堆積酒醅中酵母菌代謝的分析研究

曹潤潔，周鵬磊 ，何宏魁，李安軍，湯有宏，芮君君

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236800； 2.安徽瑞思威爾科技有限公司，安徽亳州236826）

芝麻香型白酒兼具有濃香型、清香型和醬香型白酒的獨特風(fēng)味[1-6]，已是白酒釀造行業(yè)發(fā)展最快的香型之一。芝麻香型白酒堆積酒醅中含有豐富的微生物群落[7]，堆積酒醅中的酵母菌作為乙醇代謝的核心功能菌群之一，對白酒發(fā)酵過程中產(chǎn)香產(chǎn)酯也發(fā)揮著特有的貢獻(xiàn)[8]。根據(jù)酵母菌在芝麻香型白酒堆積發(fā)酵過程中作用不同可分為兩類酵母菌[9]：一類是在發(fā)酵堆積過程起到產(chǎn)酒功能的酵母菌[10-11]，主要是釀酒酵母，發(fā)酵能力強(qiáng)，影響芝麻香型白酒的產(chǎn)酒率；另一類是在發(fā)酵堆積過程起到生香作用的酵母菌[12-13]，即產(chǎn)酯酵母，包括假絲酵母、產(chǎn)膜酵母、異型漢遜酵母等，對芝麻香型白酒微量香氣物質(zhì)的形成起著重要作用。多種多樣的酵母能在酯酶的作用下合成其他風(fēng)味物質(zhì)，從而賦予芝麻香型白酒酒體濃郁的芳香，對酒體的豐滿具有重要作用。

本研究對堆積酒醅中的酵母菌進(jìn)行了篩選和鑒定，從中選出了3株不同種屬的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵代謝研究，以期能夠了解芝麻香型白酒酒醅堆積過程中相關(guān)酵母菌的產(chǎn)酒和風(fēng)味代謝，為今后酒醅堆積發(fā)酵過程調(diào)控提供一定的理論指導(dǎo)，最終實現(xiàn)芝麻香型白酒的酒體品質(zhì)提升。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 樣品

樣品取自安徽某酒廠調(diào)味酒生產(chǎn)車間，待酒醅堆積發(fā)酵32 h時左右取樣，樣品4℃存放備用。

1.1.2 儀器與試劑

SX-700型高壓滅菌鍋，日本TOMY；BPG-9240A型精密鼓風(fēng)烘干箱，上海一恒；ME204E型電子分析天平，梅特勒·托利多公司(上海）；BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司；ZWY-304型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智誠分析儀器制造有限公司；PCR儀，Thermo Scientific公司；核酸微量測定儀，Maestro Nano公司；7890B氣相色譜儀，美國Aglient公司；BSC-1300ⅡA2型生物安全柜蘇凈集團(tuán)；真菌基因組提取試劑盒，購自上海生工。

1.1.3 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：氯霉素2 g，麥芽汁粉130.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1000 mL，pH6.0±0.2。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母浸粉0.3 g/L，麥芽浸粉0.3 g/L，(NH4)2SO 45 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·7H2O 0.4 g/L。

1.2 試驗方法

1.2.1 篩菌培養(yǎng)

取芝麻香堆積32 h后的酒醅25 g于225 mL滅菌后的蒸餾鹽水中，室溫放入搖床中振蕩30 min；振蕩液進(jìn)行梯度稀釋至 10-6，分別取 10-4、10-5、10-6稀釋液0.2 mL涂布到篩選培養(yǎng)基上，涂布均勻后置入30℃培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)2～3 d后，便可進(jìn)行酵母菌菌落形態(tài)的觀察、分離和純化，并斜面保存菌種。

1.2.2 菌種基因提取

試劑盒提取酵母菌DNA，擴(kuò)增待鑒定菌株的26S rDNA序列，PCR反應(yīng)體系為：待鑒定菌株的染色體 DNA 1μL，10×PCR 緩沖液 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，上游引物(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3')及下游引物(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')各0.5 μL，補(bǔ)水至50 μL；PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，經(jīng)過30個循環(huán)后，72℃再延伸10 min。

1.2.3 代謝物檢測方法

酸、酯、乙酸乙酯含量檢測方法依據(jù)GB/T 10345—2007；醇和醛含量檢測方法依據(jù)GB/T 11856—2008。

1.2.4 酸性條件下酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為3.5，取150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基分裝到三角瓶中，利用接種環(huán)挑取純化后的酵母菌接種到含150 mL培養(yǎng)基三角瓶中，恒溫32℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液依1.2.3中方法檢測發(fā)酵代謝物含量。

1.2.5 堿性性條件下酵母菌發(fā)酵培養(yǎng)

調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基pH值為7.5，取150 mL分裝到三角瓶中，利用接種環(huán)挑取純化酵母菌接種到含150 mL培養(yǎng)基三角瓶中，恒溫32℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液依1.2.3中方法檢測發(fā)酵代謝物含量。

1.2.6 酵母菌失重培養(yǎng)

高粱和自來水1∶5混合后蒸煮1～2 h，加入淀粉酶液化，液化后補(bǔ)加60℃溫水一份，再按原料量的5%加入糖化酶（5萬活力單位），攪拌均勻，60℃糖化3～4 h，用稀碘液試之不顯藍(lán)，再加熱至90℃，用細(xì)白布過濾，糖度計測量并調(diào)整糖度為12°Bx。取50 mL糖化液加入100 mL三角瓶，塞上棉塞，外包油紙，加發(fā)酵栓，0.1 MPa滅菌20 min后，待冷卻至28℃時，在無菌條件下分別接入10%種子液，裝好發(fā)酵栓并按要求注入硫酸后，密封擦干稱重。置入30℃培養(yǎng)箱中發(fā)酵72 h，中間輕搖稱重及檢測酒精度。

1.2.7 3株酵母混菌發(fā)酵

利用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)畢赤酵母、釀酒酵母、異常威客漢姆酵母、畢赤酵母+釀酒酵母、異常威克漢姆酵母+釀酒酵母、畢赤酵母+釀酒酵母+異常威克漢姆酵母，種子細(xì)胞濃度達(dá)到108cfu/mL，然后按4%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，恒溫32℃，搖床150 r/min振蕩，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，取發(fā)酵液依1.2.3中方法檢測發(fā)酵代謝物含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 芝麻香酒醅酵母菌分離與鑒定

堆積酒醅中的酵母菌經(jīng)過培養(yǎng)、分離、純化，一共挑選出可疑菌株15株，對15株菌分別進(jìn)行形態(tài)觀察，基因提取，PCR擴(kuò)增后分子測序，測序的分子序列在BLAST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對后最終篩選出3株不同種屬的酵母菌，分別標(biāo)記為釀酒酵母Y1、畢赤酵母Y2、異常威克漢姆酵母Y3。

2.2 堿性條件下酵母菌代謝特征研究

由圖1可知，酵母菌在堿性條件發(fā)酵時，異常威克漢姆酵母所產(chǎn)的風(fēng)味物質(zhì)乙酸乙酯、總酯和風(fēng)味物質(zhì)總量較其他2株酵母高，其中乙酸乙酯和總酯的產(chǎn)量明顯高于畢赤酵母和釀酒酵母。3株酵母產(chǎn)酸量順序：釀酒酵母＞畢赤酵母＞異常威克漢姆酵母；3株酵母產(chǎn)醛類物質(zhì)的量相當(dāng)。

圖1 堿性條件下酵母菌代謝

2.3 酸性條件下酵母菌代謝特征研究

由圖2可知，酵母菌在酸性條件發(fā)酵時，異常威克漢姆酵母的乙酸乙酯和總酯合成量遠(yuǎn)高于畢赤酵母和釀酒酵母。發(fā)酵產(chǎn)酸類物質(zhì)含量的趨勢為：釀酒酵母＞畢赤酵母＞異常威克漢姆酵母；產(chǎn)醛和醇類物質(zhì)含量三者相當(dāng)；產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)總量趨勢為：異常威克漢姆酵母＞釀酒酵母＞畢赤酵母菌。

圖2 酸性條件下酵母菌代謝

2.4 發(fā)酵失重和產(chǎn)酒代謝研究

由圖3可知，0～48 h內(nèi)釀酒酵母菌所在的發(fā)酵組發(fā)酵失重量均較異常威克漢姆酵母和畢赤酵母單株發(fā)酵失重量大，發(fā)酵72 h時達(dá)到相對一致的失重量，異常威克漢姆酵母失重量較畢赤酵母高；由圖4可知，有釀酒酵母菌存在的發(fā)酵組，酒精度達(dá)到了6%vol以上，單獨發(fā)酵的異常威克漢姆酵母、畢赤酵母以及二者組合酒精度均在5%vol以下，由此可以看出，異常威克漢姆酵母、畢赤酵母均具有一定的產(chǎn)酒代謝能力，釀酒酵母在芝麻香酒醅中是主要的產(chǎn)酒酵母。

圖3 混合酵母菌發(fā)酵失重

圖4 混合酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒

2.5 混菌發(fā)酵代謝研究

由圖5可知，酸性(pH3.5)環(huán)境下異常威克漢姆酵母表現(xiàn)出較高的酸類、酯類及醇類物質(zhì)產(chǎn)量；混菌發(fā)酵時產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)總量較大的是異常威克漢姆酵母以及異常威克漢姆酵母與畢赤酵母的組合，試驗表明畢赤酵母不影響異常威克漢姆酵母發(fā)酵產(chǎn)香，但釀酒酵母存在時風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)量顯著降低，這可能是釀酒酵母產(chǎn)的酒精抑制了其他酵母的生長代謝。

圖5 混合酵母菌代謝

3 結(jié)論

芝麻香型白酒堆積酒醅中的3種酵母菌發(fā)酵時，均表現(xiàn)出酸性條件下較堿性條件下產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)的總量大。酸性條件下釀酒酵母產(chǎn)生醛類和酸類物質(zhì)增多，同時有利于釀酒酵母和異常威克漢姆酵母產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)，其中異常威克漢姆酵母產(chǎn)乙酸乙酯更高，而畢赤酵母在偏堿的環(huán)境中產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)。酒精發(fā)酵試驗結(jié)果顯示，有釀酒酵母參與的發(fā)酵體系，乙醇含量都在較高的水平，而另一方面，釀酒酵母的參加降低了總風(fēng)味物質(zhì)的合成，特別是乙酸乙酯。由此可以看出釀酒酵母在芝麻香型白酒堆積發(fā)酵過程中主要起到產(chǎn)酒作用，異常威克漢姆酵母和畢赤酵母主要起到產(chǎn)香作用。