快速測(cè)定片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

于金巖 張玲玲

青島雙鯨藥業(yè)股份有限公司 山東青島 266000

快速測(cè)試片是一種預(yù)先制備好的一次性培養(yǎng)基制品，含有微生物生長所需營養(yǎng)物質(zhì)及顯色劑，具有操作簡便、便于運(yùn)輸、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

1 微生物檢驗(yàn)的內(nèi)容及特點(diǎn)

我國微生物檢驗(yàn)主要內(nèi)容包括：菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌、霉菌及其毒素等微生物指標(biāo)。菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)是衡量衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)是否合格的重要指標(biāo)。致病菌主要包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、銅綠假單胞菌、李斯特氏菌、副溶血性弧菌等。近年來，《國家安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則（2018-2021年版）》越來越重視微生物項(xiàng)目的檢測(cè)，幾乎所有的大類均需要檢測(cè)微生物。在一些種類中開展了特定的致病菌檢驗(yàn)，包括包裝飲用水中新增了“銅綠假單胞菌”，預(yù)包裝熟肉制品中檢測(cè)“單核細(xì)胞增生李斯特氏菌”等。

微生物檢驗(yàn)的主要具備的特點(diǎn)是及時(shí)性、準(zhǔn)確性、廣泛性、干擾性。在原材料中存在的微生物種類豐富多樣，且會(huì)迅速繁殖，另外保質(zhì)期有限，因此，對(duì)微生物的檢測(cè)需及時(shí)有效，確保檢測(cè)數(shù)據(jù)及結(jié)果的準(zhǔn)確可靠；也可對(duì)多種微生物元素同時(shí)檢測(cè)，以節(jié)約檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率。這也體現(xiàn)了微生物檢測(cè)的廣泛性，不僅可以檢測(cè)出中添加的微生物，還可以檢測(cè)出各種致病微生物。另外，原料中污染途徑較多，對(duì)檢測(cè)工作存在一定的干擾[1]。

2 快速測(cè)定片在微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

2.1 將濾紙作為載體的測(cè)試片

在選擇測(cè)試微生物的濾紙時(shí)需嚴(yán)格檢查其質(zhì)量，并保證選用的濾紙無毒、吸附性強(qiáng)、尺寸為4cm×5cm。隨后在無菌培養(yǎng)基中添加TTC，并運(yùn)用無菌濾紙進(jìn)行吸附，接著再對(duì)其進(jìn)行干燥處理，在這些步驟完成后就可將其放入聚丙烯材質(zhì)的袋子中保存。在無菌培養(yǎng)基中添加TTC的主要目的是運(yùn)用其氧化還原特性，讓其與氫進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)兩者發(fā)生反應(yīng)后，培養(yǎng)基中能夠看到較為明顯的紅點(diǎn)，通過計(jì)算紅點(diǎn)，即可計(jì)算出細(xì)菌的數(shù)量。當(dāng)然在采取這一方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需要科學(xué)合理控制TTC的使用，避免影響后續(xù)的檢測(cè)結(jié)果。專業(yè)人員在測(cè)試時(shí)，還需合理控制培養(yǎng)基的溫度，一般會(huì)控制在37℃左右，測(cè)試時(shí)間大約為17h。

2.2 立足于染色法的大腸菌群測(cè)試片

這一方法需要制作浸液，這就需要對(duì)乳化劑、瓊脂以及TTC等用料進(jìn)行細(xì)致的把控，設(shè)置滅菌溫度115℃，浸泡溫度60℃、烘干溫度55℃，調(diào)整pH范圍為6.8-7.0，培養(yǎng)時(shí)間為17h。若培養(yǎng)基里出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，外周黃暈或紙片產(chǎn)生黃色背景，在黃色背景上出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)或片狀黃暈者為陽性。不過需要注意的是，培養(yǎng)液中的選擇性以及生物酶作用中的特異性，都會(huì)直接影響到大腸菌群測(cè)試片的最后測(cè)驗(yàn)結(jié)果?；诖耍嚓P(guān)專業(yè)人員需要嚴(yán)格檢測(cè)TTC和瓊脂粉的用量[2]。

2.3 熒光法大腸桿菌測(cè)試片檢測(cè)微生物

細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生一些代謝酶或產(chǎn)物，可以根據(jù)細(xì)菌的這一特性，建立酶-底物反應(yīng)法。工作人員將即將進(jìn)行檢測(cè)細(xì)菌所需的養(yǎng)料、酶促底物和抑制雜菌的成分固相化在紙片上，然后檢測(cè)大腸菌群與大腸桿菌所產(chǎn)生的有關(guān)酶的活性，進(jìn)而達(dá)成細(xì)菌計(jì)數(shù)這一目的?，F(xiàn)有的兩種測(cè)試片能夠?qū)Υ竽c菌群與大腸桿菌進(jìn)行檢測(cè)，這兩種細(xì)菌都需在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，然后24h后使用波長為365nm的熒光燈進(jìn)行檢測(cè)，得出具體結(jié)果。

2.4 以Petrifilm為基礎(chǔ)的測(cè)試片

Petrifilm測(cè)試片主要由上下兩層薄膜組建而成，下層薄膜的主要材質(zhì)為聚乙烯，它上面有網(wǎng)格，覆蓋于培養(yǎng)基上，而上層則主要是聚丙烯薄膜。微生物生長和生化實(shí)驗(yàn)需要的營養(yǎng)試劑，通過冷水可溶性凝膠劑附著在上下兩層薄膜上。Petrifilm測(cè)試片在國際上也得到了廣泛認(rèn)可，我國也有400多個(gè)實(shí)驗(yàn)室采用這一測(cè)試片檢測(cè)微生物，這一測(cè)試片的主要檢測(cè)對(duì)象為：大腸菌群、金黃色葡萄球菌。這一檢測(cè)方法效率較高，檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性也較高，值得被信賴。

2.5 菌落總數(shù)測(cè)試片的使用

將1mL樣品滴入紙片中央，然后將原本翻開的膠片進(jìn)行回蓋操作，從而保證樣品的均勻性。為了保證凝膠的固化作用，需要靜置1min，這一測(cè)試方法也需要在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，其培養(yǎng)時(shí)間大約為48h。

2.6 測(cè)試霉菌和酵母菌

檢測(cè)霉菌及酵母菌的含量主要運(yùn)用到了營養(yǎng)物質(zhì)和菌落生長指示劑等。對(duì)這類真菌的培養(yǎng)溫度需要保持在21-25℃，時(shí)間為3-5d。酵母菌菌落主要為小型菌落，且有著明顯的邊緣，菌落為灰白色到藍(lán)綠色，也會(huì)呈現(xiàn)出粉色，顏色較為一致，中心也沒有暗色表現(xiàn)。霉菌菌落較大，質(zhì)地也較為疏松，外觀表現(xiàn)主要為干燥，不透明，還會(huì)呈現(xiàn)出一種或緊或松的狀態(tài)，顏色也較為雜亂，同時(shí)還具有扁平性特點(diǎn)[3]。

3 微生物檢驗(yàn)質(zhì)量控制

微生物檢測(cè)質(zhì)量控制是生物實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的重要環(huán)節(jié)，其在微生物檢測(cè)過程中至關(guān)重要。影響微生物檢測(cè)的質(zhì)量控制要素較多，如實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)、檢測(cè)人員素質(zhì)、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、樣品采集與保存、檢測(cè)方法及檢測(cè)過程、儀器設(shè)備是否檢定、培養(yǎng)基及試劑耗材的有效性、標(biāo)準(zhǔn)菌株的合理管理等都是影響檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確與否的直接因素。這些環(huán)節(jié)相互影響，保證每一個(gè)環(huán)節(jié)的質(zhì)量，確保測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)常規(guī)的質(zhì)量控制方式有：開展空白對(duì)照、對(duì)培養(yǎng)基試劑及標(biāo)準(zhǔn)菌株的質(zhì)控、開展盲樣考核、平行實(shí)驗(yàn)、標(biāo)準(zhǔn)菌株陰陽性對(duì)照、留樣復(fù)測(cè)、人員比對(duì)、儀器比對(duì)、實(shí)驗(yàn)時(shí)間比對(duì)等。實(shí)驗(yàn)室每年應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)檢測(cè)工作量統(tǒng)計(jì)情況、人員情況、內(nèi)部審核結(jié)果、儀器設(shè)備情況、環(huán)境狀況、檢驗(yàn)檢測(cè)方法變更及查新、檢測(cè)報(bào)告出現(xiàn)的問題等方面，及時(shí)制定適合實(shí)驗(yàn)室自身發(fā)展的質(zhì)量管理計(jì)劃，組織管理人員開展實(shí)施計(jì)劃，并對(duì)質(zhì)量控制結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

3.1 實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系的構(gòu)建

微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系的規(guī)范運(yùn)行，需要建立完整的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系制度，通過體系、制度科學(xué)的管理實(shí)驗(yàn)室，所有工作均應(yīng)有相應(yīng)的程序文件、工作指導(dǎo)書支持，檢測(cè)人員的實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)符合操作規(guī)范，有效提升實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)水平和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.2 對(duì)人員和環(huán)境的控制

微生物檢測(cè)人員應(yīng)具備相關(guān)專業(yè)或者微生物學(xué)專業(yè)背景知識(shí)，應(yīng)滿足國家對(duì)從事微生物檢驗(yàn)檢測(cè)工作的任職要求，并應(yīng)具備熟練的實(shí)際操作經(jīng)驗(yàn)。在開展微生物檢測(cè)工作時(shí)，檢測(cè)人員應(yīng)具備良好的職業(yè)道德，具備耐心、細(xì)心和責(zé)任心，具備較強(qiáng)的綜合素質(zhì)、技術(shù)能力，具備終身學(xué)習(xí)的理念。檢測(cè)人員開展實(shí)驗(yàn)前應(yīng)進(jìn)行崗前培訓(xùn)，并定期開展有關(guān)微生物檢測(cè)方法和生物安全方面的培訓(xùn)活動(dòng)，不斷提高自身專業(yè)素養(yǎng)，培養(yǎng)責(zé)任意識(shí)。檢測(cè)人員應(yīng)多參加檢測(cè)技術(shù)交流會(huì)，掌握國內(nèi)外先進(jìn)的微生物檢驗(yàn)技術(shù)研究進(jìn)展，提高自身專業(yè)素質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)效率，進(jìn)而更好地適應(yīng)不斷更新的檢測(cè)要求。同時(shí)，檢驗(yàn)人員需具備良好的個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣，定期體檢。在微生物檢測(cè)質(zhì)量控制過程中，對(duì)工作人員的技能水平不斷提升，同時(shí)引進(jìn)先進(jìn)的微生物檢測(cè)技術(shù)，使檢測(cè)人員掌握全新的微生物檢測(cè)技術(shù)，積累實(shí)驗(yàn)?zāi)芰胺治雠袛嗄芰?，為檢測(cè)提供更好的服務(wù)。

檢測(cè)人員應(yīng)嚴(yán)格按照微生物檢驗(yàn)環(huán)境監(jiān)測(cè)要求，對(duì)操作環(huán)境進(jìn)行科學(xué)配置，制定完善的微生物室環(huán)境管理制度，定期檢查實(shí)驗(yàn)所需要的溫濕度以及清潔度。實(shí)驗(yàn)室各間的規(guī)劃須符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求，遵循單項(xiàng)檢測(cè)流程原則，避免檢測(cè)結(jié)果交叉污染而產(chǎn)生誤差。針對(duì)無菌操作區(qū)域，實(shí)驗(yàn)前必須經(jīng)紫外線消毒30min后進(jìn)行檢測(cè)工作。檢測(cè)工作結(jié)束后，及時(shí)做好消殺工作，妥善處理檢驗(yàn)后的樣品及廢棄物。定期開展紫外燈期間核查工作，確保微生物檢驗(yàn)樣品不受環(huán)境的影響，保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境整潔。

3.3 對(duì)儀器設(shè)備及試劑耗材的控制

檢測(cè)人員應(yīng)定期核查高壓滅菌器的壓力表、培養(yǎng)箱的溫度、冰箱的溫度、環(huán)境的溫濕度、紫外線的消毒能力等。在檢測(cè)過程中，必須具備完備的檢測(cè)設(shè)備，并且正確的使用相關(guān)設(shè)備。按照檢測(cè)機(jī)構(gòu)《程序文件》的相關(guān)要求，定期清潔儀器設(shè)備，做好儀器設(shè)備的檢定、校準(zhǔn)、維護(hù)保養(yǎng)及期間核查工作。定期更換檢測(cè)儀器和設(shè)備，淘汰廢舊設(shè)備，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。對(duì)檢測(cè)儀器進(jìn)行定期維護(hù)保養(yǎng)，運(yùn)用先進(jìn)的監(jiān)控技術(shù)對(duì)微生物檢測(cè)儀器進(jìn)行全方位監(jiān)控，保證儀器的穩(wěn)定性，使微生物檢測(cè)質(zhì)量得到保證。檢測(cè)設(shè)備的不穩(wěn)定直接導(dǎo)致檢測(cè)人員分析和判斷出現(xiàn)偏差或錯(cuò)誤，影響檢測(cè)結(jié)果。

培養(yǎng)基與試劑耗材對(duì)微生物培養(yǎng)的成敗及樣品的合格率構(gòu)成決定性影響。同時(shí)，要保證培養(yǎng)基與試劑處于有效期內(nèi)，并將培養(yǎng)基與試劑存儲(chǔ)于滿足要求的環(huán)境內(nèi)，以便為檢測(cè)效果提供保障。定期開展培養(yǎng)基與試劑的技術(shù)性驗(yàn)收，做好一次性耗材的驗(yàn)收工作。配置培養(yǎng)基時(shí)，按照說明指導(dǎo)的要求規(guī)范操作，及時(shí)滅菌處理。定期核查培養(yǎng)基的有效期及性能測(cè)試。

3.4 對(duì)方法的選擇和檢測(cè)過程的控制

我國與微生物檢測(cè)有關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)主要包括國家標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。在開展檢測(cè)工作時(shí)，應(yīng)選擇現(xiàn)行有效的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)開展實(shí)驗(yàn)。若可供選擇的檢測(cè)方法有多種，需以產(chǎn)品明示的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)或客戶要求的標(biāo)準(zhǔn)為主；當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)方法或權(quán)威機(jī)構(gòu)發(fā)布的檢驗(yàn)檢測(cè)方法均無法滿足檢測(cè)要求時(shí)，則使用其他非標(biāo)準(zhǔn)方法，如超出其預(yù)定范圍使用的標(biāo)準(zhǔn)方法、實(shí)驗(yàn)室自制方法、修改過的標(biāo)準(zhǔn)方法等。實(shí)驗(yàn)室在采用相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)工作前，應(yīng)對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，必要時(shí)進(jìn)行方法的確認(rèn)[4]。

在開展微生物檢測(cè)工作過程中，應(yīng)嚴(yán)格按照我國微生物檢驗(yàn)系列標(biāo)準(zhǔn)開展業(yè)務(wù)。按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的相關(guān)要求開展實(shí)驗(yàn)操作，合理進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。微生物檢測(cè)包含了樣品采集、樣品運(yùn)輸、樣品核對(duì)以及保存、樣品檢測(cè)及培養(yǎng)、結(jié)果分析、數(shù)據(jù)處理、報(bào)告生成等流程。在開展樣本測(cè)試時(shí)，應(yīng)嚴(yán)格按照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣本處理。配制試劑時(shí)，嚴(yán)格按照技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)配制，采用高壓濕熱滅菌法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行高溫滅菌。實(shí)驗(yàn)前對(duì)無菌室進(jìn)行紫外消毒，沉降菌檢測(cè)工作，檢測(cè)人員做好自身防護(hù)，實(shí)驗(yàn)過程中注意規(guī)范操作，避免交叉污染，做好空白對(duì)照、陰陽性對(duì)照，必要時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)樣品的陰性、陽性結(jié)果進(jìn)行對(duì)照分析，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。實(shí)驗(yàn)室監(jiān)督員應(yīng)對(duì)檢測(cè)人員做好監(jiān)督，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)整改。檢測(cè)結(jié)束后，需妥善處理垃圾等廢棄物。另外，需加強(qiáng)檢測(cè)方法及技術(shù)的研發(fā)及創(chuàng)新工作，低成本、高效率、易操作、高準(zhǔn)確性等優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)技術(shù)是未來的研究方向。

3.5 對(duì)樣品采集和保存樣品的控制

樣品采集是微生物檢驗(yàn)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同的樣品有不同的采集和保存方法，采樣不規(guī)范或樣品保存不當(dāng)均會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。樣品采集應(yīng)在無菌環(huán)境下開展，所使用的采樣工具和容器均應(yīng)是經(jīng)過完全消毒或滅菌，采集的樣品需具有代表性，符合檢驗(yàn)要求。采樣人員應(yīng)熟練操作，避免對(duì)樣品進(jìn)行污染，采樣完成后及時(shí)記錄樣品信息，及時(shí)將樣品存放在無菌容器中并進(jìn)行標(biāo)記。需即刻檢測(cè)的樣品應(yīng)立即送回實(shí)驗(yàn)室開展檢測(cè)，對(duì)于需要暫時(shí)存儲(chǔ)地樣品須在規(guī)定條件下放置。在樣品運(yùn)輸環(huán)節(jié)，應(yīng)避免樣品在運(yùn)輸和存儲(chǔ)過程中受到外界污染，避免樣品外溢或微生物數(shù)量發(fā)生變化。樣品從采樣到送入實(shí)驗(yàn)室越快越好，最好24h內(nèi)完成檢測(cè)。樣品到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)先對(duì)樣品進(jìn)行核對(duì)，檢查外觀是否完好。

3.6 微生物檢測(cè)外部質(zhì)量控制

微生物檢測(cè)外部質(zhì)量控制是對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)綜合能力的評(píng)判。實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量控制是對(duì)微生物檢測(cè)內(nèi)部質(zhì)量控制的補(bǔ)充，更是提高微生物檢測(cè)效率的重要手段[5]。微生物實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量控制的主要手段有國家相關(guān)部門組織的能力驗(yàn)證考核、盲樣考核、國家監(jiān)管部門下發(fā)的監(jiān)督考核盲樣、實(shí)驗(yàn)室留樣復(fù)測(cè)、仲裁檢驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)等多重形式的考核。為確保微生物檢測(cè)的實(shí)際質(zhì)量，一般可將多種外部質(zhì)量控制手段聯(lián)合使用，最大程度上保障微生物檢測(cè)的真實(shí)質(zhì)量。

4 結(jié)語

檢測(cè)微生物時(shí)使用的快速測(cè)試片法，其操作過程較為簡單，而且在消毒保存與運(yùn)輸攜帶方面也較為便利?？焖贉y(cè)試片也較為經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，對(duì)環(huán)境也不會(huì)造成污染，這使得微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)其極為青睞，不僅能節(jié)約成本，也符合綠色化發(fā)展需求。