枳實薤白桂枝湯對心肌缺血模型兔血管內(nèi)皮源性舒張因子的影響*

趙 楠，賈洪濤，劉一暢，翟春梅，戴 縉

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗實訓(xùn)中心，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001）

冠心病作為致死率較高的一種疾病嚴(yán)重地危害著人類的健康，冠狀動脈痙攣作為冠心病的類型之一，主要是由于多種原因所引起的冠狀動脈一過性收縮，導(dǎo)致血管狹窄或閉塞，引起心肌缺血后所產(chǎn)生一系列臨床相應(yīng)的癥狀[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)是導(dǎo)致冠狀動脈痙攣的主要因素之一。血管內(nèi)皮源性舒張因子NO與內(nèi)皮源性內(nèi)皮素前體（BigET-1）在血管中相互調(diào)節(jié)維持其內(nèi)環(huán)境平衡狀態(tài)[2]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，枳實薤白桂枝湯作為經(jīng)方在臨床應(yīng)用中對心血管疾病具有較好的療效[3-5]。前期研究證實枳實薤白桂枝湯在心肌缺血時對心臟具有一定的保護作用[6]。本實驗在前期實驗的基礎(chǔ)上，進一步探討枳實薤白桂枝湯在冠狀動脈痙攣情況下對血管舒張因子的調(diào)控作用及相關(guān)水平的影響，為探究枳實薤白桂枝湯對心肌缺血的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取SPF級成年健康家兔50只，雌雄各半，體質(zhì)量2 500～3 000 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2018-003，使用許可證號：SYXK（黑）2018-007。家兔實驗前7 d正常飼養(yǎng)喂食，待適應(yīng)環(huán)境后，本實驗通過BL-420F生物信號機能采集系統(tǒng)記錄肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，剔除不合格者。本實驗通過本校醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，無浪費動物及虐殺動物情況。

1.2 藥物與試劑枳實薤白桂枝湯提取液由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院針灸生理實驗室自制；氨基甲酸乙酯（上海山浦化工有限公司，批號：20180110）；肝素鈉注射液（江蘇萬邦生物醫(yī)藥股份有限公司，批號：1802102）；一氧化氮（NO，天津凱通化學(xué)試劑有限公司，批號：20170401）；BigET-1ELISA檢測試劑盒（天津凱通化學(xué)試劑有限公司，批號：20170331）。

1.3 主要儀器BL-420F生物信號機能采集系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）；LDZ4-1.2臺式離心機（北京醫(yī)用離心機廠）；超低溫冷凍儲存冰箱（中科美菱低溫科技有限公司）；恒溫水浴鍋（上海躍進醫(yī)療器械廠）；SP-Max2300A2型光吸收型全波長酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）。

1.4 造模與分組將家兔飼養(yǎng)1周后，通過BL-420F生物信號機能采集系統(tǒng)篩選心電圖（ECG）指標(biāo)合格家兔進行隨機分組，50只家兔隨機分為模型組、枳實薤白桂枝湯低劑量組、枳實薤白桂枝湯中劑量組、枳實薤白桂枝湯高劑量組、地爾硫卓組，每組10只。通過外源性注射人內(nèi)皮素-1（ET-1）誘導(dǎo)的方法建立家兔冠狀動脈痙攣的模型。首先將預(yù)處理過的家兔稱重后固定，按照體質(zhì)量注射20%氨基甲酸乙酯5 mL/kg。家兔麻醉后進行備皮、消毒后，迅速剪開皮膚充分暴露右側(cè)頸動脈，進行插管結(jié)扎后備用，以便實驗采血。將調(diào)配好的生物采集系統(tǒng)電極分別連于家兔四肢，記錄家兔Ⅱ?qū)?lián)心電圖的變化，約0.5 h穩(wěn)定后經(jīng)耳緣靜脈注入ET-1（1.4 nmol/kg），建立冠狀動脈痙攣所導(dǎo)致的心肌缺血模型。模型成功標(biāo)準(zhǔn)：調(diào)試BL-420F生物信號機能采集系統(tǒng)，進行參數(shù)設(shè)定，可見造模后家兔心電圖ST段顯著抬高，T波高尖。

1.5 實驗給藥枳實薤白桂枝湯提取液的制備根據(jù)《金匱要略》記載，用量換算枳實12 g，厚樸12 g，桂枝6 g，薤白9 g，瓜蔞12 g[7]。藥材進行浸泡，煎煮，濾渣，水提醇沉法后過濾，恒溫水浴濃縮后離心取上清液，根據(jù)文獻[8]參考古代1升相當(dāng)于現(xiàn)代200 mL，所以根據(jù)換算人體服藥100 mL/次，含生藥17 g。參照實驗動物藥量計算方法[9]，家兔與人體配比的等效劑量為0.79 g/kg，可確定枳實薤白桂枝湯低、中、高劑量組家兔給藥劑量分別為0.395、0.790、1.580 g/kg。

5組家兔在造模前期給予灌胃處理，枳實薤白桂枝湯低、中、高劑量組分別給予0.395、0.790、1.580 g/kg的枳實薤白桂枝湯；地爾硫卓組家兔給予5 mg/kg的地爾硫卓懸濁液進行適應(yīng)性預(yù)處理；模型組家兔給予等劑量生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥5 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 T波及ST段的測量 將預(yù)處理造模后家兔四肢分別與BL-420F生物采集系統(tǒng)電極片相連接，調(diào)試生物采集系統(tǒng)，待系統(tǒng)曲線穩(wěn)定后記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖的變化，分別記錄注射藥物后5、10、15、30 min的T波與S-T段的變化。T波以QRS為基線標(biāo)準(zhǔn)，測量其最高點與基線之間的垂直距離的變化。S-T段則為相鄰的兩個QRS波群起點的連線作為基線，以確定有無ST段移位。（見圖1）

圖1 各組在15 min時心電圖

1.6.2 血管內(nèi)皮源性舒張因子NO及BigET-1 5組家兔在造模前5 min及造模后30、120、360 min分別采血5 mL，靜置后，低溫離心后取上清液于Eppen-dorf管內(nèi)，放于超低溫儲存冰箱中備用。采用ELISA法分別檢測NO及BigET-1的水平，嚴(yán)格按照試劑盒的步驟進行操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組家兔T波的變化模型組家兔T波在5、10、15、30 min高尖；與模型組比較，枳實薤白桂枝湯低、中、高劑量組和地爾硫卓組家兔在各時間點心電圖T波下降（P＜0.05）；與地爾硫卓組比較，枳實薤白桂枝湯低、高劑量組家兔心電圖T波抬高（P＜0.05）；枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓組各時間點比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；其中枳實薤白桂枝湯中、高劑量組和地爾硫卓組家兔在5、10、15、30 min時間點T波逐漸下降；結(jié)果表明枳實薤白桂枝湯能使家兔心電圖T波下降，改善心肌缺血，其中枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓組藥效最為接近。（見表1、圖2）

表1 各組家兔T波變化的比較（±s，mV）

表1 各組家兔T波變化的比較（±s，mV）

注：F時間主效應(yīng)=7.040，P時間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=34.546，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=8.372，P交互效應(yīng)=0.000；與模型組比較，aP＜0.05；與地爾硫卓組比較，bP＜0.05；與5 min比較，cP＜0.05；與10 min，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg） 5 min 10 min 15 min 30 min F P模型組 10 - 0.346±0.018 0.358±0.015 0.359±0.022 0.365±0.030 1.620 0.269枳實薤白桂枝湯低劑量組 10 0.395 0.300±0.018a b 0.318±0.016a b 0.320±0.013a b 0.314±0.014a b 3.685 0.024枳實薤白桂枝湯中劑量組 10 0.790 0.304±0.034a b 0.291±0.029a 0.274±0.036a c d 0.272±0.031a c d 16.671 0.000枳實薤白桂枝湯高劑量組 10 1.580 0.315±0.021a b 0.302±0.025a b 0.294±0.025a b c d 0.291±0.025a b c d 11.820 0.004地爾硫卓組 10 0.005 0.265±0.018a 0.257±0.017a c 0.252±0.015a c 0.240±0.019a c d 13.049 0.003 F 16.655 30.894 31.123 36.298 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 各組家兔用藥后T波各時間點變化趨勢圖

2.2 各組家兔S-T段的變化模型組S-T段在5、10、15、30 min明顯抬高，與模型組比較，枳實薤白桂枝湯低、中、高劑量組與地爾硫卓組各時間點均有改善（P＜0.05）；與地爾硫卓組比較，枳實薤白桂枝湯低劑量組各時間點與枳實薤白桂枝湯高劑量組5、15、30 min時間點S-T段有所抬高（P＜0.05）；枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。其中枳實薤白桂枝湯低劑量組30 min時S-T段顯著降低，枳實薤白桂枝湯中劑量組和地爾硫卓組各時間點與5 min比較，S-T段均有下降，但10 min時較為明顯，枳實薤白桂枝湯高劑量組各時間點與5 min比較，10 min時S-T段顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果表明枳實薤白桂枝湯可以使ST段下降，有效改善心肌缺血，其中枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓組藥效最為接近。（見表2、圖3）

表2 各組家兔S-T段變化的比較（±s，mV）

表2 各組家兔S-T段變化的比較（±s，mV）

注：F時間主效應(yīng)=3.199，P時間主效應(yīng)=0.033；F分組主效應(yīng)=26.631，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=7.007，P交互效應(yīng)=0.000；與模型組比較，aP＜0.05；與地爾硫卓組比較，bP＜0.05；與5 min比較，cP＜0.05；與10 min，dP＜0.05；與15 min比較，eP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg） 5 min 10 min 15 min 30 min F P模型組 10 - 0.083±0.002 0.085±0.002c 0.087±0.002c d 0.089±0.003c d e 39.111 0.000枳實薤白桂枝湯低劑量組 10 0.395 0.079±0.002a b 0.080±0.002a b 0.083±0.001a b c d 0.081±0.002a b e 9.666 0.000枳實薤白桂枝湯中劑量組 10 0.790 0.075±0.002a 0.073±0.002a c 0.073±0.002a c 0.072±0.001a c d e 15.061 0.000枳實薤白桂枝湯高劑量組 10 1.580 0.081±0.003a b 0.074±0.023a c 0.081±0.004a b 0.081±0.004a b 0.389 0.765地爾硫卓組 10 0.005 0.074±0.002a 0.072±0.002a c 0.072±0.002a 0.071±0.002a c 10.041 0.006 F 37.270 2.698 66.989 78.378 P 0.000 0.042 0.000 0.000

圖3 各組家兔用藥后ST段各時間點變化趨勢圖

2.3 各組家兔血管內(nèi)皮源性舒張因子NO水平變化與模型組比較，枳實薤白桂枝湯中、高劑量組和地爾硫卓組注射ET-1后各時間點血清NO水平升高（P＜0.05）；枳實薤白桂枝湯低劑量組注射ET-1后6 h時血清NO水平低于地爾硫卓組（P＜0.05）；枳實薤白桂枝湯中劑量組血清NO水平與地爾硫卓組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與地爾硫卓組比較，枳實薤白桂枝湯高劑量組家兔注射前后各時間點血清NO水平均升高（P＜0.05）。各組家兔注射ET-1后的0.5 h其水平以拋物線形式逐漸升高后回落，6 h時降低到原始水平。結(jié)果表明枳實薤白桂枝湯可有效地升高家兔血清NO水平，其中枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓組藥效最為接近。（見表3、圖4）

表3 各組家兔血管內(nèi)皮源性舒張因子NO水平變化的比較（±s）

表3 各組家兔血管內(nèi)皮源性舒張因子NO水平變化的比較（±s）

注：F時間主效應(yīng)=1 107.772，P時間主效應(yīng)=0.000，F(xiàn)分組主效應(yīng)=14.829，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=13.004，P交互效應(yīng)=0.000；與模型組比較，aP＜0.05；與地爾硫卓組比較，bP＜0.05；與注射前比較，cP＜0.05；與注射后0.5 h比較，dP＜0.05；與注射后2 h比較，eP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg） 注射前 注射后0.5 h 注射后2 h 注射后6 h F P模型組 10 - 25.19±6.49 52.01±10.21c 36.16±8.94c d 26.09±7.14d e 108.456 0.000枳實薤白桂枝湯低劑量組10 0.395 30.1±5.27 53.42±5.6c 31.56±4.51d 22.63±3.2b c d e 285.419 0.000枳實薤白桂枝湯中劑量組10 0.790 24.48±5.63 63.39±9.12a c 40.04±11.15a c d 38.81±7.47a c d 1 344.033 0.000枳實薤白桂枝湯高劑量組10 1.580 43.03±5.37b 84.79±8.19a b 52.27±10.35a b c d 44.36±10.26a b d e 276.036 0.000地爾硫卓組 10 0.005 25.11±9.54 69.99±11.51a c 38.32±9.4c d 31.24±5.64c d e 85.114 0.000 F 12.660 23.645 7.107 15.768 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 各組家兔用藥前后NO各時間點變化趨勢圖

2.4 各組家兔BigET-1水平的變化與模型組比較，枳實薤白桂枝湯低劑量組家兔在注射ET-1后2、6 h時BigET-1水平明顯下降，枳實薤白桂枝湯中、高劑量組和地爾硫卓組家兔在各時間點BigET-1水平均下降（P＜0.05），其中枳實薤白桂枝湯中、高劑量組和地爾硫卓組家兔在注射0.5 h后BigET-1水平明顯下降且枳實薤白桂枝湯高劑量組最為明顯；枳實薤白桂枝湯低劑量組與地爾硫卓組比較，注射0.5 h時BigET-1水平有顯著變化；枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓相比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；注射后0.5 h與注射后6 h，枳實薤白桂枝湯高劑量與地爾硫卓組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。各組在注射ET-1后BigET-1水平有顯著變化，且0.5 h達到峰值，2 h回落到基線水平。結(jié)果表明枳實薤白桂枝湯可有效地降低家兔BigET-1水平，其中枳實薤白桂枝湯中劑量組與地爾硫卓組藥效最為接近。（見表4、圖5）

表4 各組家兔BigET-1水平變化的比較（±s）

表4 各組家兔BigET-1水平變化的比較（±s）

注：F時間主效應(yīng)=3315.399，P時間主效應(yīng)=0.000，F(xiàn)分組主效應(yīng)=17.187，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=11.958，P交互效應(yīng)=0.000；與模型組比較，aP＜0.05；與地爾硫卓組比較，bP＜0.05；與注射前比較，cP＜0.05；與注射后0.5 h比較，dP＜0.05；與注射后2 h比較，eP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（g/kg） 注射前 注射后0.5 h 注射后2 h 注射后6 h F P模型組 10 - 230.64±24.83 685.06±48.39c 291.93±41.39cd 188.01±15.31cde 684.473 0.000枳實薤白桂枝湯低劑量組 10 0.395 196.54±38.16a 657.4±43.35bc 186.5±19.02ad 153.72±19.94acde 1 637.220 0.000枳實薤白桂枝湯中劑量組 10 0.790 183.52±34.41a 545.24±42.99ac 215.46±42.1acd 131.97±21.12acde 1 196.426 0.000枳實薤白桂枝湯高劑量組 10 1.580 178.15±24.59a 502.81±43.25abc 181.06±23.65ad 118.63±16.02abcd 1 478.367 0.000地爾硫卓組 10 0.005 187.67±23.69a 581.18±54.45ac 201.66±31.1acd 146.5±22.12acd 533.860 0.000 F 4.922 26.559 18.749 18.884 P 0.002 0.000 0.000 0.000

圖5 各組家兔用藥前后BigET-1各時間點變化趨勢圖

3 討 論

冠心病的實質(zhì)是冠狀動脈發(fā)生狹窄變化導(dǎo)致血流灌注下降引發(fā)的心肌缺血[10]，每年全球因心血管疾病死亡的人數(shù)高達一千余萬人[11]。美國心臟學(xué)會指出，如果能控制心臟疾病事故的發(fā)生，人類的平均壽命將延長約7年[12]。隨著人們生活水平和社會科技水平的不斷發(fā)展和進步，中醫(yī)藥在治療心血管疾病的廣泛應(yīng)用得到了高度重視，其具有較穩(wěn)定的藥效，療效可靠。

枳實薤白桂枝湯主要功效為通陽散結(jié)、祛痰下氣，對心胸滿痛，痛徹胸背，喘息咳唾，氣短氣逆，上攻于心胸等癥有較好的療效。相關(guān)研究報道，枳實薤白桂枝湯能有效地降低血液黏度，減少血小板的聚集，改善血管的舒張功能[13]。談曉東等[3]發(fā)現(xiàn)冠心病患者連續(xù)服用枳實薤白桂枝湯4周，其SAQ評分、SF-36評分及血瘀證積分相對4周前均有改善。枳實薤白桂枝湯在治療心血管疾病方面優(yōu)勢很大，對心肌缺血具有保護作用值得科研者探索。

冠狀動脈痙攣是導(dǎo)致心肌缺血的主要原因，冠狀動脈痙攣在體模型主要是通過活體動物進行局部的血管損傷誘導(dǎo)建立相關(guān)模型。目前冠狀動脈痙攣的相關(guān)動物模型主要有藥物刺激法、外膜纏繞法、內(nèi)皮損傷法等。由于ET-1為血管中重要的舒縮因子，據(jù)報道在冠狀動脈痙攣的同時其可與血管內(nèi)NO成動態(tài)平衡[14]，因此采用藥物刺激法外源注射ET-1誘發(fā)家兔冠狀動脈痙攣來探討相關(guān)藥物的作用機制。

心肌缺血的發(fā)生在ECG中主要是體現(xiàn)在T波、S-T段及QRS波群的改變，在急性冠脈綜合征早期，S-T段的改變是心肌損傷的重要表現(xiàn)，當(dāng)心肌受到損傷時，細(xì)胞膜的極化能力發(fā)生改變，導(dǎo)致電位差發(fā)生變化，因此T波、S-T段發(fā)生相應(yīng)的改變，給冠心病提供了相應(yīng)的診斷依據(jù)。本實驗通過注射外源性藥物誘導(dǎo)的方法使家兔發(fā)生冠狀動脈痙攣，誘發(fā)心肌缺血，心電圖Ⅱ?qū)?lián)T波出現(xiàn)高尖，S-T段持續(xù)抬高。各組家兔在注射ET-1 5 min后T波升高，S-T段不斷抬高，10 min時達到峰值后逐漸下降。枳實薤白桂枝湯各劑量組與地爾硫卓組均可降低T波升高與S-T段抬高，與模型組比較，用藥后各時間點枳實薤白桂枝湯中劑量組有顯著差異，且與地爾硫卓組無顯著差異。枳實薤白桂枝湯對冠狀動脈痙攣誘發(fā)的心肌缺血具有一定的保護作用。

1978年，F(xiàn)urchgott在實驗中發(fā)現(xiàn)在Ach的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞可釋放一種物質(zhì)，此物質(zhì)可以導(dǎo)致血管舒張，他將此物質(zhì)命名為內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子NO[15]。研究表明內(nèi)皮細(xì)胞舒張因子NO極易透過細(xì)胞膜，與肌球蛋白、血紅蛋白等具有較強的親和性[16]。BigET-1由血管內(nèi)皮細(xì)胞合成，有較強的血管收縮能力，對血管可以起到調(diào)節(jié)作用。研究證明，在血管內(nèi)BigET-1與NO可以相互調(diào)節(jié)，在維持血管內(nèi)環(huán)境的平衡方面具有一定的作用[17]。二者失調(diào)時，則可誘發(fā)血管痙攣。本實驗通過觀察各組家兔血管內(nèi)皮舒張因子NO及BigET-1表達，發(fā)現(xiàn)在藥物誘導(dǎo)冠狀動脈痙攣前后的各時間點枳實薤白桂枝湯各劑量組與地爾硫卓組對NO和BigET-1的水平均有不同程度的改善，與模型組比較均有顯著的變化，其中枳實薤白桂枝湯中劑量組改善效果更明顯，提示枳實薤白桂枝湯對冠狀動脈痙攣所引起的心肌缺血血管的內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境可能有改善作用。

綜上所述，枳實薤白桂枝湯可以作用于心肌細(xì)胞使NO水平升高,同時可降低BigET-1，其機制是通過血管內(nèi)皮源性舒張因子調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境平衡，減少自由基的產(chǎn)生，改善血流變化，從而改善心肌功能。本實驗為初步探討，其進一步機制還需進一步探究。