TRPC3、TRPC6通道與心血管疾病的研究進(jìn)展

譚慧玲，趙士弟

隨著我國人口老齡化的不斷加劇，心血管疾病患病率及死亡率仍處于上升階段[1]。經(jīng)典瞬時(shí)受體電位C亞族(canonical transient receptor potential，TRPC)3、6通道是哺乳動物TRPC通道的核心成員。近年來的研究[2]表明，盡管TRPC3、TRPC6通道在人體組織普遍表達(dá)，但它們以高度特異的方式控制心血管系統(tǒng)的功能。本文就TRPC3、TRPC6通道及其與心血管疾病的研究進(jìn)展作一綜述。

1 TRPC3、TRPC6通道

持續(xù)光刺激可誘導(dǎo)突變體果蠅的光感受器細(xì)胞出現(xiàn)瞬時(shí)受體電位(transient receptor potential，TRP)，表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的短暫升高[3]。這種不同于野生型果蠅胞內(nèi)鈣濃度持續(xù)升高的視覺傳導(dǎo)缺陷由某種離子通道缺陷引起，因此該類離子通道被命名為TRP通道。迄今已發(fā)現(xiàn)30多種TRP通道家族成員[4]，被分為7個(gè)亞家族：TRPC(canonical)、TRPA(ankyrin)、TRPN(NOMP-C)、TRPM(melastatin)、TRPML(muco-lipin)、TRPV(vanilloid)和TRPP(polycystic)[5]。根據(jù)氨基酸同源性，人TRPC(hTRPC)通道亞家族分為：hTRPC4/5、hTRPC3/6/7、hTRPC1(hTRPC2是假基因)，hTRPC3/6/7通道有70%～80%的氨基酸同源性，且hTRPC3基因是第一個(gè)被克隆的TRPC家族基因[6]。

TRPC通道為非選擇性陽離子通道，但其對鈣離子的選擇性更高，且不同的TRPC通道具有不同的Ca2+、Na+通透比值(PCa2+/PNa+)[7]。當(dāng)受到各種外部理化因素刺激時(shí)，TRPC通道被激活，引發(fā)外鈣內(nèi)流，同時(shí)與下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑協(xié)調(diào)以改變基因表達(dá)，從而調(diào)節(jié)多種不同的病理模式和機(jī)制，如影響心血管類型細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移等生理病理過程。同時(shí)，在心血管系統(tǒng)細(xì)胞(如心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞)上存在著TRPC3、TRPC6通道的廣泛表達(dá)[8]。因此，相關(guān)通道包括TRPC3、TRPC6通道在內(nèi)的TRP通道的發(fā)現(xiàn)不僅是鈣離子進(jìn)入通道分子基礎(chǔ)認(rèn)定的新起點(diǎn)，更極大地促進(jìn)了心血管疾病的研究發(fā)展[9]。

2 TRPC3、TRPC6通道的結(jié)構(gòu)

TRPC3、TRPC6通道是由單個(gè)TRPC3、TRPC6亞基組成的具有可變鈣離子滲透性的同源四聚體或異四聚體[10]。單個(gè)TRPC3、TRPC6通道作為TRPC通道四聚體的亞基發(fā)揮作用，它們通過同源聚合或相互異源聚合分別形成同源四聚體或異四聚體通道復(fù)合物[10]。TRPC3通道由全長836個(gè)氨基酸序列組成，而TRPC6通道的氨基酸數(shù)則為931個(gè)。單個(gè)TRPC3、TRPC6亞基二者均為存在于細(xì)胞膜上的六次跨膜蛋白，結(jié)構(gòu)中的六個(gè)跨膜螺旋將形成整個(gè)四聚體通道的跨膜孔。此外，它們還具有位于細(xì)胞質(zhì)中的碳(C)末端卷曲螺旋基序和氮(N)末端，后者含有4個(gè)錨蛋白重復(fù)序列[11]。

上述結(jié)構(gòu)元素如何組裝成四聚體TRPC通道四聚體在很大程度上是未知的。2018年，TANG等[12]通過低溫電子顯微鏡(cryo-EM)研究，率先確定了TRPC3、TRPC6通道四聚體在脂質(zhì)納米圓盤中的高分辨率(分辨率分別為3.8 ?、4.4 ?)結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)揭示了TRP通道系列的新架構(gòu)。該團(tuán)隊(duì)將哺乳動物細(xì)胞過表達(dá)的TRPC6蛋白在洗滌劑膠束中純化并重構(gòu)成納米圓盤用于單顆粒分析，并利用cryo-EM研究抑制劑BTDM與TRPC6通道形成復(fù)合物，以穩(wěn)定閉合狀態(tài)下的TRPC6通道。結(jié)果發(fā)現(xiàn),TRPC6通道四聚體的四個(gè)亞基對稱構(gòu)象，產(chǎn)生了兩層結(jié)構(gòu)：細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域?qū)?ICD)和跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)?TMD)。中央四重旋轉(zhuǎn)軸垂直于兩個(gè)層。ICD具有倒置的鐘形形狀，并且罩于TMD的離子通道孔下方。C末端的氨基酸折疊成兩個(gè)長螺旋，即C-末端螺旋1(CH1)和C-末端螺旋2(CH2)。CH1從外圍水平延伸到通道中心，并通過90°轉(zhuǎn)彎垂直連接到CH2。TRPC3通道四聚體的高分辨率結(jié)構(gòu)與TRPC6相似，但某些結(jié)合位點(diǎn)存在差異，如TRPC3通道四聚體的cryo-EM圖譜中BTDM結(jié)合位點(diǎn)缺乏強(qiáng)密度。

3 TRPC3、TRPC6通道的激活

最初的研究發(fā)現(xiàn)TRPC3、TRPC6通道的激活與鈣庫操控性鈣內(nèi)流(store operated Ca2+entry，SOCE)密切相關(guān)，但后期研究表明TRPC3、TRPC6通道的激活和其介導(dǎo)的Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的突出機(jī)制是其與二酰基甘油(diacylglycerol，DAG)的直接相互作用[2]，后者與受體操控性鈣內(nèi)流(receptor-operated Ca2+entry，ROCE)密切相關(guān)[13]。

具體激活機(jī)制如下：(1)內(nèi)、外源性配體及細(xì)胞內(nèi)信號分子，如血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)、內(nèi)皮素-1(endothelin1，ET-1)、苯腎上腺素(phenylephrine，PE)等與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCR)結(jié)合；(2)配體受體復(fù)合物活化G蛋白(G protein，GP)；(3)GP激活靶蛋白磷脂酶C(PLC)的酶活性；(4)PLC 水解4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)生成第二信使：4，5-三磷酸肌醇(IP3)和DAG；(5)DAG直接激活TRPC3、TRPC6通道，引發(fā)胞外鈣內(nèi)流；(6)IP3與鈣庫(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或肌質(zhì)網(wǎng))上的IP3門控鈣通道結(jié)合，引起鈣庫排空；(7)鈣庫排空引起Ca2+與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上基質(zhì)相互作用蛋白(stromal interaction molecule，STIM)的cEF手性結(jié)構(gòu)域解離，STIM1構(gòu)象變化并多聚化[14]；(8)多聚化的STIM1移向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜連接處，與位于細(xì)胞膜的Orai單體結(jié)合，使其六聚體化形成Orai鈣離子通道，引發(fā)外鈣內(nèi)流[15]。其中1～5構(gòu)成ROCE；1～4、6～8構(gòu)成SOCE，研究[16]認(rèn)為 TRPC1和TRPC4可能參與SOCE 的通道組成，與SOCE的主要參與者Orai和STIM一致或同時(shí)發(fā)揮作用，而TRPC3、TRPC6通道則與Orai相互作用影響SOCE[17]。

參與TRPC3、TRPC6通道激活的ROCE機(jī)制主要如下：內(nèi)、外源性配體及細(xì)胞內(nèi)信號分子等(如Ang Ⅱ、ET-1、PE)與GPCR結(jié)合形成配體受體復(fù)合物，并以此活化細(xì)胞膜的GP。隨后活化的GP激活其靶蛋白PLC的酶活性，使其水解PIP2生成IP3和DAG。DAG可直接激活TRPC3、TRPC6通道完成ROCE途徑，而IP3則參與SOCE途徑的發(fā)生。由此可見，ROCE與SOCE是不同但有重疊的過程[13]。SOCE基本機(jī)制如下：IP3與鈣庫(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或肌質(zhì)網(wǎng))上的IP3門控鈣通道結(jié)合，導(dǎo)致鈣庫排空，鈣庫耗竭狀態(tài)隨即引起作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣感受器的STIM1構(gòu)象改變并被激活[14]，活化的STIM1移向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)膜連接處，與位于細(xì)胞膜的鈣離子通道Orai1結(jié)合，共同形成SOCE通道復(fù)合物，引發(fā)外鈣內(nèi)流[15]。研究[16]認(rèn)為 TRPC1、TRPC4通道與STIM1、Orai1一同組成SOCE通道復(fù)合物而參與SOCE，而TRPC3、TRPC6通道則通過與Orai1的相互作用影響STIM1對鈣庫耗竭狀態(tài)的敏感性參與SOCE[17]。

而在TRPC3、TRPC6通道激活的調(diào)節(jié)方面，通道活性和膜脂組成聯(lián)系緊密。除前述DAG的直接激活外，形成DAG的前體物質(zhì)PIP2已被證實(shí)可直接激活TRPC3、6和7通道亞家族[18]。此外，膜膽固醇亦可激活TRPC3通道并增強(qiáng)其活性[19]，均體現(xiàn)出TRPC3、TRPC6通道的激活在很大程度上受其膜脂環(huán)境調(diào)節(jié)。同時(shí)有研究[19-20]指出其調(diào)節(jié)可通過“通道開放概率的增加”和“TRPC通道的囊泡池募集至質(zhì)膜”這兩種調(diào)節(jié)機(jī)制完成。該調(diào)節(jié)機(jī)制為DAG、PIP2等膜脂成分與TRPC通道相應(yīng)位點(diǎn)結(jié)合后，使TRPC通道的閉合構(gòu)象不穩(wěn)定，導(dǎo)致駐留胞膜上的TRPC通道開放概率增加[19-20]。另有研究[21]提出TRPC通道活性調(diào)節(jié)的另一機(jī)制是某些激活刺激可將TRPC通道囊泡池募集至胞膜，以增強(qiáng)TRPC通道的可用性，上調(diào)TRPC通道活性。

4 TRPC3、TRPC6通道與心血管疾病

4.1 TRPC3、TRPC6通道與肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH) PH是由肺血管收縮和舒張不平衡引起的，肺血管重塑是其主要的病理改變，肺血管平滑肌細(xì)胞(pulmonary vascular smooth muscle cells，PVSMC)的增殖是肺血管重塑的重要病理基礎(chǔ)。近年研究[22]表明TRPC3、TRPC6通道與PH關(guān)系密切，TRPC6通道是缺氧誘導(dǎo)的PH大鼠遠(yuǎn)端PVSMC增殖和遷移所必需的。TRPC6通道通過ROCE等途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞外鈣內(nèi)流，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，在PVSMC的增殖和凋亡中發(fā)揮作用[23-24]。

多種體內(nèi)外因素通過上調(diào)、下調(diào)TRPC3、TRPC6通道或與其相互作用參與PH的調(diào)控，脂多糖由Ca2+依賴性鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶/活化T細(xì)胞核因子信號通路(Cn/NFAT信號通路)介導(dǎo)，上調(diào)TRPC3、TRPC4通道表達(dá)，增強(qiáng)ET-1誘導(dǎo)的肺動脈平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMC)的增殖，刺激肺動脈狹窄[25-26]；PASMC體外實(shí)驗(yàn)[27]表明，血管活性物質(zhì)五羥色胺(5-HT)可能通過上調(diào)Cn A/NFATc3和 TRPC1、TRPC6通道的表達(dá)促進(jìn)PASMC增殖；針對上述過程，另一項(xiàng)研究[28]則表明二十二碳六烯酸對5-HT刺激下TRPC1通道誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣內(nèi)流增加有抑制作用，而非TRPC6通道；二十二碳六烯酸可以抑制5-HT誘導(dǎo)的鈣內(nèi)流增加[27]；骨形態(tài)發(fā)生蛋白4通過激活PASMC骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體Ⅱ/Smad(1/5/8)信號通路上調(diào)TRPC1、TRPC6通道[29]；丹參酮ⅡA磺酸鈉通過蛋白激酶G/過氧化物酶體增殖物激活受體-γ信號通路下調(diào)TRPC通道，抑制缺氧誘導(dǎo)的PASMC中SOCE的增強(qiáng)[30]；PASMC中鈣敏感受體在先天性膈疝并發(fā)的PH中與TRPC6通道相互作用可能導(dǎo)致血管重塑異常、肺血管收縮和PH發(fā)展[31-32]；磷酸酶和張力蛋白同源物在缺氧性肺血管收縮中可與TRPC6通道相互作用，共轉(zhuǎn)移至細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷，誘發(fā)胞外Ca2+內(nèi)流并隨后收縮PASMC[33]。這些對TRPC通道調(diào)控、PVSMC增殖及PH發(fā)展中信號通路的探究，為基于TRPC3、TRPC6通道的PH治療策略提供了新思路。

4.2 TRPC3、TRPC6通道與高血壓 高血壓是以體循環(huán)動脈壓力增高為主要特征的臨床綜合征，TRPC3、TRPC6通道在脈管系統(tǒng)中的重要性已得到明確證實(shí)[34]。值得注意的是，TPRC通道在高血壓中的作用機(jī)制與電壓門控鈣通道存在區(qū)別，主要表現(xiàn)為引起血壓波動，即短期血壓變異性(blood pressure variability，BPV)[7]。

TRPC3通道同高血壓關(guān)系密切。44%的總TRPC3通道定位于線粒體內(nèi)膜[35]，線粒體TRPC3通道的增強(qiáng)可促進(jìn)自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR)脈管系統(tǒng)中的氧化還原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和鈣失調(diào)。機(jī)制在于SHR線粒體TRPC3通道表達(dá)水平上調(diào)誘導(dǎo)線粒體鈣超載形成，繼發(fā)線粒體呼吸功能受損和活性氧(ROS)產(chǎn)生增加，線粒體ROS通過影響血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的功能增強(qiáng)高血壓環(huán)境中的血管張力[36]。另外，TRPC3通道在妊娠期婦女的血壓調(diào)節(jié)中也具有重要意義。ALVAREZ等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，妊娠衍生的子宮動脈內(nèi)皮細(xì)胞通過上調(diào)間隙連接蛋白43來加強(qiáng)和協(xié)調(diào)TRPC3通道開放，引起大量細(xì)胞外基質(zhì)中的鈣內(nèi)流，同時(shí)促進(jìn)NO等血管舒張產(chǎn)物產(chǎn)生來增強(qiáng)血管舒張。此外，KASSAHUN等[38]發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨脂提取物可通過內(nèi)皮依賴性和非依賴性機(jī)制抑制TRPC3通道活性，誘導(dǎo)大鼠動脈血管舒張。

而針對TRPC6通道與高血壓的新近研究，已有一部分調(diào)控物質(zhì)被闡述，LIANG等[39]研究發(fā)現(xiàn)氯沙坦可通過降低BPV和調(diào)節(jié)TRPC6通道表達(dá)預(yù)防竇主動脈去神經(jīng)誘導(dǎo)的動脈壓力不穩(wěn)定大鼠的血管舒縮功能受損；利鈉肽衍生物TDT通過持續(xù)激活鳥苷酸環(huán)化酶-A抑制TRPC6通道，在鹽敏感性高血壓大鼠中表現(xiàn)出心腎保護(hù)作用[40]；骨衍生成纖維細(xì)胞生長因子-23可通過控制腎對應(yīng)受體，隨后調(diào)節(jié)TRPC6通道介導(dǎo)降壓作用[41]；瘦素可誘導(dǎo)SHR胸主動脈和肺動脈內(nèi)皮依賴性血管收縮，與TRPC6通道基因表達(dá)在SHR的動脈中上調(diào)有關(guān)[42]。

盡管近年來的研究已經(jīng)顯現(xiàn)TRPC3、TRPC6通道與高血壓各自關(guān)聯(lián)密切，但這兩個(gè)通道在高血壓中表現(xiàn)的差異性仍值得探究。如前所述，TRPC3、TRPC6通道可為同源四聚體或異四聚體，而它們關(guān)聯(lián)模式的差異可能改變它們對血管張力貢獻(xiàn)的可能性在很大程度上是未被探索的?；诖?，LVAREZ-MIGUEL等[43]通過觀察轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢細(xì)胞同源和異源四聚體的非選擇性陽離子電流和肌電圖研究發(fā)現(xiàn)，高血壓小鼠血管平滑肌細(xì)胞中TRPC3亞基的比例較大，TRPC6亞基表達(dá)下降。該觀察結(jié)果與這些細(xì)胞中具有大量TRPC3通道同源四聚體和含較大比例TRPC3亞基的TRPC3/6通道異四聚體的事實(shí)一致。實(shí)際上，已有研究[44]報(bào)道，在TRPC6通道基因缺失小鼠的TRPC3通道m(xù)RNA表達(dá)上調(diào)，提示TRPC3通道與TRPC6通道在基因表達(dá)方面存在潛在的相互負(fù)向調(diào)控作用[43]。提示二者一方基因的表達(dá)可能對另一方產(chǎn)生潛在的負(fù)向調(diào)控作用。

4.3 TRPC3、TRPC6通道與心力衰竭 心力衰竭是心臟疾病發(fā)展的終末階段，心肌肥厚、心肌纖維化、心率失常均可誘發(fā)心力衰竭，TRPC3、TRPC6通道在心臟中高度表達(dá)，與上述心臟疾病的發(fā)展關(guān)系密切。抑制TRPC3通道可顯著抑制人心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中的纖維化反應(yīng)[45]。值得一提的是，TRPC3通道不僅通過自身介導(dǎo)細(xì)胞外鈣內(nèi)流，而且通過控制CaV1.2(電壓門控鈣通道的一種)表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞外鈣內(nèi)流，是心臟病理性改變的重要介質(zhì)[46]。

TRPC3、TRPC6通道可通過多種機(jī)制作用于心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)心肌肥厚和心肌纖維化，最終導(dǎo)致心臟重塑的發(fā)生。TRPC3、TRPC6通道調(diào)控心肌細(xì)胞最經(jīng)典的機(jī)制是作用于Cn/NFAT信號通路，促進(jìn)TRPC3、TRPC6通道基因轉(zhuǎn)錄，激活心肌肥厚信號；近期ZHANG等[47]研究發(fā)現(xiàn)TRPC3通道通過激活磷酸二酯酶1C，拮抗腺苷A2受體/cAMP信號傳導(dǎo)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡；此外，TRPC3通道可正調(diào)節(jié)由NADPH氧化酶2(Nox2)產(chǎn)生的ROS，驅(qū)動適應(yīng)不良的心臟重塑。TRPC3通道在特定C末端位點(diǎn)與Nox2相互作用，從而保護(hù)Nox2免于蛋白酶體依賴性降解并通過TRPC3通道介導(dǎo)的Ca2+內(nèi)流完成Ca2+依賴性Nox2活化。Nox2還穩(wěn)定TRPC3蛋白以增強(qiáng)TRPC3通道活性[48]。

TRPC3、TRPC6通道驅(qū)動心臟重塑的發(fā)生，而心臟的結(jié)構(gòu)重塑和電重構(gòu)是心率失常發(fā)生的基礎(chǔ)[49]。此外，有證據(jù)顯示TRPC3通道可參與心臟起搏的病理生理過程。QI等[50]發(fā)現(xiàn)TRPC3通道可通過增加小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞的鈉鈣交換體電流正調(diào)節(jié)自發(fā)動作電位的舒張期去極化，因此是小鼠胚胎干細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞起搏的重要決定因素。HOWARTH等[51]則發(fā)現(xiàn) 2型糖尿病大鼠心臟竇房結(jié)中TRPC6通道m(xù)RNA表達(dá)下調(diào)，為進(jìn)一步闡明該型糖尿病大鼠低心率的病理表現(xiàn)提供分子基礎(chǔ)。

5 結(jié)語

TRPC3、TRPC6通道在心血管系統(tǒng)細(xì)胞中廣泛表達(dá)，涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，影響心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等的增殖、分化、凋亡、遷移，在高血壓、PH、心力衰竭等多種心血管疾病中發(fā)揮重要作用。故其在心血管疾病領(lǐng)域具有廣闊的研究前景。然而現(xiàn)有研究多為二者的獨(dú)立研究和解釋，關(guān)聯(lián)研究較少；研究方法方面，多應(yīng)用基因敲除、RNAi和特異性阻斷抗體進(jìn)行結(jié)果觀察，因而在具體機(jī)制的深入探究上存在局限。但隨著光學(xué)藥理學(xué)等高精度空間干預(yù)的應(yīng)用，以及通道藥物相互作用位點(diǎn)和門控過程可用結(jié)構(gòu)信息的增加，TRPC3、TRPC6通道的特異性靶向以及治療價(jià)值是可期的。