TiO2納米顆粒，并可獲得理想的銳鈦礦型與金紅石型比例。Abisharani等[13]以葫蘆籽為原料，在三氯化鈦（TiCl3）溶液中綠色合成納米TiO2粒子，并觀察到形成了正方體結(jié)構(gòu)，傅立葉變換紅外光譜儀（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析結(jié)果表明存在各種功能性生物分子作為還原劑和封端劑將TiO4轉(zhuǎn)化為TiO2納米粒子。但少有研究以芒果葉作為原料生物合成納米TiO2。

中國每年產(chǎn)生大量的芒果葉廢棄物，少有研究與芒果葉相關。已有研究表明，芒果葉含有多酚和黃酮類等生理活性物質(zhì)，這些物質(zhì)具有一定的還原作用[14-15]。本文利用芒果葉提取液作為還原劑，生物合成TiO2納米，避免了芒果葉資源的浪費，提高了其利用率。采用生物合成法制備納米TiO2，通過單因素和Box-Behnken響應面試驗，以亞甲基藍的光誘導降解率為響應值，分析TiO(OH)2添加量、反應時間、灼燒時間及灼燒溫度4個因素對制備納米TiO2亞甲基藍光誘導降解率的影響，優(yōu)化出制備納米TiO2的較佳工藝條件，為TiO2納米顆粒的制備和應用提供理論的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

芒果葉，四川攀枝花農(nóng)家果園；TiO(OH)2（分析純），上海麥克林生化科技有限公司；市購納米TiO2（純度>99%），北京德科島金科技有限公司；亞甲基藍（分析純），成都市科龍化工試劑廠；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato Dextrose Agar，PDA），北京奧博星生物技術有限責任公司；青霉菌（P.）CICC 2478，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of In-dustrial Culture Collection，CICC）。

1.2 主要儀器與設備

DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；RH digital數(shù)顯加熱控溫型磁力攪拌器，廣州市艾卡儀器設備有限公司；SHD-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長盛實驗儀器有限公司；BPG-9240A精密鼓風干燥箱，上海一恒科技有限公司；SX2-2.5-Ω箱式電阻爐，上海意豐電爐有限公司；YS-XCABLED光照柜，杭州屹石科技有限公司；UV3600紫外-可見分光光度計，日本島津公司；KQ-100DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BSC-1300ⅡA2生物安全柜，蘇州安泰空氣技術有限公司；GI54DWS立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；Gemini場發(fā)射掃描電子顯微鏡，德國卡爾·蔡司股份公司。

1.3 制備與測定方法

1.3.1 納米TiO2的生物合成

參照Sundrarajan等[16]的方法，且稍作修改。將新鮮芒果葉25 ℃左右自然通風干燥一周（干燥至葉片變黃），（鮮芒果葉主要活性成分為總黃酮占比38.35%[17]，干芒果葉主要活性成分芒果苷含量28 mg/g[18]），剪碎，稱取5 g剪碎后的芒果葉浸泡于100 mL蒸餾水中，在80 ℃下浸提30 min（浸提30 min得到的芒果葉提取液還原能力較佳），提取液用快速濾紙粗濾一次，再用濾膜真空過濾兩次，過濾后的提取液保存于4 ℃冰箱內(nèi)，用于下一步試驗。

將0.5 g TiO(OH)2粉末分散于50 mL提取液中，采用恒溫磁力攪拌器在60 ℃下連續(xù)攪拌3 h后在室溫下靜置冷卻10 h，使提取液與TiO(OH)2充分反應。反應結(jié)束后將沉積在反應瓶底部的沉淀物真空過濾，用蒸餾水洗滌3～4次，濾液置于80 ℃烘箱內(nèi)干燥30 min，在800 ℃馬弗爐中灼燒3 h，制得納米TiO2。制備流程如圖1。

1.3.2 單因素試驗設計

固定條件為TiO(OH)2的添加量設定為0.50 g，反應時間為10 h，灼燒溫度為800 ℃，灼燒時間為2 h為初始條件，分別考察TiO(OH)2的添加量（0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g）、反應時間（6、8、10、12、14 h）、灼燒溫度（400、500、600、700、800、900 ℃）、灼燒時間（1、2、3、4、5、6 h）對亞甲基藍光誘導降解率的影響。

1.3.3 響應曲面試驗設計

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，選取TiO(OH)2添加量、反應時間、灼燒溫度、灼燒時間4個因素為考察因素，以亞甲基藍光誘導降解率為響應值，進行優(yōu)化試驗，設計四因素三水平共29組的Box-Behnken響應曲面優(yōu)化試驗，確定生物合成納米TiO2的較佳工藝條件，試驗因素及水平如表1所示。

表1 響應面試驗設計因素和水平

1.3.4 芒果葉提取液還原能力的測定

設定TiO(OH)2添加量為0.50 g，反應時間為10 h，灼燒時間為2 h，灼燒溫度為800 ℃，芒果葉浸提時間分別為10、20、30、40和50 min，考察不同浸提時間對芒果葉提取液還原能力的影響。提取液還原能力通過納米TiO2產(chǎn)率表示，產(chǎn)率的計算公式如下：

1.3.5 光誘導性能測試

參考崔國意等[19]的測定方法，稍作修改。在250 mL的燒杯中加入納米TiO2樣品0.20 g，再將80 mL 0.08 g/L的亞甲基藍溶液加入其中，使用磁力攪拌器進行攪拌。黑暗條件下放置30 min后取樣，后放于光照柜中，在波長365 nm的紫外燈下光照的同時進行攪拌，每隔30 min取一次樣，通過紫外分光光度計測定664 nm處的吸光值。光誘導降解率計算公式如下：

1.3.6 X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）分析

用D8 advance X射線多晶粉末衍射儀對納米TiO2粒子進行表征。使用Cu K射線，電壓為35 kV，電流為30 mA，掃描范圍為2=20°～90°，掃描步長0.026°，采樣時間12.24 s。

1.3.7 掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）分析

利用Gemini場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察生物合成與生物合成后改性的納米TiO2粒子的表面形貌。用雙面碳導電膠帶將樣品固定于不銹鋼載物臺上，進行濺射噴金，在1 kV電壓下進行觀察。

1.3.8 納米二氧化鈦抗菌試驗

1）試驗菌懸液的制備

通過平板接種、培養(yǎng)、活化后的青霉菌（P.），用無菌水洗脫，無菌紗布過濾濾去菌絲，加入無菌玻璃珠，使孢子充分分散，形成懸浮液，在顯微鏡下調(diào)整菌懸液濃度為106～107CFU/mL（菌懸液濃度測定使用血球計數(shù)板），置于4 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2）納米TiO2的改性

參照Xing等[20]的方法。在70 mL去離子水中緩慢加入5.0 g納米TiO2，用1.0 mol/L HCl（或1.0 mol/L NaOH）調(diào)節(jié)溶液pH值至5.5，加入0.75 g月硅酸鈉（月桂酸鈉能很好地分散TiO2納米粒子的非極性基團），使用磁力攪拌器在40 ℃下攪拌30 min，隨后轉(zhuǎn)移溶液至離心管中，于4 000 r/min條件下離心10 min，保留沉淀物，使用去離子水離心洗滌沉淀物2～3次，在105 ℃下烘干至恒量，得到改性的納米TiO2（TN-3），置于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

3）CTS-TiO2-Ag復合涂膜液的制備

在100 mL容量瓶中加入甘油1.0 g、生物合成后改性的納米TiO2（TN-3）（經(jīng)過試驗證明改性后的納米TiO2抑菌效果更優(yōu)）0.05 g，再添加1.5 mmol/L的納米銀溶液5 mL與冰乙酸1 mL，定容。定容完成后，轉(zhuǎn)移溶液至燒杯中，一邊攪拌一邊加入納米殼聚糖1.0 g，待殼聚糖（Chitosan，CTS）溶解完全后，超聲（功率100W，頻率20 kHz）脫氣30 min，再攪拌、脫氣，得到CTS-TiO2-Ag納米復合涂膜液。

4）培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Agar，PDA）：稱取PDA 38 g，與1 000 mL蒸餾水加熱煮沸使PDA溶解，進行殺菌處理（121 ℃，20 min），殺菌后使其冷卻倒平板。

納米TiO2-PDA培養(yǎng)基：將市購納米TiO2（TN-1）、生物合成納米TiO2（TN-2）、生物合成后改性的納米TiO2（TN-3）分別稱取0.2 g，溶于50 mL去離子水中，進行30 min的超聲波處理后得到3種納米TiO2溶液。溶解的PDA每15 mL分裝到試管中，加入2 mL納米TiO2溶液，進行殺菌（121 ℃，20 min），殺菌后使其冷卻倒平板。

納米CTS-TiO2-Ag-PDA培養(yǎng)基：溶解的PDA每100 mL分裝到錐形瓶中，每瓶中加入2 mL納米CTS-TiO2-Ag復合涂膜液，進行殺菌（121 ℃，20 min），殺菌完成后冷卻倒平板。

5）UV光誘導離體抗菌試驗

采用3點接種法將P.（芒果青霉病主要致病菌）接種于PDA、納米TiO2-PDA以及納米CTS-TiO2-Ag-PDA培養(yǎng)基上，進行光照處理。將PDA、納米TiO2-PDA與納米CTS-TiO2-Ag-PDA三種培養(yǎng)基分成6組（每組3次重復），光照條件分別為：黑暗處理（對照組，KB）、日光燈光照30 min（RG）、UV光照30 min（ZG-30）、UV光照60 min（ZG-60）、UV光照90 min（ZG-90）和UV光照120 min（ZG-120）。光照結(jié)束后將培養(yǎng)基放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每組試驗重復3次。

使用游標卡尺分別測定霉菌培養(yǎng)72、96和120 h后的直徑，以3個平皿測得的菌落直徑的平均值作為測定結(jié)果。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9作圖，使用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應曲面試驗設計優(yōu)化及響應曲面數(shù)據(jù)處理；采用Excel 2019和SPSS 25.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，所有試驗重復3次，結(jié)果以平均值±標準差表示，顯著性水平<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸提時間對芒果葉提取液還原能力的影響

植物的各個部分被認為是生產(chǎn)納米粒子潛在的還原劑[16]，芒果葉的浸提時間對納米TiO2粒子產(chǎn)率的影響，如圖2所示。納米TiO2的產(chǎn)率隨著浸提時間的延長而增加，浸提時間為10 min時，產(chǎn)率僅為74.11%，當浸提時間增加至30 min時，納米TiO2產(chǎn)率為86.74%，二者差異顯著（<0.05）。浸提時間增加至40、50 min，納米TiO2粒子的產(chǎn)率為87.62%、87.93%，與30 min處理組無顯著性差異。綜合考慮，芒果葉提取液的浸提時間選擇30 min較為適宜。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 TiO(OH)2添加量對亞甲基藍光誘導降解率的影響

單因素試驗結(jié)果見圖3。TiO(OH)2的不同添加量對亞甲基藍光誘導降解率的影響結(jié)果如圖3a所示。光誘導反應210 min時，TiO(OH)2添加量分別為1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 g，合成的納米TiO2對亞甲基藍光誘導降解率為80.40%、61.28%、49.12%、13.02%、9.74%，各處理組之間差異顯著（<0.05）。而當TiO(OH)2的添加量為0.25 g時，納米TiO2對亞甲基藍光誘導降解率為89.17%，TiO(OH)2添加量為0. 50 g時，納米TiO2光誘導降解率為88.92%，兩個處理組之間差異不顯著。隨著TiO(OH)2添加量的增加，合成得到的納米TiO2光誘導效果呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。出現(xiàn)上述現(xiàn)象的原因可能是，TiO(OH)2添加量越大，與植物提取液完全反應所需時間越長，TiO(OH)2添加量增大使得與植物提取液的合成反應不充分，得到的納米TiO2晶核形成尚不完全，不定形的TiO2比表面積小，光誘導效果較弱，TiO(OH)2添加量越大，與植物提取液完全反應所需的時間越長。綜合考慮，在試驗中設定TiO(OH)2添加量為0.50 g較合適。

2.2.2 反應時間對亞甲基藍光誘導降解率的影響

不同反應時間對亞甲基藍光誘導降解率的影響結(jié)果如圖3b，納米TiO2的光誘導降解率隨著反應時間的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。光誘導反應210 min，反應時間為10、12和14 h合成的納米TiO2光誘導降解率分別為80.40%、63.86%和55.37%，各處理組之間存在顯著性差異（<0.05）。與此同時，當反應時間分別為6、8 h時，合成的納米TiO2對亞甲基藍的光誘導降解率為71.91%、72.55%，二者之間的差異不顯著。主要是因為納米TiO2生成反應開始時，晶核形成過程中，反應的時間過短會致使形成的晶核不完全，導致不成型的納米TiO2光誘導效果差。但反應時間太長會使得形成的晶核發(fā)生團聚現(xiàn)象，生成的納米TiO2比表面積減小，從而導致光誘導降解率降低[21]。綜上，在試驗中選擇10 h的反應時間較適宜。

2.2.3 灼燒溫度對亞甲基藍光誘導降解率的影響

灼燒溫度對亞甲基藍光誘導降解率的影響如圖3c，光誘導反應210 min時，灼燒溫度分別為400、500、600、700、800 ℃，生成的納米TiO2對亞甲基藍的降解率為32.65%、52.53%、80.40%、81.26%、90.13%，各處理組之間存在顯著性差異（<0.05）。400～800 ℃范圍內(nèi)，隨著灼燒溫度的升高，納米TiO2光誘導劑的光誘導性能呈現(xiàn)上升的趨勢。當灼燒溫度增至900 ℃時，降解率為73.34%，與其他處理組之間差異顯著（<0.05）。這可能是因為，隨著灼燒溫度的升高，納米TiO2的晶型從無定形轉(zhuǎn)為銳鈦礦型，銳鈦礦型納米TiO2的光誘導效果更好，其可以在800 ℃的高溫條件下保持穩(wěn)定，但溫度的升高使得一部分銳鈦礦型納米TiO2開始向金紅石型轉(zhuǎn)變，同時高溫降低了比表面積，從而導致了光誘導性能的降低[22-23]。綜合考慮，試驗中選擇800 ℃的灼燒溫度較合適。

2.2.4 灼燒時間對亞甲基藍光誘導降解率的影響

不同灼燒時間對納米TiO2光誘導降解率的影響如圖 3d所示。由圖3d可知，在光誘導反應210 min時，納米TiO2對亞甲基藍的光誘導降解率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，灼燒時間為1 h合成的納米TiO2對亞甲基藍的光誘導降解率為78.86%。灼燒時間為2 h合成的納米TiO2光誘導降解率為83.28%，與1 h處理組之間存在著顯著差異（<0.05）。同時，當灼燒時間為3、4、5、6 h時，納米TiO2對亞甲基藍的光誘導降解率分別為80.40%、69.25%、65.47%、62.47%，各處理組之間也存在顯著性差異（<0.05）。灼燒時間過短，雜質(zhì)可能無法得到徹底的清除，并且晶相的轉(zhuǎn)變也不完全，而當灼燒時間太長，大于2 h后，合成的納米TiO2晶相不斷增長，TiO2納米粒子開始團聚，致使納米TiO2的光誘導比表面積減小，對亞甲基藍的光誘導降解率降低[23]。綜合考慮，選擇灼燒時間為2 h較適宜。

2.3 響應曲面試驗結(jié)果

2.3.1 響應曲面試驗設計及結(jié)果

采用Box-Behnken試驗設計，以TiO(OH)2添加量（）、反應時間（）、灼燒溫度（）和灼燒時間（）為自變量，以亞甲基藍光誘導降解率為響應值，進行響應曲面優(yōu)化分析，試驗設計及結(jié)果見表2。

利用Design Expert 8.0.6 數(shù)據(jù)分析軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行分析，建立模型，經(jīng)回歸擬合得出光誘導降解率(%)為目標函數(shù)的(g)、(h)、(℃)和(h) 4因素的二次多項回歸模型如下：

2.3.2 回歸方程方差分析

根據(jù)表3亞甲基藍光誘導降解率方差分析得出，模型檢驗<0.000 1，方差模型達到極顯著，具有統(tǒng)計學意義，失擬項=0.329 7>0.05，失擬項不顯著，表明該回歸模型與實際試驗具有較高的擬合度，進一步說明該模型可信度高，因此可以用該回歸方程預測生物合成納米TiO2的最佳工藝參數(shù)。

該回歸模型決定系數(shù)2= 0.958 7，調(diào)整決定系數(shù)2Adj= 0.917 3，說明該模型可以解釋91.73%響應值的變化，回歸模型較可靠，可用于納米TiO2的生物合成工藝優(yōu)化試驗的理論推測。

在光誘導降解率模型中，一次項TiO(OH)2添加量（）、灼燒時間（），二次項2、2、2、2及交互項對亞甲基藍光誘導降解率影響極顯著（<0.01）；而交互項和影響顯著（<0.05），其他交互項影響不顯著。各因素顯著程度從大到小依次為TiO(OH)2添加量（）、灼燒時間（）、灼燒溫度（）、反應時間（）。

表2 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果

2.4 驗證試驗

通過Box-Behnken試驗結(jié)果，綜合考慮亞甲基藍光誘導降解率，確定模型優(yōu)化得到納米TiO2生物合成較佳工藝條件為TiO(OH)2添加量0.65 g，反應時間10.21 h，灼燒時間2.08 h，灼燒溫度786.41 ℃，在此工藝條件下預測最高降解率為97.68%，考慮到實際操作的可行性，所以選定經(jīng)過調(diào)整的工藝參數(shù)為TiO(OH)2添加量0.65 g，反應時間10.2 h，灼燒時間2 h，灼燒溫度786 ℃，以此工藝條件重復3次試驗，合成得到的納米TiO2對亞甲基藍光誘導的降解率達到96.24%，預測值和實際值標準偏差為0.6%，說明采用響應面法對生物合成納米TiO2工藝參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果準確可靠。

2.5 X射線衍射（X-ray Diffraction，XRD）分析結(jié)果

用XRD譜儀對生物合成的納米粒子進行結(jié)構(gòu)和礦相性質(zhì)分析，圖譜如圖4所示。從XRD圖譜中發(fā)現(xiàn)，納米TiO2粒子為單一的銳鈦礦相，且沒有任何其他二次衍射峰，表明所獲得的納米粒子是高純度的，沒有任何雜質(zhì)。衍射角2為25.2°、37.7°、47.9°、53.8°、54.7°、62.7°、69.8°和75.1°時，分別對應銳鈦礦相的（101）、（004）、（200）、（105）、（211）、（204）和（116）晶面[24-25]。

表3 回歸模型方差分析

注：“**”表示差異極顯著（<0.01）；“*”表示差異顯著（<0.05）；“-”為差異不顯著。

Note: “**” indicating extremely significant difference (<0.01); “*” indicating significant difference (<0.05); “-” indicating no significant difference.

2.6 掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）分析結(jié)果

用掃描電鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）分析了TN-2（生物合成）與TN-3（生物合成改性）的納米TiO2粒子的形態(tài)特征和粒徑大小，如圖5所示。從圖5中分析可知，TN-2的TiO2納米顆粒呈現(xiàn)為準球形，粒徑較小，分布在20～40 nm范圍內(nèi)；TN-3也呈現(xiàn)為準球形，且粒徑分布于10～30 nm，比TN-2的粒徑更小。SEM圖像中納米顆粒的形狀和尺寸明確，TN-2聚集體較少，TN-3無明顯聚集體，這是由于芒果葉提取液（充當穩(wěn)定/封蓋劑）在合成過程中所起的重要作用將TiO(OH)2還原為納米級[26]。制備的納米顆粒粒徑減小與表面體積比的增加成反比，這有助于納米粒子穿透細胞壁快速殺死微生物，這是綠色合成的TiO2納米粒子抗菌活性增強的主要原因[27]。改性后的納米TiO2平均粒徑更小，聚集體更少，分散性更好，因此選用生物合成改性的納米TiO2進行復合涂膜液的制備。

2.7 光誘導合成的納米二氧化鈦抗菌性能

2.7.1 單獨UV光照處理對P.的抑制作用

不同光照處理對P.菌落生長的影響如圖6a。由圖可知，培養(yǎng)72 h，UV光照30、60、90和120 min處理組的P.菌落直徑分別為7.37、7.43、7.27和7.43 mm，與黑暗處理、日光處理組的7.55、7.35 mm之間差異不明顯。此外，培養(yǎng)96和120 h時各處理組之間差異也不明顯，說明只進行UV光照處理對P.的抑制效果不顯著。

2.7.2 納米TiO2單體UV光誘導對P.的抑制作用

市購納米TiO2（TN-1）、生物合成納米TiO2（TN-2）及生物合成后改性的納米TiO2（TN-3）樣品UV光誘導處理對P.菌落生長的影響分別見圖6。由圖 6b～d數(shù)據(jù)可以得知，納米TiO2經(jīng)過紫外光誘導抗P.的效果顯著優(yōu)于單獨紫外光照處理組（<0.05）。

由圖6b～d可看出，不同光照處理條件下，對培養(yǎng)120 h的P.的菌落直徑進行測量，TN-1樣品的KB組和RG組的菌落直徑分別為11.78和11.71 mm，二者之間差異不顯著，說明黑暗處理和日光燈誘導處理對P.并沒有明顯的抑制效果。TN-2和TN-3的黑暗處理和日光燈誘導處理抑菌效果與TN-1樣品相同。圖6b，隨著UV光照時間的延長，經(jīng)過照射處理的菌落直徑呈現(xiàn)減小的趨勢，培養(yǎng)120 h，經(jīng)UV光誘導30、60、90和120 min的P.菌落直徑分別為9.89、9.57、9.16和7.99 mm（<0.05），這說明UV光誘導時間越長，P.菌落直徑越小，UV光誘導對P.的抑制效果就越明顯。在UV光誘導下，經(jīng)過TN-2和TN-3樣品處理的P.菌落直徑隨著時間的增加而減小，這與TN-1相同。經(jīng)UV光誘導120 min，培養(yǎng)120 h后，TN-1、TN-2和TN-3三個樣品處理組的菌落直徑分別為7.99、7.80和6.86 mm，TN-3組與其他兩組之間有顯著性差異（<0.05），表明生物合成的納米TiO2對P.的抑制效果優(yōu)于市購納米TiO2，且改性后的納米TiO2對P.具有更好的抑菌效果，更適用于納米復合涂膜的制備。

2.7.3 CTS-TiO2-Ag納米復合涂膜液UV光誘導對P.的抑制作用

納米CTS-TiO2-Ag復合涂膜液經(jīng)過UV光誘導對P.的抑制效果如圖6e所示。由圖6可知，UV光照30 min后培養(yǎng)72 h，納米CTS-TiO2-Ag復合涂膜液UV光誘導的菌落直徑為4.00 mm（圖6e），與單獨的UV光誘導處理的7.37 mm（圖6a），納米TiO2單體的UV光誘導處理的6.27（圖6b）、5.93（圖6c）、5.79（圖 6d）mm存在顯著差異（<0.05），這表明在UV光照時間與培養(yǎng)時間相同的條件下，納米CTS-TiO2-Ag復合涂膜液UV光誘導對P.的抑制效果更好。UV光照時間由30增加至120 min，培養(yǎng)96 h，P.的菌落直徑差異不明顯，由4.32減少至3.76 mm，但仍與黑暗處理組KB的5.59 mm、日光誘導處理組的5.43 mm存在顯著差異（<0.05），說明UV光誘導時間越長，納米TiO2對P.的抑制效果越好。

3 結(jié) 論

采用生物合成法，以芒果葉提取液為還原劑，TiO(OH)2為鈦源，制備納米二氧化鈦粒子。

1）通過單因素和響應面試驗，以納米TiO2粒子對亞甲基藍的光誘導降解率為考察指標，進行工藝優(yōu)化，得到的優(yōu)化制備工藝條件為：TiO(OH)2添加量0.65 g，反應時間10.2 h，灼燒溫度786 ℃和灼燒時間2 h。在該條件下測得合成的納米TiO2對亞甲基藍的降解率為96.24%。

2）掃描電鏡顯示，采用生物合成法制備出的TN-2和生物合成后改性的TN-3樣品形狀為球形，顆粒尺寸小，且改性后的顆粒粒徑最小。X射線衍射得到生物納米TiO2粒子為銳鈦礦型且具有高純度。

3）生物合成的納米TiO2光誘導抗菌能力強，且UV光誘導生物合成的納米TiO2對P.的抑制效果優(yōu)于市購納米TiO2，生物合成改性的納米TiO2對P.具有更好的抑菌效果。

4）將改性后的納米TiO2應用于復合涂膜中，對P.的抑制效果更明顯，為納米TiO2粒子應用到涂膜中提供理論依據(jù)。有關生物合成納米TiO2對其他微生物的抑制作用及其生物相容性，在涂膜中的穩(wěn)定性仍需要進一步研究。

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Optimization of the process for biosynthesis nano-TiO2 from mango leaf extract and its antimicrobial properties

Xu Qinglian1, Huang Ruihan1, Li Xuanlin1,2, Xing Yage1※, Shui Yuru1,2, Wu Lin1, Yu Jinze3

(1.,,610039,; 2.,,644004,; 3.,,,,300384,)

Fresh fruits and vegetables with a high content of water are easily lost to spoilage by a variety of microorganisms, resulting in short shelf life. Specifically, penicillium (P.) has been the most harmful and frequent disease in postharvest storage of fruits, such as mango and citrus, which are easily infected by moldy pathogens. Fortunately, the nano-TiO2particle has widely been used to preserve fruits and vegetables, due mainly to the high chemical stability and antibacterial properties. Two reasons can be attributed to the preservation mechanism. 1) Ethylene (C2H4) under ultraviolet (UV) irradiation has normally been decomposed into carbon dioxide (CO2) and water (H2O) in the fruits and vegetables packaging, where the concentration of CO2increases, while that of C2H4decreases. As such, the respiration and ripening rate of fruits and vegetables can be effectively delayed by the gas change, thereby controlling the water loss. 2) Microorganisms are composed of organic compounds, such as bacteria and fungi. Strong oxidation can denature the protein, thus inhibiting the growth of microorganisms or even killing, where Reactive Oxygen Species (ROS) has been produced by nano-TiO2under light conditions. Nevertheless, the biosynthesis of nanomaterials has attracted much more attention, with the highly demand for renewable and non-toxic chemicals in recent years. Correspondingly, the nano- TiO2biosynthesis can be assumed as a bottom-up approach, including the main reaction of reduction/oxidation without toxic chemicals involved in the synthesis process, particularly suitable for pharmacy, biomedicine, and food. In this study, nano-sized TiO2particles were prepared by biosynthesis, where the mango leaf extract was taken as the reducing agent, while metatitanic acid (TiO(OH)2) as titanium source. An investigation was also made to explore the effects of extraction times on the reduction ability of mango leaf extracts. Moreover, the Response Surface Method (RSM) in a single factor experiment was selected to optimize the biosynthesis process of nano-TiO2. The nano-TiO2particles were characterized by X-Ray Diffraction (XRD) and Scanning Electron Microscopy (SEM), together with antimicrobial properties against P.. The results showed as follows. The yield of nano-TiO2increased with the extension of extraction time when extracting mango leaves. Specifically, the yield of nano-TiO2was 86.74%, when the extraction time was 30 min, which was not significantly different from 87.62% and 87.93% when the extraction time was 40 and 50 min. An optimal combination of synthesis process was achieved, where TiO(OH)2addition 0.65 g, reaction time 10.2 h, calcination time 2 h, and calcination temperature 786 °C. In this case, the photoinduced degradation rate of nano-TiO2was 96.24%, and the standard deviation from the theoretical value was 0.6%. In addition, the XRD pattern demonstrated that the biosynthetic nano-TiO2was anatase type. SEM images showed that the TiO2nanoparticles obtained by biosynthesis were quasi-spherical, with the distribution of particle size in the range of 20-40 nm and fewer aggregates, but the modified nano-TiO2presented a smaller particle size and fewer aggregates, indicating the better dispersion. Furthermore, the biosynthesized TiO2nanoparticles exhibited a certain inhibitory effect on P., whereas, the modified nano-TiO2performed a better antimicrobial effect under the induction of ultraviolet (UV) light. More importantly, the modified nano-TiO2in composite coating behaved an obvious inhibitory effect on P.. Consequently, the biosynthesized nano-TiO2can widely be expected to serve as the preservation of fruits and vegetables to maintain the quality and prolong the storage life. This preparation process can provide a strong theoretical reference for the synthesis of nano-TiO2 with better photoinduced antibacterial properties.

storage; quality control; nano titanium dioxide; photoinduced; biosynthesis; antimicrobial activity

許青蓮，黃銳函，李宣林，等. 芒果葉提取液生物合成納米TiO2工藝優(yōu)化及其抗菌性能 [J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2021，37(18)：281-289.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.18.032 http://www.tcsae.org

Xu Qinglian, Huang Ruihan, Li Xuanlin, et al. Optimization of the process for biosynthesis nano-TiO2from mango leaf extract and its antimicrobial properties[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2021, 37(18): 281-289. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2021.18.032 http://www.tcsae.org

2021-05-08

2021-07-12

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室開放基金（kf202006）；西華大學研究生創(chuàng)新基金（ycjj2019082）；四川省科技廳重點研發(fā)項目（2019YFN0174，2018NZ0090，2019NZZJ0028，2017NFP0030）；成都市科技局技術創(chuàng)新研發(fā)項目（2019-YF05-00190-SN，2019-YF05-00628-SN）

許青蓮，實驗師，研究方向農(nóng)產(chǎn)品儲藏保鮮技術。Email：775938414@qq.com

邢亞閣，博士，教授，研究方向果蔬貯藏保鮮與精深加工技術。Email：xingyege@163.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2021.18.032

TS206.4

A

1002-6819(2021)-18-0281-09