基于HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)法同時測定麝香保心丸中8種成分的含量*

石 磊，譚廣山

（聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城 252000）

麝香保心丸來源于《太平惠民合劑局方》，是由人工麝香、人參提取物、人工牛黃、肉桂、蘇合香、蟾蜍和冰片7味中藥材經(jīng)過加工制備組成[1]。該方有芳香溫通、益氣強心的功效，臨床上主要用于氣滯血瘀所致的胸痹，如心前區(qū)疼痛、固定不移、心肌梗死等。從藥材組成上看，該方既有揮發(fā)性有效成分，又有非揮發(fā)性有效成分；既有紫外檢測器可檢測的有效成分，又有無紫外吸收的有效成分，這便為該制劑的質(zhì)量評價帶來巨大挑戰(zhàn)。如何建立一種準(zhǔn)確、快速、全面的評價方法，是目前亟需解決的主要內(nèi)容。

隨著檢測技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，二極管陣列和蒸發(fā)光散射檢測器聯(lián)用（DAD-ELSD）被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)雜復(fù)方的質(zhì)量控制中，如當(dāng)歸補血湯、復(fù)方丹參片、腎康靈顆粒等[2-4]，已成為中藥質(zhì)量評價體系中一種重要的檢測手段。目前，麝香保心丸已被收載于2020年版《中華人民共和國藥典》（一部）中，并對該方中蟾酥（華蟾酥毒基和酯蟾毒配基總量）和人參總提取物（人參皂苷Rg1和人參皂苷Re總量）的含量測定做了明確規(guī)定。但這2種藥材需分別處理樣品和檢測，色譜條件及流動相體系也不相同，檢測較為耗時。而且僅對方中2味中藥進行質(zhì)量控制，無法全面保證麝香保心丸的有效性、安全性和穩(wěn)定性。

麝香保心丸中使藥冰片和君藥麝香為人工配比合成的，所含主要成分含量較為穩(wěn)定；佐藥牛黃多為半人工制品；臣藥人參、蘇合香和佐藥蟾酥、肉桂四者均為天然藥材。因此，應(yīng)對天然藥材和半人工制品中的主要活性成分進行質(zhì)量控制。佐藥人工牛黃的主要活性成分為膽酸類成分，如膽酸；佐藥蟾酥強心止痛的主要活性成分為強心甾類，如華蟾酥毒基、酯蟾毒配基；臣藥人參提取物主要活性成分為皂苷類，如人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2；而臣藥蘇合香和佐藥肉桂中的主要活性成分有重疊，如肉桂酸，但苯甲酸芐酯僅臣藥蘇合香中含有[5-6]。故本研究采用HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)法建立了同時檢測麝香保心丸中苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基8種指標(biāo)性成分含量的方法，為評價麝香保心丸的質(zhì)量提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器（DAD），四元梯度泵，Empower Pro色譜工作站（美國安捷倫科技有限公司）；Alltech蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）3300（格雷斯中國有限公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；KQ5200 DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli Pore Advantage A10自動純水機（密理博中國有限公司）。

1.2 材料 蟾毒靈對照品（批號：111981-201503，純度：98.0%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201424，純度：93.7%）、人參皂苷Rb2對照品（批號：111715-201203，純度：93.8%）（中國食品藥品檢定研究院）；蟾毒他靈對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：150809，純度：98.3%）；苯甲酸芐酯對照品（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號：F20150621，純度：98.0%）；華蟾酥毒基對照品（批號：110803-200605，純度：100.0%）、酯蟾毒配基（批號：10718-200507，純度：100.0%）、膽酸對照品（批號：100078-200414，純度：100.0%）（中國藥品生物制品檢定所）；5批麝香保心丸（上海和黃藥業(yè)有限公司，批號：20200410，20200513，20200523，20200607，20200705，規(guī)格：每丸重22.5mg）；純化水（屈臣氏）；乙腈（色譜純，Merk公司）；二氯甲烷、甲醇等試劑（分析純，天津化學(xué)試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Waters XBridgeTMC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%甲酸水溶液（B），梯度洗脫，洗脫程序：0～10 min，20%A；10～25 min，20%→32%A；25～35 min，32%→40%A；35～50 min，40%→70%A；50～65 min，70%→100%A；DAD（苯甲酸芐酯、華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒他靈、蟾毒靈）檢測波長：280 nm，柱溫：30 ℃，體積流量：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；ELSD（膽酸、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2）漂移管溫度：40 ℃，載氣流量：1.5 L/min。

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取苯甲酸芐酯對照品5.65 mg、華蟾酥毒基對照品4.55 mg、酯蟾毒配基對照品4.67 mg、蟾毒他靈對照品4.58 mg、蟾毒靈對照品4.99 mg、膽酸對照品4.57 mg、人參皂苷Rb1對照品4.08 mg、人參皂苷Rb2對照品5.01 mg，分別置100 mL的容量瓶中加混合溶劑[甲醇（V）∶二氯甲烷（V）∶水（V）=4∶2∶0.5]溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為55.370、45.500、46.700、45.021、48.902、45.700、38.230、46.990 μg/mL對照品貯備溶液。

2.3 供試品溶液的制備 稱取麝香保心丸細粉0.5 g，精密稱定質(zhì)量，置25 mL的具塞錐形瓶中，精密量取10 mL混合溶劑[甲醇（V）:二氯甲烷（V）∶水（V）=4∶2∶0.5]，緩緩加入后稱定總質(zhì)量，低溫超聲提取25 min，放冷后再稱質(zhì)量，補足減失的溶劑質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.4 陰性對照品溶液制備 按麝香保心丸各藥材用量比例及制劑工藝流程分別制備缺牛黃和人參藥材，以及缺蟾酥和蘇合香藥材的陰性對照品，再按已定的樣品制備方法分別制備缺牛黃和人參藥材，以及缺蟾酥和蘇合香藥材的陰性對照品溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取已制備好的對照品溶液和供試品溶液各10 μL，并按“2.1”項下高效液相色譜條件進樣，最后記錄色譜圖。（見圖1）結(jié)果顯示，苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基8個色譜峰的分離度均良好，表明所建立的HPLC法滿足測試要求。

圖1 HPLC 圖

2.6 線性關(guān)系、定量限和檢出限 分別精密吸取0.25、0.50、1.25、2.50、5.00 mL的苯甲酸芐酯（55.370μg/mL）、膽酸（45.700μg/mL）、蟾毒他靈（45.021 μg/mL）、蟾毒靈（48.902μg/mL）、人參皂苷Rb1（38.230 μg/mL）、人參皂苷Rb2（46.990 μg/mL）、華蟾酥毒基（45.500 μg/mL）、酯蟾毒配基（46.700 μg/mL）混合對照品貯備液，置于5 mL的容量瓶中，滴加混合溶劑[甲醇（V）∶二氯甲烷（V）∶水（V）=4∶2∶0.5]定容至刻度線，即可得到不同質(zhì)量濃度的苯甲酸芐酯對照品溶液、膽酸對照品溶液、蟾毒他靈對照品溶液、蟾毒靈對照品溶液、人參皂苷Rb1對照品溶液、人參皂苷Rb2對照品溶液、華蟾酥毒基對照品溶液和酯蟾毒配基對照品溶液，按既定的色譜條件吸取10 μL分別依次進樣，根據(jù)峰面積計算含量。即苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的質(zhì)量（X，μg）分別為橫坐標(biāo)，各自的峰面積積分值（Y）分別為縱坐標(biāo)，并分別計算得出各標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果顯示，8種成分的線性關(guān)系在各自相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的相關(guān)性。以3倍信噪比（S/N=3）計算儀器的檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計算儀器的定量限。（見表1）

表1 8 種化學(xué)成分線性關(guān)系、檢測限和定量限

2.7 精密度試驗 取同一樣品，按“2.3”項下制備供試品溶液的方法及“2.1”項下HPLC條件操作，連續(xù)進樣6次，測定各化學(xué)成分的含量。結(jié)果苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含有量RSD分別為1.05%、0.96%、1.03%、1.05%、1.18%、1.13%、1.23%、1.48%，表明本方法精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 取同一樣品，按“2.3”項下制備供試品溶液的方法操作，分別于0、2、4、6、8、12 h注入HPLC色譜儀。結(jié)果苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基各成分的峰面積RSD分別 為1.09%、1.32%、1.13%、0.99%、0.96%、1.02%、1.05%、1.01%，表明供試品溶液中8種成分在12 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.9 重復(fù)性試驗 取同一樣品共6份，按“2.3”項下供試品制備方法及“2.1”項下HPLC條件操作，分別進樣分析。結(jié)果苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含有量RSD分別為1.02%、1.05%、1.03%、1.09%、0.99%、0.92%、1.08%、1.04%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗 取同一供試品（批號：20200410）約0.25 g，平行9份，精密稱定質(zhì)量，分別置50 mL錐形瓶中，每組分別加入苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基對照品儲備液，加入量約為樣品中各含量的50%、100%和150%，按“2.3”項下制備供試品溶液的方法及“2.1”項下HPLC條件操作分別進樣，計算回收率。苯甲酸芐酯平均回收率（n=9）為99.98%，RSD為0.86%；膽酸平均回收率（n=9）為100.09%，RSD為0.65%；蟾毒他靈平均回收率（n=9）為99.98%，RSD為0.66%；蟾毒靈平均回收率（n=9）為101.95%，RSD為0.92%；人參皂苷Rb1平均回收率（n=9）為99.50%，RSD為0.40%；人參皂苷Rb2平均回收率（n=9）為100.09%，RSD為0.69%；華蟾酥毒基平均回收率（n=9）為99.89%，RSD為0.66%；酯蟾毒配基平均回收率（n=9）為99.99%，RSD為0.62%，表明加樣回收試驗結(jié)果良好，基本符合方法學(xué)要求。（見表2）

表2 8 種成分加樣回收率實驗結(jié)果（n=9）

續(xù)表2：

2.11 含量測定 取5批麝香保心丸，按照已定的供試品制備方法及HPLC條件操作，分別進樣分析，記錄峰面積，計算苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基各自含量。（見表3）

表3 5 批樣品中8 種化學(xué)成分含量測定結(jié)果（，mg/g）

表3 5 批樣品中8 種化學(xué)成分含量測定結(jié)果（，mg/g）

3 討論

3.1 有效成分的選擇 麝香保心丸是經(jīng)過水液煎煮提取、濃縮等一系列復(fù)雜制備工藝制備而成的中藥復(fù)方制劑，該方中各組分協(xié)同作用[7-8]。筆者根據(jù)制劑配伍的君臣佐使原則，結(jié)合該復(fù)方的藥理文獻報道[9-11]，選擇可能發(fā)揮療效的蟾酥（華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒他靈、蟾毒靈）、蘇合香（苯甲酸芐酯）、人參提取物（人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2）和人工牛黃（膽酸）中的8種成分為定量指標(biāo)，采用HPLC-DAD-ELSD法同時測定8種指標(biāo)性成分的含量。結(jié)果顯示，8種成分在已定的色譜條件和檢測條件下分離度均良好。本次研究為該復(fù)方制劑臨床的有效性與質(zhì)量保持相一致提供了科學(xué)依據(jù)。

3.2 樣品處理方法和檢測波長的優(yōu)選 參照《中華人民共和國藥典》中對麝香保心丸的處理方法處理樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該供試品溶液處理方法可使樣品中苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基提取完全。且根據(jù)《中華人民共和國藥典》和相關(guān)文獻報道[12-15]，華蟾酥毒基、酯蟾毒配基、蟾毒他靈、蟾毒靈、苯甲酸芐酯在波長280 nm處均有吸收，而在此波長下無法檢測出膽酸、參皂苷Rb1和人參皂苷Rb2。故本次實驗選擇HPLCDAD-ELSD法同時對苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基8種化學(xué)成分進行定量分析。

3.3 色譜條件的選擇 本研究分別考察了乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.5%冰乙酸水、乙腈-0.5%甲酸水4種流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，以乙腈-0.5%甲酸水溶液為本次實驗的流動相進行梯度洗脫時，苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基8種成分的分離效果均呈良好效果；分別考察了不同溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃）和不同體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）對各色譜峰分離效果的影響，結(jié)果顯示，柱溫30 ℃、體積流量0.8 mL/min時基線較平穩(wěn)、分離度和峰形可以達到較好的效果；考察了不同廠家和品牌的色譜柱5 μm）、Waters XBridgeTMC18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Thermo BDS-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]，結(jié)果顯示，Waters XBridgeTM C18柱能將8種指標(biāo)性成分，即苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的色譜峰分開，并達到良好的分離度。

3.4 樣品含量分析 通過HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)法對5批麝香保心丸中8種成分同時測定，結(jié)果顯示，不同批次之間有4種成分差異較小，即苯甲酸芐酯含量為0.905～0.911 mg/g，相當(dāng)于每丸含20.36～20.49 μg；膽酸含量為0.701～0.713 mg/g，相當(dāng)于每丸含15.77～16.04 μg；人參皂苷Rb1含量為0.302～0.308mg/g，相當(dāng)于每丸含6.80～6.93μg；酯蟾毒配基含量為0.512～0.518mg/g，相當(dāng)于每丸含11.52～11.67 μg。而不同批次之間的另外4種有效成分含量差異略大，即蟾毒他靈含量為0.782～0.805 mg/g，相當(dāng)于每丸含17.60～18.11 μg；蟾毒靈含量為0.801～0.898 mg/g，相當(dāng)于每丸含18.02～20.21μg；人參皂苷Rb2含量為0.506～0.518 mg/g，相當(dāng)于每丸含11.39～11.66 μg；華蟾酥毒基含量為0.535～0.588 mg/g，相當(dāng)于每丸含12.04～13.23 μg。其中，5批樣品均符合《中華人民共和國藥典》中關(guān)于麝香保心丸的規(guī)定，即麝香保心丸每丸含中脂蟾毒配基和華蟾酥毒基的總量計應(yīng)為18～56 μg。以上結(jié)果表明，本研究所建立的同時測定多指標(biāo)方法，快速、準(zhǔn)確、分離良好，可用于評價麝香保心丸產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性及批次的均一性。

4 小結(jié)

本研究建立了HPLC-DAD-ELSD串聯(lián)法同時測定麝香保心丸中苯甲酸芐酯、膽酸、蟾毒他靈、蟾毒靈、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rb2、華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的方法，通過HPLC分離參數(shù)的考察，選擇最理想的HPLC分離條件，同時對樣品的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率進行了考察。該方法能較為客觀、準(zhǔn)確、全面地測定不同活性成分的含量。本研究通過對麝香保心丸蟾酥、蘇合香、人工牛黃和人參提取物4味藥材中的有效成分同時進行測定，實現(xiàn)了僅用一種檢測方法同時控制4味藥材的質(zhì)量，不僅為提高麝香保心丸的內(nèi)在質(zhì)量實驗數(shù)據(jù)，也為其他中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量控制與評價提供了借鑒。