重芪結(jié)腸靶向微丸的質(zhì)量控制及對DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型的干預(yù)作用研究*

劉天易，李 莉，馬茂強(qiáng)，楊 飛，郭功玲，王 信，張學(xué)順

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種慢性腸道炎癥性腸病，發(fā)病率逐年升高，被WTO列為不治之癥[1-2]，其病變通常發(fā)生在乙狀結(jié)腸和直腸，也可蔓延至降結(jié)腸，甚至整個結(jié)腸，病變大多局限于大腸黏膜及黏膜下層[3]。UC發(fā)病機(jī)制尚未明確，治療策略大多采用西藥治療，西藥主要由水楊酸類、糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑、生物制劑等組成，但UC存在病程長且易復(fù)發(fā)的特點，長期應(yīng)用西藥治療毒副作用較大[4]。

重芪結(jié)腸靶向微丸（PA-CTPC）是本研究團(tuán)隊前期針對UC患者血性腹瀉、腹痛、便血、體質(zhì)量減輕等癥狀，以重樓總皂苷、黃芪總多糖為主要成分研制而成的中藥新制劑[5]。本研究擬建立PA-CTPC中黃芪總多糖、重樓皂苷類成分的含量測定方法，并從炎癥因子和黏膜屏障角度評價其對4%葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)UC模型小鼠的干預(yù)作用，為PA-CTPC深入開發(fā)提供實驗依據(jù)，為臨床應(yīng)用含重樓-黃芪藥對治療UC提供參考。

1 儀器與材料

1.1 試藥D-無水葡萄糖對照品（批號：110833-201205，中國食品藥品檢定研究院）；重樓皂苷Ⅰ對照品、重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺?11590-200402，111591-200402，中國食品藥品檢定研究院）；重樓皂苷Ⅶ對照品、重樓皂苷H對照品（純度＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；PA-CTPC（自制，批號：20190410，20190515，20190618）；DSS（分子量：36 000～50 000，MP biomedical公司）；便潛血檢測試紙（北京金華科生物技術(shù)有限公司）；D-LA、DAO ELISA檢測試劑盒（上海一研生物科技有限公司）；IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4 ELISA試劑盒（武漢市博士德有限公司）；乙腈為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器UV2800型紫外分光光度計（日本日立公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；Aglient 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent有限公司）；KQ-250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；EP214C型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；AB135-S型十萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）；EG1150石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司)；RM2235石蠟切片機(jī)（德國Leica公司)；BX50顯微鏡（日本Olympus公司）；H1650臺式高速離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；DHG-9070A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鞏義科瑞儀器有限公司）；DW-86W100型超低溫保存箱（北京慧龍環(huán)科環(huán)境儀器有限公司）。

1.3 實驗動物6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠50只，體質(zhì)量（20.0±1.0）g，購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，生產(chǎn)許可證編號：SCXK（魯）20140007。飼養(yǎng)環(huán)境：山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院動物實驗中心，屏障環(huán)境飼養(yǎng)，使用許可證編號：SYXK（魯）20180015。本實驗經(jīng)過山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：AWE-2019-093），符合實驗動物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪總多糖的含量測定[6]

2.1.1 供試品溶液制備 取PA-CTPC適量，研細(xì)，取約2.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇溶液50 mL，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）30 min，濾過，殘渣揮干乙醇，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入水50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）40 min，再稱定質(zhì)量，以水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 取D-無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水配制成約0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 線性關(guān)系考察 精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液（0.098 6 mg/mL），加水補(bǔ)至2.0 mL，加1.0 mL 5%的苯酚，再加濃硫酸10.0 mL，漩渦震蕩搖勻，沸水浴加熱10 min，水浴冷卻后，485 nm檢測吸光度（A），以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)（X），A為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.011 5X-0.000 6，r=0.995 6，表明葡萄糖在9.86～59.16 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.4 測定法 精密量取供試品溶液0.5 mL，其余按照“2.1.3”項下“加水補(bǔ)至2.0 mL，……，485 nm檢測吸光度”操作。將樣品的吸光度數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算黃芪總多糖含量。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液1.0 mL，按“2.1.4”項下方法測定吸光度，重復(fù)測定6次，測得吸光度的RSD為0.35%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.1.1”項下供試品溶液0.5 mL，于0、2、4、8、12、24 h，按“2.1.4”項下方法測定吸光度，測得吸光度的RSD為3.45%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）適量，按“2.1.1”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定吸光度并計算含量，結(jié)果黃芪總多糖的平均含量為150.75 mg/g，RSD為2.47%，表明測定方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）95%乙醇超聲處理后的殘渣6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入葡萄糖對照品約40 mg，其余操作按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下方法測定吸光度，并計算回收率。（見表1）

表1 黃芪總多糖測定加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.1.9 樣品含量測定 按照建立的方法測定3批PA-CTPC樣品中黃芪總多糖的含量，結(jié)果見表2。

表2 3批PA-CTPC樣品黃芪總多糖的含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）

2.2 重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量測定[7-8]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（250 mm×4.60 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～40 min，30%～60%A，40～50 min，60%～30%A）；檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 供試品溶液制備 取PA-CTPC適量，研細(xì)，取約0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 混合對照品溶液的制備 取重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含重樓皂苷Ⅰ0.412 mg、重樓皂苷Ⅱ0.213mg、重樓皂苷Ⅶ0.271mg、重樓皂苷H 0.161 mg的混合溶液，即得。

2.2.4 陰性供試品溶液的制備 按處方比例，制備缺少重樓的陰性樣品，并按“2.2.2”項下的方法制成陰性供試品溶液。

2.2.5 專屬性試驗 分別取供試品溶液、混合對照品溶液及陰性供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，結(jié)果供試品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H 4種皂苷類化學(xué)成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且保留時間與相應(yīng)對照品一致；陰性供試品溶液在相同保留時間處無色譜峰，表明無其他成分干擾，方法專屬性良好。（見圖1）

圖1 PA-CTPC中重樓皂苷類成分測定HPLC圖

2.2.6 線性關(guān)系考察 取重樓皂苷Ⅰ對照品溶液（1.573 0mg/mL），重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海?.750 4 mg/mL），重樓皂苷Ⅶ對照品溶液（0.814 0 mg/mL），重樓皂苷H對照品溶液（0.531 2 mg/mL），各精密量取0.5、1、2、4、8、10 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋配制成系列濃度，按照“2.1.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），對應(yīng)峰面積（M）為縱坐標(biāo)（Y），分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。（見表3）

表3 PA-CTPC中4種重樓皂苷類成分的回歸方程及線性范圍、相關(guān)系數(shù)

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.3”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，重復(fù)測定6次，測得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H峰面積的RSD分別為0.32%、0.48%、0.52%、1.02%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.2”項下供試品溶液分別于配制后的0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，測得重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H峰面積的RSD分別為1.25%、0.89%、1.44%、0.69%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）適量，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，并計算含量。結(jié)果重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的平均含量分別為30.12、6.02、5.28、8.85 mg/g，RSD分別為2.58%、3.14%、1.67%、1.33%，表明測定方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取PA-CTPC（批號：20190515）適量，研細(xì)，取6份，每份約0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入重樓皂苷Ⅰ對照品溶液（1.573 0 mg/mL）5 mL，重樓皂苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海?.750 4 mg/mL）2 mL，重樓皂苷Ⅶ對照品溶液（0.814 0mg/mL）2mL，重樓皂苷H對照品溶液（0.531 2 mg/mL）5 mL，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定峰面積，并計算回收率。（見表4）

表4 重樓皂苷類成分測定加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

續(xù)表4：

2.2.11 樣品含量測定 按照建立的方法測定3批PA-CTPC樣品中重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量，結(jié)果見表5。

表5 3批PA-CTPC樣品重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量測定結(jié)果（n=3，mg/g）

2.3 對DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型的干預(yù)作用

2.3.1 動物造模、分組與給藥6周齡雄性C57BL/6小鼠50只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分空白組、模型組及PA-CTPC低、中、高劑量組?？瞻捉M小鼠自由飲食、飲水，第2周開始灌胃生理鹽水（3 mL/d），至第2周末實驗結(jié)束；模型組第1周開始以含有4% DSS的飲用水喂養(yǎng)小鼠，第2周開始灌胃生理鹽水（3 mL/d），至第2周末實驗結(jié)束；PA-CTPC低、中、高劑量組第1周開始以含有4% DSS的飲用水喂養(yǎng)小鼠，第2周開始每天分別灌胃給予0.1、0.2、0.4 mg/g的PA-CTPC，至第2周末實驗結(jié)束。

2.3.2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊的采用SNK檢驗，方差不齊的采用Dunnet t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3.3 小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）評分 每天觀察并記錄各組小鼠體質(zhì)量變化情況、糞便性狀、便血情況，并進(jìn)行DAI評分[9]。結(jié)果表明，空白組小鼠飲食正常，糞便性狀正常，毛色光亮，精神良好；模型組和PA-CTPC低、中、高劑量組小鼠在飲4% DSS后逐漸出現(xiàn)毛色無光、便稀的情況，部分小鼠肛門處出現(xiàn)紅腫跡象，進(jìn)而加重為腹瀉、便血等癥狀。模型組和PA-CTPC低、中、高劑量組小鼠的食物消耗量均不同程度的減少，且存在好懶惡動的現(xiàn)象。與空白組比較，模型組小鼠DAI評分明顯升高（P＜0.01）。給藥7 d后，PA-CTPC低、中、高劑量組小鼠便血、體質(zhì)量下降等情況均不同程度減輕，PA-CTPC中、高劑量組小鼠DAI評分明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見表6）

表6 各組小鼠DAI、結(jié)腸組織大體形態(tài)、病理學(xué)評分比較（±s，分）

表6 各組小鼠DAI、結(jié)腸組織大體形態(tài)、病理學(xué)評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/g）DAI評分 形態(tài)評分 組織病理學(xué)評分空白組 10 - 0 0 0.14±0.04模型組 10 - 2.89±0.31a 3.41±0.53a 2.43±0.25a PA-CTPC低劑量組 10 0.1 1.85±0.27 3.24±0.62 2.13±0.66 PA-CTPC中劑量組 10 0.2 1.31±0.17b 1.99±0.47c 1.74±0.64b PA-CTPC高劑量組 10 0.4 1.10±0.18c 1.26±0.59c 0.86±0.25c

2.3.4 結(jié)腸組織大體形態(tài)及病理學(xué)評分 將小鼠脫頸椎處死后，自盲腸部位開始至肛門口處取出整個腸段，沿腸系膜緣縱向剪開，用冰生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，進(jìn)行結(jié)腸組織大體形態(tài)評分[10]，結(jié)腸組織采用多聚甲醛固定48 h后，組織常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸組織病變情況，并按照OBERMEIER F等[11]介紹的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評分。結(jié)果顯示，空白組小鼠結(jié)腸外形完整，結(jié)腸黏膜腺體排列整齊，上皮細(xì)胞基本完整。與空白組比較，模型組小鼠存在結(jié)腸浮腫、充血和粒狀糜爛的情況（P＜0.01）；與模型組比較，PA-CTPC各劑量組小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)均有一定程度的好轉(zhuǎn)，PA-CTPC低劑量組小鼠結(jié)腸形態(tài)、組織病理評分與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），PA-CTPC中、高劑量組結(jié)腸組織形態(tài)、病理評分明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。（見表6、圖2）

圖2 各組小鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)比較（HE，×100）

2.3.5 血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4、D-LA、DAO水平檢測 第15天時，腹腔注射水合氯醛將小鼠麻醉，摘眼球取血，8 000 r/min離心10 min，分離血清并置-80℃冰箱中保存，按ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4、D-LA、DAO含量。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α、D-LA、DAO水平明顯高于空白組（P＜0.01），IL-10、IL-4水平明顯低于空白組（P＜0.01）；與模型組比較，PA-CTPC中、高劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α、D-LA、DAO水平明顯降低（P＜0.01），IL-10、IL-4水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），PA-CTPC低劑量IL-6、IL-10、IL-4、D-LA、DAO水平與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3）

圖3 各組小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4、D-LA、DAO水平比較（±s，n=10）

3 討 論

黃芪總多糖是重芪結(jié)腸靶向微丸的主要藥效成分之一，目前其常用的含量測定方法主要為紫外分光光度法，主要有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3，5-二硝基水楊酸法等，本研究在對以上3種方法進(jìn)行考察基礎(chǔ)上，選用苯酚-硫酸法測定制劑中黃芪總多糖的含量，并對反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度、測定波長等進(jìn)行了考察，建立的黃芪總多糖含量測定方法穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可行。測定總多糖的含量只是多糖類成分質(zhì)量控制的一個方面，相關(guān)學(xué)者還采用HPLC法檢測多糖衍生化后單糖組成及其含量、采用高效凝膠滲透色譜法測定多糖相對分子質(zhì)量及其分布、采用薄層色譜法檢查游離單糖、采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和核磁共振波譜對糖苷鍵連接位置及構(gòu)型進(jìn)行判斷等進(jìn)行多糖成分的質(zhì)量控制[12]，隨著分析技術(shù)的不斷成熟，后續(xù)將會進(jìn)一步完善本制劑中黃芪總多糖的質(zhì)量控制方法。

重樓主要活性成分為甾體皂苷類成分，2015年版《中華人民共和國藥典》以重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和Ⅶ作為質(zhì)控指標(biāo)，然而相關(guān)研究表明重樓皂苷Ⅵ在正品云南重樓或七葉一枝花中含量較低或不含，而在近緣種植物球藥隔重樓及延齡草或吉林延齡草中含量較高，并建議去除重樓皂苷Ⅵ，增加重樓皂苷H作為含量測定指標(biāo)[13]，因此，本研究選擇重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ和H作為本制劑中重樓皂苷類成分的測定指標(biāo)。

本研究采用4.0%DSS水溶液給予小鼠自由飲用7 d，成功復(fù)制了UC模型。模型組小鼠DAI評分、結(jié)腸組織大體形態(tài)及病理學(xué)評分與空白組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。在造模成功后給予PA-CTPC藥物干預(yù)，PA-CTPC中、高劑量組小鼠DAI評分、結(jié)腸組織大體形態(tài)及病理評分明顯降低，表明PA-CTPC對DSS誘導(dǎo)小鼠形成的UC癥狀具有明顯的治療作用。

細(xì)胞因子在UC的發(fā)病機(jī)制中扮演重要的角色，其中促炎因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等）和抗炎因子（IL-4、IL-10等）兩者間的調(diào)節(jié)失衡與UC的發(fā)病密切相關(guān)[14]。本研究采用ELISA法測定小鼠血清IL-6、TNF-α、IL-10、IL-4水平，結(jié)果PA-CTPC中、高劑量組能明顯降低模型組小鼠血清IL-6、TNF-α，明顯升高IL-10、IL-4水平，表明PA-CTPC能調(diào)整小鼠UC模型促炎、抗炎因子水平，發(fā)揮抗炎作用。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)IL-6/JAK2/STAT3信號通路可調(diào)控免疫與炎癥反應(yīng)，在UC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮了重要作用[15-16]，基于本研究結(jié)果，后續(xù)將對PA-CTPC干預(yù)IL-6/JAK2/STAT3信號通路進(jìn)行研究，分析探尋其治療UC的可能的靶點及作用機(jī)制。

UC發(fā)病過程中多種效應(yīng)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)會促進(jìn)腸黏膜損傷[17-18]。二胺氧化酶（DAO）可在腸道黏膜上皮細(xì)胞損傷時被釋放入血，血清DAO水平可間接反映腸道黏膜上皮細(xì)胞損傷的程度[19]。腸道D乳酸（D-LA）可通過受損黏膜入血，血清中D-LA水平高低可間接反映腸道黏膜通透性的變化[20]。本研究結(jié)果表明中、高劑量PA-CTPC能顯著降低模型小鼠血清DAO、D-LA水平，說明PA-CTPC在一定程度上可改善腸道黏膜屏障功能。

綜上所述，本研究以黃芪總多糖及重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ、H的含量測量，建立了PA-CTPC的質(zhì)量控制方法，并初步證明PA-CTPC可通過降低血清中促炎因子的表達(dá)，升高抗炎因子水平，改善腸道黏膜屏障功能，發(fā)揮其對UC小鼠的治療作用。本研究為PA-CTPC深入開發(fā)提供了實驗依據(jù)，為臨床含重樓-黃芪藥對應(yīng)用治療UC提供了參考。