高溫大曲中吡嗪類化合物GC-MS檢測方法的研究

蘇 寧，呂志遠(yuǎn)，秦炳偉，張夢夢，邱振清，韓云翠，時(shí)雪萌，王瀅瀅，呂洪霞

（濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司，山東濟(jì)南250115）

吡嗪是1,4位含氮的六元環(huán)化合物，具有明顯的焦香或炒堅(jiān)果、炒芝麻的香氣[1]。白酒中吡嗪類化合物具有閾值低，氣味強(qiáng)度高的特點(diǎn)，對(duì)焦香的形成具有很重要的作用，是白酒中重要的風(fēng)味物質(zhì)，也是大曲揮發(fā)性香味物質(zhì)的重要組成成分。大曲在制作過程中產(chǎn)生的各類香味物質(zhì)，可隨著發(fā)酵和蒸餾過程進(jìn)入酒體，因此，大曲中的香味物質(zhì)對(duì)白酒的風(fēng)味特征和品質(zhì)具有一定的貢獻(xiàn)[2]。目前，對(duì)于吡嗪類化合物的研究主要集中于對(duì)白酒中該類化合物的檢測與分析[3]，對(duì)大曲中吡嗪類化合物的檢測方法研究較少，牛姣等[4]通過頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)仰韶陶香型高溫大曲中揮發(fā)性香味物質(zhì)進(jìn)行分析，共檢測出4種吡嗪類化合物。本研究采用GC-MS對(duì)高溫大曲中吡嗪類化合物進(jìn)行檢測，共檢出7種含一個(gè)或者多個(gè)甲基的吡嗪類化合物，為今后高溫大曲的香味物質(zhì)及最佳儲(chǔ)存期的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

材料：選用培曲期間（第0天～25天）及前期儲(chǔ)存（第26天～80天）的高溫大曲。

試劑及耗材：無水乙醇（色譜純）；內(nèi)標(biāo)物，2-甲氧基-3-甲基吡嗪；吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品，2-甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,5/2,6-二甲基吡嗪。內(nèi)標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)品，純度均為99.9%，購自百靈威科技有限公司。

儀器設(shè)備：氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890 A-5975 C），安捷倫科技有限公司；電子天平（精確到0.1 g）；分析天平（型號(hào)FA 2004，精確到0.0001 g），天津天馬衡基儀器有限公司；超聲波發(fā)生器（KQ 2200型），昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)準(zhǔn)備

內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：稱取0.01 g（精確至0.0001 g）的2-甲氧基-3-甲基吡嗪，使用60%乙醇水溶液溶解定容至100 mL，濃度為100 mg/L。

內(nèi)標(biāo)使用液：準(zhǔn)確吸取10 mL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用60%乙醇水液稀釋并定容至100 mL，濃度為10 mg/L。

吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別稱取0.1 g（精確至0.0001 g）吡嗪類標(biāo)準(zhǔn)品，使用60%乙醇水溶液溶解后定容至100 mL，使標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液濃度為1000 mg/L。

吡嗪類混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確吸取2,5/2,6-二甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備200 μL，其余標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL，使用60%乙醇水溶液定容至100 mL,使2,5/2,6-二甲基吡嗪的濃度為2 mg/L，其余吡嗪類濃度為1 mg/L。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度：2,5/2,6-二甲基吡嗪濃度梯度為0.2 mg/L、0.4 mg/L、1 mg/L、1.6 mg/L、2 mg/L，其余吡嗪類濃度梯度為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L，且內(nèi)標(biāo)濃度均為1 mg/L，待測。

1.2.2 試驗(yàn)前處理及優(yōu)化

樣品前處理：稱取10 g（精確至0.1 g）大曲于三角瓶中，加入45 mL乙醇水溶液和5 mL內(nèi)標(biāo)使用液，超聲，離心取上層清液，0.45 μm濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取1 mL濾液至進(jìn)樣瓶中，供GC-MS分析。

分別采用15%、25%、50%、60%乙醇水溶液作為提取溶劑，確定最優(yōu)提取溶劑濃度。

加入乙醇水溶液后，分別采用20 min、30 min、60 min超聲提取吡嗪類化合物，確定最優(yōu)超聲提取時(shí)間。

1.2.3 GC條件

色譜柱為HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃；載氣為氦氣，流速1 mL/min；程序升溫起始溫度為40℃，保留5 min，然后以3.5℃/min升至90℃，再以15℃/min升至270℃，保留5 min；分流進(jìn)樣，分流比10∶1，分流流量10 mL/min，進(jìn)樣量1 μL。

1.2.4 MS條件

電子轟擊離子源（EI）；電子能量70 eV；傳輸線溫度280℃；離子源溫度230℃。

1.2.5 定性定量方法

定性：SCAN模式下采集圖譜，利用NIST 08標(biāo)準(zhǔn)譜庫定性，確定監(jiān)測離子參數(shù)。

定量：根據(jù)SCAN檢測模式得到的離子檢測參數(shù)，建立SIM檢測模式，采用內(nèi)標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)曲線法，對(duì)吡嗪類化合物定量,每個(gè)樣品測量3次。

1.2.6 方法檢出限、回收率及精密度實(shí)驗(yàn)

以信噪比S/N為3計(jì)算出方法檢出限。利用優(yōu)化的前處理方法，進(jìn)行回收率與精密度實(shí)驗(yàn)：分別取10 g大曲（同一個(gè)樣品）于三角瓶中，加入45 mL乙醇水溶液和5 mL內(nèi)標(biāo)使用液，然后添加不同濃度的吡嗪類化合物標(biāo)品，其中，2,5/2,6-二甲基吡嗪添加水平分別為0.4 mg/L、1 mg/L、2 mg/L，其余吡嗪類添加水平分別為0.2 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L，超聲，離心取上層清液，0.45 μm濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取1 mL濾液至進(jìn)樣瓶中，待測，作為加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)；每個(gè)添加水平分別做6個(gè)平行樣品，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，作為該方法的精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)品和樣品的定性檢測

定性分析：對(duì)大曲樣品圖譜的每個(gè)峰，利用NIST 08檢索每個(gè)吡嗪類化合物，然后利用2 mg/L 2,5/2,6-二甲基吡嗪和1 mg/L其余吡嗪類的標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)保留時(shí)間和定性離子驗(yàn)證，最后確定了大曲中7種吡嗪類化合物，其中保留時(shí)間和定性離子見表1。

表1 7種吡嗪類化合物監(jiān)測離子參數(shù)

定量分析：通過表1的定性分析，確定了7種吡嗪類化合物的定量離子，通過保留時(shí)間與定量離子，建立7種吡嗪類化合物的SIM檢測模式，根據(jù)內(nèi)標(biāo)法，建立吡嗪類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，大曲樣品色譜圖見圖1。

圖1 大曲樣品7種吡嗪類化合物和內(nèi)標(biāo)的色譜圖

2.2 前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取液的優(yōu)化

分別采用蒸餾和浸泡的方式對(duì)大曲吡嗪類物質(zhì)進(jìn)行提取。與浸泡方式相比，蒸餾過程極易產(chǎn)生大量氣泡，導(dǎo)致液體溢出，危險(xiǎn)且造成提取物的損失。

浸泡溶劑濃度優(yōu)化：色譜柱為弱極性色譜柱，用水作為提取劑的樣液，經(jīng)過色譜柱時(shí)，會(huì)有一定的柱流失，影響色譜柱的壽命。結(jié)合柱損與乙醇（色譜級(jí)）價(jià)格，試驗(yàn)初步定乙醇水溶液作為提取溶劑，其濃度分別為15%、25%、50%和60%，對(duì)同一大曲樣品浸泡超聲30 min提取，檢測過程相同，結(jié)果對(duì)比見圖2。

圖2 同一曲樣不同濃度乙醇水溶液吡嗪類化合物檢測結(jié)果

由圖2可知，同一大曲樣品在25%、50%、60%乙醇水溶液分別作為提取溶劑時(shí)，7種吡嗪類化合物的檢測結(jié)果相差較小，而15%乙醇水溶液作為提取溶劑，檢測結(jié)果含量最低。因此，選用濃度較低的25%乙醇水溶液對(duì)大曲進(jìn)行浸泡處理最優(yōu)。

2.2.2 超聲時(shí)間優(yōu)化

用25%乙醇水溶液，提取同一大曲樣品中吡嗪類化合物，超聲時(shí)間分別為20 min、30 min、60 min，檢測過程相同，結(jié)果對(duì)比見圖3。

圖3 同一曲樣不同超聲時(shí)間吡嗪類化合物檢測結(jié)果

由圖3可看出，對(duì)同一樣品、同一乙醇水溶液浸泡，不同超聲時(shí)間提取對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，30 min與60 min超聲對(duì)比，檢測結(jié)果相差不大；與20 min超聲相對(duì)比，檢測結(jié)果含量明顯高于20 min超聲結(jié)果含量。因此，30 min是最優(yōu)超聲時(shí)間。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測分析，系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分含量（mg/L）與內(nèi)標(biāo)含量（mg/L）的比值為X橫坐標(biāo)，吡嗪類各組分與其內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為Y縱坐標(biāo)，得到7種吡嗪類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 7種吡嗪類化合物線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

方法檢出限、試驗(yàn)回收率與精密度，結(jié)果見表3。

表3 方法檢出限、回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

由表2、表3可得，7種吡嗪類化合物線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法檢出限在2～26 μg/L之間，加標(biāo)回收率為86%～118%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%～6.55%。說明該方法適用于高溫大曲中7種吡嗪類化合物的檢測。

2.4 樣品檢測驗(yàn)證分析

按照試驗(yàn)方法對(duì)培曲及前期儲(chǔ)存期間的高溫大曲樣品進(jìn)行檢測，其7種吡嗪類化合物含量的動(dòng)態(tài)變化見圖4。

圖4 7種吡嗪類化合物在培曲及前期儲(chǔ)存期間的變化曲線

由圖4可得，7種吡嗪類化合物在培曲及前期儲(chǔ)存期間的高溫大曲中均被檢測出。其中，2,5/2,6-二甲基吡嗪的含量均明顯高于其他6種吡嗪類化合物，四甲基吡嗪的含量最低；隨發(fā)酵天數(shù)的增長，這7種吡嗪類化合物的總含量也不斷增加。吡嗪類化合物主要由芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)生[5-7]，梁晨等[8]對(duì)大曲儲(chǔ)存過程中原核生物群落結(jié)構(gòu)及風(fēng)味成分演替規(guī)律研究表明，儲(chǔ)存前期芽孢桿菌屬在高溫大曲中的含量增加，這也與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果符合。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化試驗(yàn)方法，采用GC-MS技術(shù)，建立了一種高溫大曲中7種吡嗪類化合物的檢測方法，本方法用25%乙醇水溶液，超聲30 min對(duì)大曲進(jìn)行浸泡處理，既最大程度的減少了目標(biāo)化合物的損失，也節(jié)約了成本，同時(shí)，該方法操作簡單，檢出限低，靈敏度可靠，適用于高溫大曲中吡嗪類化合物的檢測。

培曲期間（0～25 d）及前期儲(chǔ)存（第26天～80天）的高溫大曲，7種吡嗪類化合物的總含量在第80天時(shí)達(dá)到最高，可達(dá)5.455 mg/kg，其中，2,5/2,6-二甲基吡嗪的含量最高，均明顯高于其他6種吡嗪類化合物。本實(shí)驗(yàn)只對(duì)0～80 d的高溫大曲進(jìn)行了檢測，所以高溫大曲中7種吡嗪類化合物的具體變化規(guī)律及最佳儲(chǔ)存期的選擇需進(jìn)一步擴(kuò)大范圍進(jìn)行研究。