從TLR2/TLR4介導(dǎo)的炎癥因子表達水平探討麻杏石甘湯抗流感病毒的免疫機理*

張香港，何谷良，趙 澄，陳純靜，肖 榮，胡 玨，魏 科，李 玲，寧 毅，盧芳國

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；2.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000）

流行性感冒是由流感病毒感染引起的季節(jié)性急性呼吸道傳染病，在中醫(yī)學(xué)中屬外感熱病之瘟病、疫病范疇[1]，它的發(fā)生發(fā)展是流感病毒的致病作用與抗病毒免疫應(yīng)答作用相互影響和制約的結(jié)果。流感病毒進入不同機體后，病毒的增殖不僅可直接破壞宿主細胞的結(jié)構(gòu)和代謝，導(dǎo)致組織炎癥和病理改變，還會因機體免疫反應(yīng)過度而引起廣泛的免疫病理損傷。免疫病理損傷是流感病毒的重要致病機制[2]。有研究證實，流感病毒經(jīng)呼吸道進入機體后，能促進肺巨噬細胞炎癥因子（如IL-1、IL-6、TNF-α等）和趨化因子（如CCL2、CCL3、CXCL10等）大量分泌，過度分泌的細胞因子進一步造成嚴重的肺損傷[3-4]。肺泡灌洗液中CXCL10的含量水平與H1N1流感病毒導(dǎo)致肺組織的病理損傷程度呈正相關(guān)[5-6]。中醫(yī)藥在流行性感冒治療中應(yīng)用廣泛并有著獨特優(yōu)勢[7]。麻杏石甘湯源于《傷寒論》，具有辛涼宣肺、清熱平喘的功效，該方具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能等多種藥理作用，對咳嗽、支氣管炎、肺炎、哮喘等多種疾病具有良好的治療效果，并廣泛用于流行性感冒熱毒襲肺證和熱毒壅肺證的治療[8]。本課題組前期研究表明麻杏石甘湯能夠通過調(diào)節(jié)趨化因子CCL5和CXCL10等的表達水平而發(fā)揮抗流感病毒作用[9]。筆者在前期研究基礎(chǔ)上，以小鼠肺巨噬細胞為研究對象，從TLR2/TLR4介導(dǎo)的炎癥因子表達水平進一步研究其抗流感病毒的分子機制。

1 材 料

1.1 病毒株A型流感病毒（A/PR/8/34）小鼠肺適應(yīng)株由湖南師范大學(xué)病毒研究室提供，-80℃保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)病原微生物實驗室。病毒原液經(jīng)稀釋108倍后接種于10 d齡雞胚尿囊腔培養(yǎng)傳代，血凝效價1∶640用于本實驗。

1.2 細胞株 小鼠單核巨噬細胞RAW264.7購自中南大學(xué)湘雅細胞中心，本實驗室傳代后使用。

1.3 實驗動物8周齡SPF級SD大鼠40只，體質(zhì)量（200±20）g，雌雄各半，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-000，常規(guī)飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級屏障環(huán)境，12 h光照/黑夜循環(huán)，溫度25℃，濕度60%，自由攝食飲水。實驗單位使用許可證編號：SYXK（湘）2015-003。本實驗過程中涉及的大鼠處理措施均已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物管理委員會批準。

1.4 藥物與試劑 麻杏石甘湯方藥組成：麻黃9 g，杏仁9 g，生石膏18 g，炙甘草6 g。麻黃（安徽普仁中藥飲片有限公司，批號：1712052）、杏仁（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號：1712170062）、生石膏（亳州市滬譙藥業(yè)有限公司，批號：1706110212）、炙甘草（安徽亳藥千草國藥股份有限公司，批號：1707025）均購于湖南中醫(yī)藥大第一附屬醫(yī)院門診部，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部戴冰教授鑒定均為2015年版《中華人民共和國藥典》收錄正品。磷酸奧司他韋膠囊（上海羅氏，批號：M1036）；抗病毒口服液（廣州香雪制藥股份有限公司，批號：201705007）；胎牛血清（美國Gibco公司，批號：2232246）；0.25%胰酶（美國Gibco公司，批號：2120734）；Lipopolysaccharides（美國Sigma公司，貨號：L2630）；Sparstolonin B（美國Sigma公司，貨號：SML1767）；Pam3csk4（美國InvivoGen公司，貨號：tlrl-pms）；IL-1 ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司，貨號：TE20171110012）；IL-8 ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司，貨號：TE20171110121）；TNF-α ELISA試劑盒（上海晶天生物科技有限公司，貨號：TA20171108003）；TLR2抗體（美國Abcam公司，批號：GR3188234-5）；TLR4抗體（美國Abcam公司，批號：GR310706-5）。

1.5 主要儀器3111CO2細胞培養(yǎng)箱、1300生物安全柜（美國Thermo Scientific）；ELx800酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；光學(xué)掃描顯微鏡（Axioscope 5）+Axiocam 503 color顯微鏡攝像頭（蔡司科技有限公司）。

2 方 法

2.1 麻杏石甘湯水煎液的制備 參考《傷寒論》[10]及前期研究結(jié)果[11]，按其組成比例分別稱量7劑的藥材量。先稱取63 g麻黃，加入藥材總量10倍體積的蒸餾水，武火煎煮，待沸騰后，調(diào)整為文火煎煮25 min，去沫，再加入石膏126 g、杏仁63 g、甘草42 g，繼續(xù)文火煎煮30 min，煎煮完畢后濾過；二煎加入7倍體積蒸餾水武火煮沸后再文火煎煮20 min，煎煮完畢后濾過，混勻2次藥液濃縮至含生藥4.26 g/mL，避光保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2.2 含藥血清的制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組，每組10只。按動物體表面積與劑量換算法[12]，以60 kg人體每日服用藥物劑量與200 g大鼠體表面積換算得到各藥物組臨床等效劑量。按5倍臨床等效劑量灌胃給藥，計算出各藥物組的給藥劑量為：奧司他韋38.08 mg/（kg·d）、抗病毒口服液15.23 mL/（kg·d）、麻杏石甘湯21.32 g/（kg·d）。各藥物組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物1 mL，正常對照組予以相同體積生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)灌胃7 d。末次灌胃后禁食2 h，以10%水合氯醛麻醉大鼠后行腹主動脈采血，靜置后以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，再次離心上清液后用0.22 μm的除菌器濾過后分裝成2 mL/支，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 含藥血清對肺巨噬細胞活性影響的檢測 小鼠肺巨噬細胞用胰蛋白酶消化后，行細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為（5.0～10.0）×104/mL，移至96孔細胞培養(yǎng)板（每孔接種100 μL）培養(yǎng)12 h后分組。實驗設(shè)正常培養(yǎng)組（加10%胎牛血清）、空白血清組（分別加40%、20%、10%、5%大鼠空白血清）、奧司他韋含藥血清組（分別加40%、20%、10%、5%奧司他韋大鼠含藥血清）、抗病毒口服液含藥血清組（分別加40%、20%、10%、5%抗病毒口服液大鼠含藥血清）、麻杏石甘湯含藥血清組（分別加40%、20%、10%、5%麻杏石甘湯大鼠含藥血清），每組平行設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后棄培養(yǎng)液，用MTT法檢測細胞活性。

2.4 含藥血清對A型流感病毒感染肺巨噬細胞TLR2/TLR4介導(dǎo)的IL-1、IL-8、TNF-α分泌水平影響的檢測 小鼠肺巨噬細胞用胰蛋白酶消化后，行細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為（5.0～10.0）×104/mL。將細胞懸液接種于96孔細胞培養(yǎng)板（每孔接種100 μL），實驗設(shè)正常對照組、TLR2激活劑（Pam3csk4）組、TLR4激活劑（LPS）組、TLR2/4抑制劑（SsnB）組、病毒對照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組。每組平行設(shè)置4個復(fù)孔。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至孔板的60%時，病毒對照組和各藥物組加入稀釋倍數(shù)為100倍的病毒，各組均更換相應(yīng)干預(yù)因素的10%胎牛血清培養(yǎng)液或10%相應(yīng)含藥血清DMEM高糖200 μL進行培養(yǎng)，各干預(yù)因素作用24、48 h后收集細胞上清液。用ELISA試劑盒檢測IL-1、IL-8、TNF-α的分泌水平。

2.5 含藥血清對A型流感病毒感染肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達水平影響的檢測 小鼠肺巨噬細胞用胰蛋白酶消化后，行細胞計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞濃度為（5.0～10.0）×104/mL。將細胞懸液接種于已經(jīng)加無菌圓形蓋玻片的24孔板（每孔接種200μL），實驗設(shè)正常對照組、TLR2激活劑（Pam3csk4）組、TLR4激活劑（LPS）組、TLR2/4抑制劑（SsnB）組、病毒對照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組。每組平行設(shè)置3個復(fù)孔。37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至孔板的60%時，病毒對照組和各藥物組加入稀釋倍數(shù)為100倍的病毒，各組均更換相應(yīng)干預(yù)因素的10%胎牛血清培養(yǎng)液或10%相應(yīng)含藥血清DMEM高糖200 μL進行培養(yǎng)，各干預(yù)因素作用24 h后棄上清液，用PBS清洗3次后用4%多聚甲醛固定，將固定好的細胞用PBS清洗后，經(jīng)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加適量TLR2、TLR4一抗孵育、二抗孵育，DAB顯色，復(fù)染，梯度脫水，透明，封片后，鏡下觀察結(jié)果。細胞呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色為陽性表達。每張樣本切片在高倍鏡下（×400），隨機選取5個視野，用Image-Pro Plus 5.0軟件計算視野的平均光密度值，作為該樣本的相對表達量。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0處理分析。計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，多組比較，對樣本先進行正態(tài)及方差齊性檢驗，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性，使用單因素方差分析，并用LSD法進行組間的多重比較，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時，用非參數(shù)Kruskal-Wallis秩和檢驗。

3 結(jié) 果

3.1 含藥血清對肺巨噬細胞活性的影響 在含藥血清干預(yù)24 h后，濃度為40%、20%、10%、5%的各含藥血清組（奧司他韋含藥血清組、抗病毒口服液含藥血清組、麻杏石甘湯含藥血清組）肺巨噬細胞活性與正常培養(yǎng)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明各含藥血清對肺巨噬細胞活性無顯著性影響。在含藥血清干預(yù)48 h后，10%的奧司他韋含藥血清組肺巨噬細胞活性與正常培養(yǎng)組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其余各含藥血清組肺巨噬細胞活性明顯高于正常培養(yǎng)組（P<0.01）。說明各濃度含藥血清組對肺巨噬細胞均無毒性。本實驗選擇10%濃度的含藥血清進行后續(xù)實驗。（見表1）

表1 各組肺巨噬細胞活性比較±s，n=3）

表1 各組肺巨噬細胞活性比較±s，n=3）

24 h 48 h OD值 細胞活力（%）OD值 細胞活力（%）正常培養(yǎng)組 10% 1.55±0.21 100.00 0.59±0.07 100.00空白血清組 40% 1.51±0.13 97.41 0.87±0.09a 147.75 20% 1.70±0.08 109.67 0.86±0.07a 145.76 10% 1.55±0.21 100.00 0.84±0.01a 142.37 5% 1.55±0.73 100.00 0.87±0.01a 147.75奧司他韋含藥血清組 40% 1.45±0.19 93.54 0.86±0.03a 145.76 20% 1.43±0.26 92.25 0.80±0.07a 135.59 10% 1.57±0.26 101.29 0.58±0.07 98.30 5% 1.68±0.11 108.38 0.76±0.03a 128.81抗病毒口服液含藥血清組 40% 1.54±0.58 99.35 0.91±0.02a 154.23 20% 1.67±0.03 107.74 0.84±0.10a 142.37 10% 1.44±0.12 92.90 0.92±0.07a 155.93 5% 1.35±0.10 87.09 0.97±0.03a 164.40組別 血清濃度

續(xù)表1：

3.2 含藥血清對A型流感病毒感染肺巨噬細胞TLR2/4介導(dǎo)的IL-1、IL-8、TNF-α分泌水平的影響

3.2.1 各組肺巨噬細胞IL-1的分泌水平比較 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、病毒對照組肺巨噬細胞IL-1含量明顯升高（P＜0.01），TLR2/4抑制劑組肺巨噬細胞IL-1含量與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與病毒對照組比較，奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組肺巨噬細胞IL-1含量明顯降低（P＜0.01）；奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組之間肺巨噬細胞IL-1含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在含藥血清干預(yù)48 h后，各組間肺巨噬細胞IL-1含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖1）

圖1 各組肺巨噬細胞IL-1含量比較s，n=4）

3.2.2 各組肺巨噬細胞IL-8的分泌水平比較 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、TLR2/4抑制劑組、病毒對照組肺巨噬細胞IL-8含量明顯升高（P＜0.01）；與病毒對照組比較，奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組肺巨噬細胞IL-8含量明顯降低（P＜0.01）；奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組之間肺巨噬細胞IL-8含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在含藥血清干預(yù)48 h后，各組間肺巨噬細胞IL-8含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖2）

圖2 各組肺巨噬細胞IL-8含量比較s，n=4）

3.2.3 各組肺巨噬細胞TNF-α的分泌水平比較 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、病毒對照組肺巨噬細胞TNF-α含量明顯升高（P＜0.01），TLR2/4抑制劑組肺巨噬細胞TNF-α含量與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與病毒對照組比較，奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組肺巨噬細胞TNF-α含量明顯降低（P＜0.05）；奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組之間肺巨噬細胞TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。在給藥48 h后，各組間肺巨噬細胞TNF-α含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖3）

圖3 各組肺巨噬細胞TNF-α含量比較s，n=4）

3.3 含藥血清對A型流感病毒感染肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達水平的影響 在含藥血清干預(yù)24 h后，與正常對照組比較，TLR2激活劑組、TLR4激活劑組、病毒對照組肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達平均光密度值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），TLR2/4抑制劑組肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達平均光密度值與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與病毒對照組比較，奧司他韋組、麻杏石甘湯組肺巨噬細胞TLR2蛋白表達平均光密度值明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），麻杏石甘湯組肺巨噬細胞TLR4蛋白表達平均光密度值明顯降低（P＜0.05）。（見表2、圖4～5）

表2 各組肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達平均光密度值±s，n=3）

表2 各組肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達平均光密度值±s，n=3）

注：與正常對照組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與病毒對照組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 TLR2 TLR4正常對照組 0.24±0.16 0.12±0.04 TLR2激活劑組 0.32±0.25a 0.29±0.02b TLR4激活劑組 0.32±0.44a 0.29±0.08b TLR2/4抑制劑組 0.24±0.14 0.12±0.01病毒對照組 0.34±0.06b 0.24±0.01b奧司他韋組 0.23±0.03d 0.18±0.03抗病毒口服液組 0.30±0.01 0.18±0.04麻杏石甘湯組 0.26±0.04c 0.14±0.03c F 4.241 8.278 P 0.008 0.000

圖4 含藥血清干預(yù)24 h各組小鼠肺巨噬細胞TLR2蛋白表達水平（免疫組化，×400）

圖5 含藥血清干預(yù)24 h各組小鼠肺巨噬細胞TLR4蛋白表達水平（免疫組化，×400）

4 討 論

流感病毒感染機體后，機體啟動免疫應(yīng)答分泌細胞因子發(fā)揮抗病毒作用，主要表現(xiàn)為急性呼吸道感染癥狀，部分患者尤其是免疫功能低下或免疫功能紊亂的兒童及老人可表現(xiàn)為急性肺損傷（acute lung injury，ALI），甚至出現(xiàn)嚴重的急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），導(dǎo)致呼吸衰竭和多器官損傷。盡管目前流感病毒導(dǎo)致ARDS的機制尚未完全闡明，但病毒感染所致的“細胞因子風(fēng)暴”與肺損傷的相關(guān)性已被普遍認同?！凹毎蜃语L(fēng)暴”是指機體免疫系統(tǒng)被過度激活而引起趨化因子和促炎性細胞因子的過度釋放。過度釋放的細胞因子在清除病原體的同時，會誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，引起組織器官功能紊亂、衰竭乃至機體死亡。

單核吞噬細胞系統(tǒng)中巨噬細胞是重要的先天免疫細胞，其對增強機體防御、促進組織發(fā)育和維持機體穩(wěn)態(tài)起著關(guān)鍵的作用，并且是機體防御病原體入侵的第一道防線。巨噬細胞通過其表面受體識別病原體，經(jīng)吞噬、消化及抗原提呈作用后，促進機體細胞因子的表達來抵抗病原體入侵。Toll樣受體家族（Toll-like receptors，TLRs）是介導(dǎo)天然免疫的重要膜分子，其能識別病原微生物中的進化保守分子結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)至少存在13個TLRs家族成員，其中TLR2、TLR4高表達于巨噬細胞、B細胞、樹突狀細胞表面。TLR2/TLR4能監(jiān)視與識別疾病相關(guān)分子模式而啟動信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。流感病毒感染機體后，表達于巨噬細胞表面的TLR2、TLR4分子識別并結(jié)合病毒蛋白而啟動免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)細胞因子表達[14]。細胞因子對抑制病毒復(fù)制和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫具有重要的作用，但過度的細胞因子表達與分泌則會導(dǎo)致免疫病理損傷。因此，調(diào)節(jié)Toll樣受體表達與活化水平及其下游細胞因子的分泌是藥物抗流感病毒的效應(yīng)機制之一。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，A型流感病毒感染肺巨噬細胞24 h后細胞上清液IL-1、IL-8、TNF-α含量明顯升高，同時細胞免疫組化結(jié)果顯示TLR2、TLR4蛋白表達水平明顯升高，說明A型流感病毒可通過激活TLR2/TLR4信號通路促進炎癥因子IL-1、IL-8、TNF-α的分泌導(dǎo)致肺組織免疫病理損傷。

麻杏石甘湯源于《傷寒論》，是治療外感熱病的常用方。方中麻黃辛苦溫，宣肺解表而平喘；石膏辛甘大寒，清瀉肺胃之熱以生津，兩藥相輔，共為君藥。石膏倍于麻黃制麻黃溫?zé)嶂?，使整方不失為辛涼之劑，麻黃得石膏則宣肺平喘而不助熱。臣藥杏仁降利肺氣而平喘，與麻黃宣降相因。佐藥甘草調(diào)和諸藥。四藥共奏辛涼宣肺、清熱平喘之效。該方在國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《流行性感冒診療方案（2019年版）》及《流行性感冒診療方案（2020年版）》中被推薦為治療流感熱毒襲肺證、熱毒壅肺證的基礎(chǔ)處方[15-16]。研究表明該方對TLR4、TLR7/8介導(dǎo)的TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-α/β蛋白表達水平有調(diào)節(jié)作用，并能夠下調(diào)趨化因子CCL3、CCL25的蛋白表達水平而緩解流感病毒感染小鼠后引起的肺部免疫病理損傷[17-19]。本研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯含藥血清干預(yù)24 h可明顯降低A型流感病毒刺激的肺巨噬細胞上清液中IL-1、IL-8、TNF-α含量，并明顯降低肺巨噬細胞TLR2、TLR4蛋白表達水平，說明該方可通過調(diào)節(jié)A型流感病毒感染肺巨噬細胞TLR2、TLR4表達水平進而影響炎癥因子的分泌水平，這可能是其抗病毒作用的效應(yīng)機制之一。本研究可為該方治療流感的臨床應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)，然而，麻杏石甘湯的有效成分復(fù)雜，除TLR2/TLR4信號通路外，該方可否通過其他途徑調(diào)節(jié)流感病毒感染導(dǎo)致的炎癥因子的分泌水平有待進一步研究，其抗流感病毒作用的其他靶點仍需進一步挖掘。