多元回歸分析大黃不同炮制品中蒽醌與抑菌活性相關(guān)性

韓慧芬

（如皋市精神病防治醫(yī)院，江蘇 如皋 226500）

大黃為臨床常用瀉下中藥，為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatum L.、唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.，或藥用大黃Rheum officinale Baill.的干燥根和根莖。大黃性寒味苦，歸脾、胃、大腸、肝、心包經(jīng)[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明大黃具有良好的體內(nèi)外抑菌活性[2-3]。大黃的化學(xué)成分研究表明其主要含有蒽醌類化合物，包括蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等[4]。大黃所含有的蒽醌成分與大黃整體抑菌效果相關(guān)性如何未見(jiàn)報(bào)道[5]。中藥譜效關(guān)系研究是通過(guò)數(shù)學(xué)模型建立內(nèi)在化學(xué)成分與藥效關(guān)聯(lián)的一種新的研究方法[6]。通過(guò)中藥譜效關(guān)系研究，可以認(rèn)識(shí)到主要活性成分在中藥整體中所起的作用及貢獻(xiàn)度的大小。連翹中咖啡酸、連翹酯苷A、連翹苷和連翹脂素與連翹抗金黃色葡萄球菌活性之間存在密切的關(guān)聯(lián)性[7]。對(duì)線葉菊進(jìn)行抗菌活性譜效關(guān)系研究，發(fā)現(xiàn)了9個(gè)共有抑菌成分，為闡述線葉菊的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)[8]。筆者對(duì)大黃的不同炮制品醇提取物中蒽醌建立指紋圖譜，并對(duì)樣品的抑菌效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)多元回歸等數(shù)學(xué)模型建立大黃不同炮制品中蒽醌與抑菌效果之間的聯(lián)系，為闡述大黃抑菌效果的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器Agilent 1260高效液相色譜儀（配有四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器及Chem Station色譜工作站）；CPA225D型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；MICRO-17R冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Milli-Q Advavtage A10超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）；WH-2微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

1.2 試藥大黃飲片購(gòu)自南通三越中藥飲片有限公司（批號(hào)：180217、180725、181109），經(jīng)如皋人民醫(yī)院邵建兵副主任中藥師鑒定，大黃飲片均為掌葉大黃Rheum palmatum L.的根及根莖。蘆薈大黃素（批號(hào)：110795-201710）、大黃酸（批號(hào)：110757-201607）、大黃素（批號(hào)：110756-201913）、大黃酚（批號(hào)：110796-201922）、大黃素甲醚（批號(hào)：110758-201817）、金黃色葡萄球菌（批號(hào)：26003-9a）、大腸埃希氏菌（批號(hào)：44103-9a1）、綠膿假單胞菌（批號(hào)：10104-2a26）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。胰酪胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。色譜純甲醇、色譜純乙腈、分析純磷酸等試劑購(gòu)自南京化學(xué)試劑股份有限公司。

2 方 法

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫：40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：A-乙腈，B-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0~8 min，20%~25%A；8~16 min，25%A；16~31 min，25%~45%A；3 1~41 min，45%~60%A；41~53 min，60%~71%A；53~54 min，71%~20%A。

2.2 溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液制備 分別取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各80 μg，大黃素甲醚40 μg的溶液；分別精密量取上述對(duì)照品溶液各2 mL，混勻，即得（每1 mL中含蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚各16 μg，含大黃素甲醚8 μg）。

2.2.2 大黃不同炮制品的制備大黃，去除雜質(zhì)，洗凈潤(rùn)透，切厚片，晾干得到生大黃飲片。熟大黃與大黃炭的制備方式參照中藥炮制規(guī)范[9]。簡(jiǎn)言之，凈大黃飲片加入50%黃酒拌勻，悶潤(rùn)2 h，待黃酒被藥材吸盡后，密封蒸制24 h內(nèi)部呈黃褐色，晾得熟大黃；凈大黃片用（200±20）℃武火炒至表焦黑內(nèi)焦褐色，取出，得大黃炭炮制品。每個(gè)批次重復(fù)3次，各得到生大黃、熟大黃和大黃炭樣品共27份。

2.2.3 樣品液制備取干燥的各大黃炮制品，粉碎飲片成粉，過(guò)80目篩。分別稱取大黃各炮制品粉末100 g，用8倍純化水回流提取2次，每次30 min，濾過(guò)，濃縮定容到200 mL，得到大黃不同炮制品的樣品液。取制備好的樣品液1 mL，定容至25 mL，0.45 μm濾膜過(guò)濾，供液相色譜分析。

2.3 方法學(xué)的考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算RSD。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，于制備后的0、3、6、9、12和24 h分別進(jìn)樣，測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算RSD。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取大黃炮制品粉末各約100 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，測(cè)定蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積，計(jì)算RSD。

2.4 大黃不同炮制品抑菌實(shí)驗(yàn)參照《中華人民共和國(guó)藥典》通則操作，將制備好的培養(yǎng)基以無(wú)菌操作加入90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿中，制成培養(yǎng)基平板，每個(gè)平板分別加入濃度為1×105CFU/mL的金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、綠膿假單胞菌的懸液0.1 mL，無(wú)菌玻璃棒均勻涂布[10]。以打孔器在涂菌的平板上打3孔（每孔直徑6 mm）。每孔加入無(wú)菌水配置的濃度為0.5 g/mL大黃不同炮制品溶液100 μL，以無(wú)菌水制作空白對(duì)照。37℃培養(yǎng)24 h，記錄抑菌圈直徑。

3 結(jié)果與討論

3.1 大黃不同炮制品色譜圖分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。大黃不同炮制品色譜特征圖見(jiàn)圖1。在此分析方法下，各蒽醌成分分離度良好。

圖1 高效液相色譜圖

3.2 方法學(xué)結(jié)果精密度結(jié)果表明，此分析方法下蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.16%、0.41%、1.57%、0.89%和1.24%，表明儀器精密度良好。穩(wěn)定性結(jié)果表明，不同時(shí)間點(diǎn)蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.21%、1.18%、1.09%、0.84%和1.07%，表明大黃炮制品樣品在24 h具有良好的穩(wěn)定性。重復(fù)性結(jié)果顯示，重復(fù)制備的生大黃炮制品樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量分別為0.271、38.846、2.021、3.347、1.487 mg/g，RSD分 別 為3.21%、2.18%、3.09%、3.84%和3.07%，表明方法具有良好的重復(fù)性。

3.3 大黃炮制品中蒽醌含量測(cè)定分別取制備好的不同大黃炮制品溶液10 μL，注入液相色譜儀進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同大黃炮制品中蒽醌含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）

3.4 大黃不同炮制品抑菌實(shí)驗(yàn)采用十字交叉法測(cè)定大黃不同炮制品抑菌圈直徑（d），按下公式計(jì)算抑菌圈面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 大黃不同炮制品抑菌圈面積（mm2，n=3）

續(xù)表2：

3.5 大黃蒽醌抑菌多元回歸分析將實(shí)驗(yàn)得到的大黃中蒽醌含量數(shù)據(jù)與大黃抑菌數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS進(jìn)行多元線性回歸分析處理，以蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量作為自變量X1-5，以各種細(xì)菌抑菌圈面積作為因變量Y，以多元線型回歸-逐步回歸法建立大黃蒽醌抑菌方程。所得方程見(jiàn)表3。

表3 大黃抑菌作用的譜效方程

3.6 主成分分析（PCA）將大黃蒽醌含量及抑菌面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS進(jìn)行主成分分析，尋找出對(duì)大黃抑菌有較大相關(guān)性的指標(biāo)。由SPSS導(dǎo)出主成分因子相關(guān)矩陣，如表4所示。結(jié)果表明大黃酸和蘆薈大黃素是大黃抑菌主要活性成分群。分析總方差判斷主要影響因子，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明大黃酸和蘆薈大黃素在抑菌方面起主要作用。（見(jiàn)圖2）

表4 大黃成分的PCA分析因子載荷矩陣

表5 大黃蒽醌抑菌總方差解析表

圖2 大黃化學(xué)成分抗菌效能PCA分析圖

4 討 論

4.1 中藥物質(zhì)基礎(chǔ)研究是探索中藥起效機(jī)制的重要組成部分中藥譜效關(guān)系建立的難點(diǎn)在于選擇合適的評(píng)價(jià)體系，和適宜的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法。大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒等廣泛的臨床應(yīng)用，不可能建立某一種模型來(lái)評(píng)價(jià)大黃的整體功效。因此，本文選擇大黃體外抑菌模型對(duì)大黃蒽醌類成分進(jìn)行分析。之前已經(jīng)有多個(gè)研究表明大黃具有良好的體外抑菌效果，不同炮制品之間抑菌能力具有明顯差別，但未建立起大黃化學(xué)成分與抑菌能力之間的相關(guān)性。筆者通過(guò)液相色譜含量測(cè)定不同炮制品中蒽醌含量，并與抑菌能力進(jìn)行多因素回歸分析，建立大黃蒽醌成分與抑菌能力之間的譜效方程，并通過(guò)主成分分析，蘆薈大黃素、大黃酸在大黃抑菌中起到主要的作用。

4.2 大黃在炮制后蒽醌類成分發(fā)生了明顯的變化熟大黃中蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量較生品中有不同程度的上升，大黃酸含量與生大黃中相當(dāng)。大黃炭中蘆薈大黃素、大黃酸含量降低明顯，而大黃酚和大黃素甲醚含量上升[11]。抑菌實(shí)驗(yàn)中對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、銅綠假單胞桿菌作用結(jié)果表明，大黃經(jīng)過(guò)炮制變成熟大黃其抑菌能力沒(méi)有明顯變化，而經(jīng)過(guò)炮制成炭后，抑菌能力明顯下降，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]。經(jīng)過(guò)回歸和主成分分析，表明蘆薈大黃素和大黃酸起到主要的抑菌作用。

中藥由于多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，決定了其物質(zhì)基礎(chǔ)作用機(jī)制研究將會(huì)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系。本文以其中的一個(gè)點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)中藥抑菌的物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行初步探索，為了解中藥復(fù)雜體系提供了科學(xué)依據(jù)。