外周血染色體制備方法的探討

莊建龍，王元白，莊倩梅

（泉州市婦幼保健院·兒童醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，福建泉州362000）

染色體核型分析對(duì)人類遺傳病的研究和診斷有著非常重要的意義［1］，而其中染色體G 顯帶長(zhǎng)度是診斷染色體結(jié)構(gòu)異常的關(guān)鍵［2］。秋水仙素使處于增殖周期中的分裂細(xì)胞停止在中期。秋水仙素的加入量和加入時(shí)間成為獲得中期有絲分裂細(xì)胞的關(guān)鍵［3］。通過(guò)改變秋水仙素處理時(shí)間及用量等幾個(gè)關(guān)鍵步驟，成功地改良了外周血染色體的質(zhì)量，不僅在染色體長(zhǎng)度、分散度及帶型上得到了很大程度的改善，而且也大大地縮短了制備時(shí)間，節(jié)省了人力資源。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2014年7月于本院進(jìn)行了產(chǎn)前診斷中染色體檢查的1 170例患者。

1.2 儀器與試劑 細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國(guó)SHEL LAB產(chǎn)品，淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液6mL為青島萊佛生物工程研究所產(chǎn)品，秋水仙素100μg／μL，胰酶為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品，0.075mol／L 氯化鉀低滲液，新鮮配制的固定液（甲醇∶冰醋酸＝3∶1），pH7.4和pH6.8磷酸鹽緩沖液，吉姆薩染液購(gòu)自青島萊佛生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 接種 用肝素濕潤(rùn)注射器無(wú)菌操作抽取2 mL 靜脈血，取外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液溶解，碘伏消毒培養(yǎng)瓶蓋后，在酒精燈火焰旁加入0.5mL血標(biāo)本（與本室常規(guī)制備一致）。

1.3.2 培養(yǎng) 將接種后標(biāo)本置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68～72h（與本室常規(guī)制備一致）。

1.3.3 收獲 收獲前15 min加入100μg／μL 秋水仙素50 μL，將培養(yǎng)的細(xì)胞移入10 mL 刻度離心管中，2 000r／min離心10min（本室常規(guī)操作為收獲細(xì)胞前1h加入100μg／μL秋水仙素17μL，2 000r／min離心10min。

1.3.4 低滲 離心l0min棄上清液后加入8mL 0.075mol／L的KCl低滲液，吹打均勻后置于37℃水浴箱15min，取出離心管加入新鮮配制的固定液（甲醇∶乙酸＝3∶1）0.5mL［4］預(yù)固定10min，以2 000r／min離心10min（本室常規(guī)操作為低滲30min，加入2mL固定液預(yù)固定，2 000r／min離心10min）。

1.3.5 固定 離心后棄去上清，加入新鮮配制的固定液（甲醇∶乙酸＝3∶1）8mL，混勻后室溫放置30min，2 000r／min離心10min后，重復(fù)以上步驟進(jìn)行再固定。最后根據(jù)沉淀量多少制備出濃度大致一致的混懸液（0.5～1mL），本室常規(guī)操作為2 000r／min離心10min。

1.3.6 推片 吸取2～4滴細(xì)胞懸液滴于潔凈載玻片上，每人制2～3片，吸取30μL左右懸液吹散，酒精燈過(guò)火后將制備的染色體標(biāo)本片置鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)70℃3h進(jìn)行老化，取出后自然冷卻至室溫（本室常規(guī)操作為60 ℃3h）。染色顯帶方法參考《人類染色體方法學(xué)手冊(cè)》［5］。

1.4 分散效果判斷 在20個(gè)計(jì)數(shù)分裂相中計(jì)數(shù)：（1）不合格標(biāo)本判斷標(biāo)準(zhǔn)為染色體相互纏繞或重疊小于等于2條的核型小于或等于50%（10／20）；（2）合格標(biāo)本的判斷標(biāo)準(zhǔn)為染色體相互纏繞或重疊小于等于2 條的核型為50%～75%［（10～15）／20］；（3）最佳標(biāo)本的判斷標(biāo)準(zhǔn)為染色體相互纏繞或重疊小于等于2條的核型大于或等于75%（15／20）。

1.5 帶型效果判斷 在20個(gè)計(jì)數(shù)分裂相中，不合格標(biāo)本：染色體長(zhǎng)度較短，染色體帶紋不清，但可以辨認(rèn)出2 號(hào)、4 號(hào)、6號(hào)、13號(hào)、17號(hào)、20號(hào)及22 號(hào)染色體特征性帶型；合格標(biāo)本：可以清楚地辨認(rèn)2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、13號(hào)、17號(hào)、20號(hào)及22號(hào)染色體特征性帶紋，其中染色體可分析且長(zhǎng)度較理想的核型5%～25%［（1～5）／20］；最佳標(biāo)本：在合格標(biāo)本上，染色體可分析且長(zhǎng)度理想的核型大于或等于25%（5／20）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 隨機(jī)抽取改良前和改良后標(biāo)本各200份，進(jìn)行分散效果和帶型效果判斷，用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

與本室常規(guī)處理（圖1A、1B）相比，改良后的外周血染色體分散度好，分裂相多，長(zhǎng)度更長(zhǎng)，帶型清晰，染色穩(wěn)定易于控制，非常適合批量處理（見(jiàn)圖1C、1D）。改良后染色體長(zhǎng)度更長(zhǎng)，分散度更好，顯示帶型增多，更有利發(fā)現(xiàn)異常染色體，減少了漏診率，值得推廣應(yīng)用。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，改良后與改良前的分散度及帶型的合格率與最佳率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1、2。

圖1 改良前后的染色體帶型圖

表1 改良前后染色體分散效果比較

表2 改良前后染色體顯帶效果比較

3 討 論

通過(guò)對(duì)秋水仙素，低滲，預(yù)固定和固定等步驟的改良，制備出的染色體標(biāo)本相比本室常規(guī)制備的染色體標(biāo)本不僅有更好分散度，染色體長(zhǎng)度更長(zhǎng)，帶型顯示更多，而且制備更穩(wěn)定。

首先，秋水仙素為細(xì)胞培養(yǎng)中使用的紡錘體阻斷劑，它使正在分裂的細(xì)胞停留在分裂中期，以獲得大量中期分裂相供分析研究所用。在血細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，秋水仙素加入的劑量、濃度及處理時(shí)間與中期分裂相的多少和染色體長(zhǎng)短有密切的關(guān)系［6－7］。秋水仙素加入量過(guò)多，染色體太短，加入量太少，染色體瘦長(zhǎng)或很少中期分裂相。因此，加入較高濃度短時(shí)間的處理，將本室常規(guī)制備時(shí)秋水仙素的終濃度由0.28μg／μL，調(diào)整至0.83μg／μL，處理時(shí)間由1h縮短至15min，不僅提高了效率，而且獲得了較多的分裂相，更長(zhǎng)的染色體，顯示更多帶型，有利于異常染色體的檢出。有文獻(xiàn)報(bào)道加入100μg／μL 秋水仙素100μL［6］，筆者認(rèn)為其染色體長(zhǎng)度及帶型未達(dá)到最佳，可能是秋水仙素用量過(guò)多導(dǎo)致染色體收縮。改良后的染色體制備方法，加入50μL 秋水仙素，能夠得到滿意的染色體長(zhǎng)度及帶型。

其次，低滲技術(shù)是染色體培養(yǎng)中的光鍵環(huán)節(jié)，低滲時(shí)間長(zhǎng)短關(guān)系到分散的好壞。處理時(shí)間多長(zhǎng)，將導(dǎo)致細(xì)胞膜過(guò)早破裂，造成分裂中期細(xì)胞丟失；處理時(shí)間過(guò)短，細(xì)胞膨脹不足，則染色體分散不佳。低滲處理適當(dāng)，所得染色體分散度好，輪廓清楚，可染色強(qiáng)，在顯帶染色時(shí)能很好地顯示帶型特征［8］。因此，筆者將本室常規(guī)制備低滲時(shí)間30min改良為15min，獲得染色體的分散度好，可染色性強(qiáng)，帶型顯示穩(wěn)定，同時(shí)也提高了工作效率。

再次，預(yù)固定也是染色體制備的一個(gè)重要影響因素，桂俊豪等［9］的研究表明，當(dāng)預(yù)固定液劑量占總體積的1.25%、2.50%或3.75%時(shí)，染色體分散質(zhì)量較好，可用核型多；預(yù)固定液比例大于或等于6.25%可導(dǎo)致細(xì)胞間相互粘連，且染色體間相互積聚的傾向更為明顯。因此，筆者將原來(lái)的預(yù)固定液劑量由2mL改良為500μL，約占總體積的3.75%，處理后發(fā)現(xiàn)較少的預(yù)固定液能夠獲得更加干凈的沉淀和良好的分散度，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，改良后染色體的分散度與改良前有明顯差異。

固定應(yīng)徹底，吹打不要太用力，以免細(xì)胞破裂，染色體丟失。若固定不徹底，染色體分散不佳，可重復(fù)固定或延長(zhǎng)固定時(shí)間。

最后，經(jīng)過(guò)大量的實(shí)踐證明，改良后的方法在各個(gè)方面都優(yōu)于常規(guī)操作方法。該法不僅在染色體的質(zhì)量上有了大大的提升，而且提高了工作效率，值得廣泛的推廣。

［1］周煥庚，夏家輝，張思仲.人類染色體［M］.北京：科學(xué)出版社，1987：48－63.

［2］張鳳芹，丁紅煒，石慶芳，等.關(guān)于外周血染色體制備方法的改進(jìn)［J］.中國(guó)誤診學(xué)雜志，2008，8（5）：1198.

［3］陳秀云.外周血染色體制作方法改進(jìn)［J］.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2006，33（5）：796－799.

［4］斯佩克特，戈德曼，萊因萬(wàn)德.生物學(xué)指南［M］.黃培堂，譯.北京：科學(xué)出版社，2002：1067－1068.

［5］高錦聲，鄭斯莢，陳嘉政，等.人類染色體方法學(xué)手冊(cè)：修訂本［M］.南京：江蘇省醫(yī)學(xué)情報(bào)研究所，1981.

［6］謝志威，張晶，李衛(wèi)凱.外周血染色體制備改良方法的應(yīng)用［J］.國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34（1）：82－83.

［7］張穎珍.人體外周血染色體G 顯帶制備時(shí)的影響因素及補(bǔ)救措施［J］.中國(guó)優(yōu)生優(yōu)育，2010，16（5）：265－267.

［8］慕明濤，霍滿鵬，蒲力群，等.人外周血染色體標(biāo)本制備失敗的影響因素分析［J］.延安大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2007，5（4）：3.

［9］桂俊豪，黃國(guó)香，王錚，等.Carnoy′s預(yù)固定劑量對(duì)中期染色體分散度的影響［J］.國(guó)際遺傳學(xué)雜志，2006，29（6）：416－419.