小口徑血管的生物打印進(jìn)展

曹霞 ，Sushila Maharjan ，Ramla Ashfaq，Jane Shin，Yu Shrike Zhang *

Division of Engineering in Medicine, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Cambridge, MA 02139, USA

1. 引言

血管是把氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)輸送到組織中并從中攜帶二氧化碳和其他代謝廢物的通道，主要包括三種類型：動(dòng)脈、毛細(xì)血管和靜脈，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)組成、尺寸和生理功能上都不同[1]。根據(jù)血管內(nèi)徑（inner diameter, ID），可將其分為微血管（ID < 1 mm）、小血管（ID = 1～6 mm）和大血管（ID > 6 mm）[2,3]。

主動(dòng)脈是人體內(nèi)最大的血管，它將含氧血液從心臟輸送到身體的不同部位。主動(dòng)脈分支成動(dòng)脈，動(dòng)脈進(jìn)一步分支成更小的血管，稱為小動(dòng)脈。小動(dòng)脈最終分支成細(xì)小的毛細(xì)血管，它們是最小的血管。毛細(xì)血管可允許氧氣、營(yíng)養(yǎng)素、二氧化碳和其他代謝廢物在血液和局部組織之間擴(kuò)散[4,5]。毛細(xì)血管在小動(dòng)脈和小靜脈之間形成一個(gè)網(wǎng)絡(luò)，其中小靜脈是非常小的靜脈，負(fù)責(zé)從毛細(xì)血管中收集脫氧血液，并將其輸送到逐漸增大的靜脈中，最后回流進(jìn)入心臟[6]。

盡管動(dòng)脈和靜脈具有不同的功能，但它們的血管壁都是由不同細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix, ECM）組成。這些細(xì)胞和ECM主要分為三個(gè)層：內(nèi)層內(nèi)膜、中層中膜和外層外膜[圖1（a）] [7,8]。毛細(xì)血管（ID < 10 μm）由單層內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells, EC）組成，形成血管的內(nèi)層（內(nèi)膜），并被基膜和周細(xì)胞包圍[圖1（b）] [9,10]。小動(dòng)脈和小靜脈（ID = 10～100 μm）由內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層（內(nèi)膜）和周圍的平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells, SMC）層（中膜）組成[圖1（b）]。動(dòng)脈和靜脈（ID > 100 μm）由內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層（內(nèi)膜）、中間的平滑肌細(xì)胞層（中膜）及成纖維細(xì)胞和ECM成分外層（外膜）組成[圖1（b）] [10,11]。血管的不同層及其細(xì)胞組成、直徑、ECM成分和功能見表1 [12,13]。

表1 血管的一般結(jié)構(gòu)和功能[12,13]

內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞是組成動(dòng)脈和靜脈的關(guān)鍵細(xì)胞類型。這些細(xì)胞類型的相互作用不僅在血管系統(tǒng)的發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，而且在維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面也起著關(guān)鍵作用[14]。血管的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層在表型和功能上具有顯著的異質(zhì)性，這是由于它們?cè)谘鬟^程中經(jīng)歷了不同的微環(huán)境以及不同水平的壓力和剪切應(yīng)力[15]。內(nèi)膜中的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層起到了嚴(yán)密調(diào)節(jié)動(dòng)態(tài)屏障的作用，可防止血液泄漏到周圍組織和間質(zhì)中。它們也在一些生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括調(diào)節(jié)血流和通透性、炎癥部位循環(huán)免疫細(xì)胞的跨內(nèi)皮遷移、維持血管張力和止血作用[16,17]。血管中內(nèi)皮細(xì)胞沿縱向排列，平滑肌細(xì)胞沿圓周方向排列，并由彈性纖維隔開。平滑肌細(xì)胞具有收縮表型，通過主動(dòng)收縮和舒張維持血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)。此外，平滑肌細(xì)胞還具有分泌表型，負(fù)責(zé)ECM的合成和修復(fù)，從而調(diào)節(jié)血管壁的結(jié)構(gòu)[18]。

圖1. 血管的一般結(jié)構(gòu)和類型。（a）組成動(dòng)脈壁和靜脈壁的各個(gè)層的結(jié)構(gòu)示意圖。經(jīng)Mary Hammes許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[8]，?2015。（b）不同類型血管的細(xì)胞組成、直徑和厚度。表中的條狀圖形代表血管中各個(gè)層所占的比例。毛細(xì)血管包括被周細(xì)胞包圍的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層；小動(dòng)脈/小靜脈由一層薄薄的平滑肌細(xì)胞層所包圍的內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層構(gòu)成；動(dòng)脈/靜脈由內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層和成纖維細(xì)胞外層組成，內(nèi)皮細(xì)胞形成的內(nèi)層周圍有致密的平滑肌細(xì)胞層。經(jīng)Nature許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[10]，?2018，以及經(jīng)American Physiological Society, Inc.許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[11]，?1954。

冠心病和外周動(dòng)脈疾病導(dǎo)致全球死亡率和發(fā)病率逐年增加，預(yù)計(jì)到2030年，年死亡率將增至2330萬[19]。目前常用的血管重建方法包括：血管成形術(shù)、支架植入術(shù)和外科旁路移植術(shù)[20]。對(duì)于旁路移植來說，治療冠狀動(dòng)脈和周圍血管疾病等的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是使用自體動(dòng)脈或靜脈（主要是胸內(nèi)動(dòng)脈或隱靜脈）[20]。然而，健康的自體血管并不容易獲取，需要進(jìn)行侵入性采集，并且長(zhǎng)期通暢率也很低[21,22]。采用合成血管移植物替代自體血管，可成功替換中型和大型血管。合成血管主要由聚對(duì)苯二甲酸乙二酯或聚四氟乙烯制成[23,24]。盡管這些合成移植物已被證明對(duì)中型和大型血管具有有效的長(zhǎng)期通暢性，但由于仍存在生物力學(xué)特性不匹配、生物相容性差、血栓形成、微生物污染和通暢率差等特點(diǎn)而受到限制[25-27]?？紤]目前血管類導(dǎo)管的局限性，以及包括冠狀動(dòng)脈和外周動(dòng)脈在內(nèi)的小口徑血管的病理事件，醫(yī)療領(lǐng)域一直存在對(duì)具有降低小口徑血管疾病發(fā)病率潛力的生物工程血管的臨床需求 [28]。

隨著血管生物工程的發(fā)展，三維（3D）生物打印技術(shù)已成為有潛力的血管生成方法，生成的血管具有在體內(nèi)生長(zhǎng)、重塑、修復(fù)血管疾病的能力。在過去的幾年里，不同的3D生物打印技術(shù)和策略被報(bào)道用以制造仿生血管，并不斷得到完善和改進(jìn)[29-32]。本文綜述了應(yīng)用于血管工程的各種生物打印技術(shù)，包括擠出生物打印、噴墨生物打印、激光輔助生物打印、光固化生物打印等，以及它們的優(yōu)點(diǎn)和局限性。我們還討論了不同的生物材料及其生物相容性、可打印性、力學(xué)性能等，以及在制備合適的生物墨水以滿足小口徑血管3D生物打印的關(guān)鍵要求方面所面臨的挑戰(zhàn)。最后，我們探討了未來可能的發(fā)展方向。

2. 三維生物打印

3D生物打印技術(shù)在血管組織工程領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展。要實(shí)現(xiàn)與天然血管的整合，具有長(zhǎng)期通暢性的工程血管的基本要求包括：適當(dāng)?shù)牧W(xué)性能、高順應(yīng)性、重塑能力和抗血栓形成能力[33]。理想生物工程血管特別是小口徑血管的要求見表2 [25]。3D生物打印可以將生物材料和活細(xì)胞（統(tǒng)稱為生物墨水）精確沉積在指定位置，形成與天然血管非常相似的結(jié)構(gòu)[34]。生物打印可通過各種方式、策略以及來源廣泛的生物墨水成功制備血管組織[24]。最常用的生物打印方式包括：噴墨打印[35]、擠出打印[36,37]、激光輔助打印[38]和光固化生物打印[39,40]。噴墨打印是一種非接觸生物打印技術(shù)，生物墨水液滴從墨盒中以預(yù)設(shè)尺寸進(jìn)行沉積，生成偽3D或3D結(jié)構(gòu)[圖2（a）] [31,41]。擠出生物打印是最常用的生物打印方法，其中生物墨水通過由打印頭形成長(zhǎng)絲的形式進(jìn)行連續(xù)分配[圖2（b）] [31,42]。與噴墨打印和擠出打印相比，激光輔助生物打印不太常見，該方法使用激光脈沖將生物墨水從供體載玻片沉積到受體基板上[圖2（c）] [31,43,44]?；诠夤袒纳锎蛴?，通常采用立體光刻或數(shù)字光處理的形式，通過精確控制的光掩模在垂直移動(dòng)的平臺(tái)上逐層聚合光敏聚合物，以創(chuàng)建具有所需的3D結(jié)構(gòu)[圖2（d）] [45,46]。

表2 理想的生物工程小口徑血管需滿足的要求[25]

每種模式都有其優(yōu)缺點(diǎn)，并且在一些參數(shù)（如生物墨水和基質(zhì)的選擇、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和制造的數(shù)量）上有所不同[47]。噴墨生物打印具有生物墨水沉積速度快和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)；然而，由于分配層的不穩(wěn)定性，其容量通常有限[48,49]。擠出生物打印是一種成本效益高且易于控制的方法。但這種方法打印速度相對(duì)緩慢，且分辨率較低[50]。激光輔助生物打印具有制造速度快、分辨率高和生物相容性良好的特點(diǎn)，但儀器成本較高[51]?；诠夤袒纳锎蛴∫簿邆浞直媛矢吆涂焖僦圃斓奶攸c(diǎn)，但儀器比較復(fù)雜[52]。根據(jù)血管的不同形狀和大小，不同的3D生物打印模式已被應(yīng)用于體外制造具有不同功能的血管系統(tǒng)[圖2（e）] [5]。

3. 生物墨水的設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)生物工程血管系統(tǒng)的功能，其結(jié)構(gòu)和完整性必須與天然血管相似（兩者都高度依賴于周圍ECM的力學(xué)性能和化學(xué)信號(hào)）[53]。ECM是各種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的貯存器和調(diào)節(jié)劑，其在血管形成過程中為內(nèi)皮細(xì)胞的組織和穩(wěn)定提供結(jié)構(gòu)支持[54]。因此，ECM特性，如密度、異質(zhì)性和硬度在調(diào)節(jié)血管形態(tài)發(fā)生、毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)形成和屏障完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[55,56]。

組成不同血管層的主要ECM成分如表1 [12,13]所示。內(nèi)皮細(xì)胞排列在血管腔內(nèi)層，血管腔位于基底膜上，基底膜主要由膠原、層黏連蛋白、纖維連接蛋白、巢蛋白、硫酸肝素蛋白多糖和其他大分子組成[54,57]。中膜是平滑肌細(xì)胞的中間層，由含有纖維膠原I、III、V的膠原質(zhì)ECM，層黏連蛋白，彈性蛋白，纖維連接蛋白，透明質(zhì)酸和核心蛋白聚糖組成[58-60]。內(nèi)膜和中膜被內(nèi)彈性膜分開。外膜層是結(jié)締組織和成纖維細(xì)胞的最外層，包括彈性蛋白、I型和IV型膠原以及蛋白聚糖[57,59-61]。

因此要想成功地在體外制造血管，特別是直徑較小的血管，需要更高分辨率的生物打印方法與適當(dāng)?shù)纳锬浞街g的協(xié)同作用。生物墨水可以提供結(jié)構(gòu)和機(jī)械支持，以維持細(xì)胞活力，同時(shí)促進(jìn)移植或血管新生[62]。生物墨水是由生物材料、細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)素、生長(zhǎng)因子組成，應(yīng)該模擬組織的最佳ECM環(huán)境[63]。生物墨水的設(shè)計(jì)應(yīng)考慮主要的ECM組成，這對(duì)于血管的3D生物打印至關(guān)重要，因?yàn)樗粌H決定了生物打印的分辨率，還決定了血管的完整性和其他關(guān)鍵的生物特性[64-66]。

圖2. 具有代表性的3D生物打印方法。（a）噴墨生物打印法示意圖；（b）擠出生物打印法原理圖；（c）激光輔助生物打印法原理圖。經(jīng)Wiley許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[44]，?2013。（d）光固化生物打印法示意圖[46]。經(jīng)Xuanyi Ma等許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[46]。（e）血管的層次結(jié)構(gòu)和當(dāng)前的生物打印技術(shù)示意圖，這些技術(shù)已被用于制造各種不同的血管。經(jīng)Elsevier許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[5]，?2019。

用于血管3D生物打印的生物墨水最常用的配方是基于水凝膠前體的配方，原因是這些配方具有優(yōu)異的生物相容性、可調(diào)節(jié)的硬度和孔隙率、模擬天然ECM的能力以及與不同生物打印模式相兼容的特性[67]。已有研究對(duì)幾種天然和合成生物材料進(jìn)行了單獨(dú)或組合使用，設(shè)計(jì)出類似于ECM理化性質(zhì)的生物墨水。廣泛用于體外血管組織工程的天然生物材料，包括明膠[68-71]、膠原[72-77]、彈性蛋白[78-81]、纖維蛋白[82-85]、透明質(zhì)酸[68,86,87]、瓊脂糖[49,88]、海藻酸[89,90]和基質(zhì)膠[91-93]等。基于天然生物材料的水凝膠為細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)和增殖提供了適宜的微環(huán)境；最重要的是，它通常不會(huì)對(duì)宿主造成慢性炎癥或毒性[74]。然而，天然水凝膠的弱機(jī)械強(qiáng)度無法承受生理壓力，因而限制了其在血管組織工程中的應(yīng)用[94]。因此，已有研究將各種合成聚合物與天然生物材料相結(jié)合，原因是合成聚合物具有精確控制的力學(xué)性能、孔隙率、再現(xiàn)性、結(jié)構(gòu)多樣性、剛度和生物降解性[95]。常用的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG）[96,97]、聚甲基丙烯酸羥乙基酯[98]和聚乙烯醇（PVA）[99,100]。這些復(fù)合材料可以提供良好的機(jī)械支撐，提高打印結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度。然而，由于缺乏生物相容性、細(xì)胞黏附性差、釋放有毒副產(chǎn)物以及降解過程導(dǎo)致力學(xué)性能下降，合成聚合物的應(yīng)用受到限制[47]。

為了克服這些限制并獲得具有理想性能的生物墨水，人們采用了基于化學(xué)、機(jī)械、物理和生物改性的不同方法來探索功能化。最常用的功能化方法之一是將甲基丙烯酰基引入聚合物，如明膠[101-105]、膠原[106,107]和透明質(zhì)酸[108,109]。這種方法產(chǎn)生的光聚合物可以按要求形成力學(xué)性能穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。這些聚合物的機(jī)械強(qiáng)度很大程度上取決于甲基丙烯酰改性程度和光照暴露程度。甲基丙烯酰改性程度越高，光照時(shí)間越長(zhǎng)，結(jié)構(gòu)的強(qiáng)度就越高，降解率就越低[110]。應(yīng)用兩種或兩種以上交聯(lián)機(jī)制有助于顯著提高結(jié)構(gòu)完整性和機(jī)械強(qiáng)度[110,111]。例如，當(dāng)使用維生素B2（核黃素）[112]共價(jià)交聯(lián)脫細(xì)胞ECM （decellularized ECM, dECM）生物墨水，然后通過膠原纖維形成熱觸發(fā)物理交聯(lián)時(shí)[113]，能獲得更好的力學(xué)性能。與單獨(dú)交聯(lián)的結(jié)構(gòu)物相比，這種兩步交聯(lián)機(jī)制表現(xiàn)出更高的儲(chǔ)能模量，表明每種交聯(lián)機(jī)制都有助于提高結(jié)構(gòu)物的整體力學(xué)性能[113]。另一方面，混合生物墨水材料也可以達(dá)到同樣的效果。例如，在明膠甲基丙烯酸（gelatin methacryloyl, GelMA）中添加明膠提高了交聯(lián)度，從而改善了力學(xué)性能[114]。此外，當(dāng)其他聚合物，如甲基纖維素[115]、四臂聚乙二醇丙烯酸酯（4-arm PEG-tetra-acrylate, PEGTA）[110]、具有三季戊四醇核的八臂聚乙二醇丙烯酸酯（8-arm PEG-acrylate with a tripentaerythritol core, PEGOA）[116]、透明質(zhì)酸[117]、PVA [118]和羥基磷灰石[119]加入時(shí)，它們可以增強(qiáng)剪切變稀行為和（或）提高生物打印后的形狀保真度。

此外，將各種生物活性物質(zhì)，如纖維蛋白（或纖維蛋白原和凝血酶）和聚賴氨酸添加到生物墨水中，可以誘導(dǎo)或增強(qiáng)其生物活性。纖維蛋白是一種纖維蛋白原的聚合物，在凝血酶存在下形成纖維狀、黏彈性和多孔水凝膠。纖維蛋白已被證明可以提高生物墨水的生物黏附性和生物活性[120]。帶正電荷的聚賴氨酸也被用于通過增加與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜的靜電相互作用來增強(qiáng)細(xì)胞黏附性[121]。

同樣，非黏附性水凝膠的生化性能也可通過黏附肽配體的修飾得到改善。精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（arginine-glycine-aspartic acid, RGD）肽是最常用的肽配體，在細(xì)胞黏附、擴(kuò)散和遷移中起著關(guān)鍵作用[122]。例如，與未經(jīng)RGD修飾的水凝膠相比，與RGD肽共軛的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-diacrylate, PEGDA）水凝膠增強(qiáng)了細(xì)胞的黏附性[123]。進(jìn)一步說明，植入的PEGDA水凝膠中含有的RGD肽可調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞黏附性、炎癥反應(yīng)、纖維包封和血管形成[123]。RGD肽也被引入其他各種水凝膠形成聚合物中，如透明質(zhì)酸[123]、海藻酸[124]、殼聚糖[125]和PEG [126]水凝膠，用來改善細(xì)胞行為。

多種生長(zhǎng)因子，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor, FGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）以及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α（transforming growth factor-α, TGF-α）和TGF-β已被確定是血管生成的誘導(dǎo)因子。例如，F(xiàn)GF-2 [127]和VEGF [128]用于刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和分化，是血管形成的關(guān)鍵介質(zhì)[129]。在體內(nèi)和體外研究中，VEGF被物理地包封在PEG水凝膠中，以釋放響應(yīng)細(xì)胞分泌的蛋白酶，從而增強(qiáng)血管形成[130]。此外，在ECM蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了一些生長(zhǎng)因子結(jié)合位點(diǎn)，如纖維連接蛋白[131]、纖維蛋白原[132]、細(xì)胞黏合素C [133]和玻璃體蛋白[134]。已有研究表明與這些ECM蛋白結(jié)合的VEGF可促進(jìn)糖尿病患者的傷口和骨缺損的愈合[135]。雖然其中一些策略可能尚未與血管生物打印中所使用的生物墨水相結(jié)合，但它們?cè)谘苌锎蛴≈械膽?yīng)用似乎顯而易見。

最近，一些研究表明改變基質(zhì)黏彈性對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生影響，包括通過改變聚合物的共價(jià)交聯(lián)和（或）濃度來降低丙烯酰胺水凝膠的模量[136,137]，通過改變親和力不同的共價(jià)交聯(lián)劑來調(diào)節(jié)PEG水凝膠中的應(yīng)力松弛[138]，或使用海藻酸水凝膠的共價(jià)和（或）物理交聯(lián)[139]。這些研究表明，在二維（2D）培養(yǎng)中，改良的耗能模量和基質(zhì)可緩慢增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）的細(xì)胞鋪展和成骨分化[136,137]，增強(qiáng)的基質(zhì)應(yīng)力松弛改善了2D培養(yǎng)細(xì)胞的擴(kuò)散和增殖[139]，并使細(xì)胞適應(yīng)相關(guān)的3D培養(yǎng)形態(tài)[138]。同樣，研究表明，細(xì)胞在彈性和黏彈性水凝膠中表現(xiàn)不同，生物材料的弛豫行為隨著細(xì)胞的相互作用而改變，細(xì)胞行為改變包括擴(kuò)散、增殖和分化[140]。MSC分化依賴于3D水凝膠的初始彈性模量，而在彈性水凝膠中，MSC分化對(duì)水凝膠的剛度缺乏敏感性，表明細(xì)胞應(yīng)力松弛對(duì)ECM中的力學(xué)性能具有重要意義[141]。這些見解可能有助于血管生物墨水的設(shè)計(jì)，以改善細(xì)胞行為和血管功能。

4. 小口徑血管生物打印的研究進(jìn)展

小口徑血管包括小動(dòng)脈和小靜脈。小動(dòng)脈腔調(diào)節(jié)毛細(xì)血管中的血流，小靜脈是從毛細(xì)血管接收血液的最小靜脈，在血液和組織之間的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換中起著重要作用[4]。通常很難用人工方法構(gòu)建小口徑血管。然而，利用生物打印技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，可以獲得更復(fù)雜的和生理相關(guān)的小口徑血管結(jié)構(gòu)[46,142]。

4.1. 擠出生物打印

擠出生物打印是一種經(jīng)濟(jì)高效且常用的生物打印方法，該方法以一種逐層同步打印頭空間運(yùn)動(dòng)的方式從打印頭分配生物墨水[47,143,144]。擠出生物打印機(jī)通過打印頭以氣動(dòng)或機(jī)械方式連續(xù)分配生物墨水，可與多種高黏度生物墨水兼容[145]。海藻酸已廣泛用于血管組織結(jié)構(gòu)的擠出生物打印。例如，海藻酸可以與中心同時(shí)打印的氯化鈣（CaCl2）溶液物理交聯(lián)，以確保生物打印空心結(jié)構(gòu)的保真度[89,146]。采用外層針（ID = 540 μm）和內(nèi)層針（ID = 250 μm）制備同軸打印頭，利用該打印頭，將海藻酸鈉溶液（濃度分別為3%、4%和5%）包封的原代人臍靜脈平滑肌細(xì)胞（human umbilical vein SMC, HUVSMC）生物打印成可灌注血管[147]。利用海藻酸鈉溶液（濃度為5%）打印的血管的管腔平均直徑分別為（1449 ± 27）μm和（990 ± 16）μm。同樣，采用同軸打印頭輔助擠出生物打印方法，利用包封在海藻酸鈉（濃度為2%～5%）和CaCl2（濃度為2%～5%）溶液的L929小鼠成纖維細(xì)胞，可實(shí)現(xiàn)直徑均勻、機(jī)械強(qiáng)度高、結(jié)構(gòu)完整性好的中空海藻酸鈣纖維的3D生物打印[148]。同軸打印頭由外層針（ID = 1600 μm）和三個(gè)不同內(nèi)層針（ID分別為510 μm、410 μm、330 μm）組成。生物打印空心血管的大小取決于內(nèi)層針的大小以及海藻酸鈉和CaCl2的流速和濃度。當(dāng)使用海藻酸鈉溶液（流速為1 mL·min?1、濃度為2%）和CaCl2（流速為2 mL·min?1、濃度為4%）時(shí)，生物打印海藻酸鈉空心血管的平均ID和外徑（outer diameter, OD）分別為892 μm和1192 μm。

在另一項(xiàng)研究中，使用帶有同心針的多層同軸打印頭與包封人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein EC, HUVEC）和人間充質(zhì)干細(xì)胞（human MSC, hMSC）的生物墨水來制造可閱讀的血管組織結(jié)構(gòu)[110]。該研究中的生物墨水由海藻酸鈉（濃度為2%或3%）、PEGTA（濃度為2%或3%）和GelMA（濃度為5%或7%）預(yù)聚物溶液組成。PEGTA的加入增強(qiáng)了生物打印血管組織結(jié)構(gòu)的力學(xué)性能。根據(jù)所使用的內(nèi)層針（ID = 0.159～0.210 mm）和外層針（ID = 0.153～0.838 mm）的大小，優(yōu)化混合生物墨水（濃度為3%的海藻酸、2%的PEGTA和7%的GelMA），生物打印不同尺寸的空心管。生物打印空心管的平均OD為500～1500 μm、ID為400～1000 μm、壁厚為60～280 μm。混合的生物墨水經(jīng)證明可支持生物打印的血管結(jié)構(gòu)中包封的HUVEC和hMSC的擴(kuò)散和增殖，從而形成生理相關(guān)的血管組織結(jié)構(gòu)[圖3（a）] [110]。最近，利用多通道同軸擠出系統(tǒng)可進(jìn)一步制備多層中空血管組織。該系統(tǒng)由同軸打印頭（由三個(gè)同心針組成的芯部針，ID = 0.210 mm）、中層針（ID= 0686 mm）和外層針（ID = 1.600 mm）組成；生物墨水由GelMA（濃度為5%或7%）、海藻酸鈉（濃度為2%或3%）和PEGOA（濃度為1%或2%）組成；HUVEC打印在中間層；平滑肌細(xì)胞打印在外層[117]。當(dāng)使用具有最佳打印性能的混合生物墨水（7%的GelMA、2%的海藻酸鈉和2%的PEGOA）時(shí)，測(cè)量?jī)?nèi)腔的平均直徑為（663 ± 52）μm、外腔為（977 ± 63）μm、內(nèi)外壁厚度分別為（62 ± 10）μm和（94 ± 10）μm [圖3（b）] [116]。生物打印的血管組織表現(xiàn)出不同層次和不同表型的細(xì)胞異質(zhì)性，表明血管樣組織的形成。

圖3.（a）小口徑血管的同軸生物打?。海↖）多層同軸打印頭和各種空心血管制造示意圖；（II）血管床的生物打印工藝和制作示意圖；（III）示意圖和熒光顯微照片顯示不同直徑的生物打印血管；（IV）注射紅色熒光微球前后的生物打印血管的熒光照片；（V）血管管狀結(jié)構(gòu)的共聚焦圖像顯示，在培養(yǎng)14 d（上排）和21 d（下排）后，MSC表達(dá)平滑肌α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA），HUVEC表達(dá)分化簇31（CD31）。細(xì)胞核用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。經(jīng)Elsevier許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[110]，?2016。（b）多層空心血管生物打印用多通道同軸擠出系統(tǒng)示意圖（I）；雙層空心血管（上排）的代表性熒光顯微照片以及單層和雙層空心血管的橫截面圖（下排）（II）；第4天，由用綠色熒光標(biāo)記的人膀胱內(nèi)上皮細(xì)胞和用紅色熒光標(biāo)記的人膀胱外平滑肌細(xì)胞組成的生物打印血管的熒光顯微照片（III）；（IV）免疫染色血管的共聚焦顯微照片，其中內(nèi)皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)CD31（綠色），平滑肌細(xì)胞表達(dá)α-SMA（紅色）。經(jīng)Wiley許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[116]，?2018。

在最近的一項(xiàng)研究中，研究人員利用三層同軸打印頭（ID分別為2.159 mm、2.906 mm、3.810 mm），通過擠出生物打印技術(shù)制備了包含內(nèi)皮細(xì)胞層和肌肉細(xì)胞層的小口徑血管結(jié)構(gòu)，其中將包封在來源于血管組織的ECM（vascular tissue-derived ECM, VdECM，濃度為3%）/ 海藻酸（濃度為2%）水凝膠中的HUVEC和人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human aortic SMC, HAoSMC）作為生物墨水[149]。所得到的血管ID約為2 mm，由一層薄的HUVEC層（約50 μm厚）組成，外面包封一層較厚的平滑肌細(xì)胞層（800～1000 μm厚）。將血管植入大鼠腹主動(dòng)脈21 d。血管移植物可重塑平滑肌層并與宿主組織融合，而且其血管通暢、內(nèi)皮完整。類似地，使用3D打印的微流控共擠裝置，可制備內(nèi)徑分別為（265 ± 11）μm、（360 ± 11）μm、（448 ± 12）μm的長(zhǎng)期可灌注海藻酸鈣血管，隨后將共包封在基質(zhì)凝膠（體積分?jǐn)?shù)為35%）中的HUVEC和血管平滑肌細(xì)胞接種在海藻酸鈣血管上[150]。所得到的血管具有正確的管腔結(jié)構(gòu)，且具有內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)層和平滑肌細(xì)胞的外鞘。這些血管表現(xiàn)出血管的功能特性，包括靜止性、可灌注性和對(duì)血管收縮劑的收縮性。另一項(xiàng)研究展示了同軸擠出打印小口徑血管，其中人冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human coronary artery SMC, HCASMC）被包封在兒茶酚功能化的GelMA（GelMA/C，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%）生物墨水中[151]。含有HCASMC的GelMA/C生物墨水通過較大的外層針（直徑為840 μm）擠出，而Pluronic F127（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%）和高碘酸鈉（23.4 nmol·L-1）中的HUVEC通過較小的內(nèi)層針（直徑為406 μm）擠出。根據(jù)使用的同軸打印頭，生物打印血管的ID為500～1500 μm，壁厚為100～300 μm。將生物打印的血管進(jìn)一步植入非肥胖型糖尿病嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency, NOD-SCID）白細(xì)胞介素-2（interleukin-2, IL-2）受體γ-null（NSG）的小鼠體內(nèi)，結(jié)果表明其在體內(nèi)可自主整合和形成功能性血管。

4.2. 噴墨生物打印

噴墨生物打印是一種將生物墨水液滴沉積在基板上預(yù)定位置的制造方法。液滴的形成可能是由熱力或壓電力引起的[48,152]。以海藻酸為基礎(chǔ)的3D管狀組織結(jié)構(gòu)是隨著海藻酸小珠在CaCl2溶液中的快速凝膠化而形成的，并最終形成微凝膠液滴作為構(gòu)建塊[153]。具體來說，海藻酸鈉溶液（濃度為0.8%）通過噴墨打印頭噴射到CaCl2溶液（濃度為2%）中，形成直徑約為40 μm的圓形微凝膠珠。海藻酸管（直徑為200 μm）是通過移動(dòng)噴墨打印頭形成圓形結(jié)構(gòu)來制造的，其中海藻酸凝膠的液滴被生物打印在CaCl2溶液中。

將以海藻酸鈉（濃度為1%）包封的NIH/3T3成纖維細(xì)胞用作生物墨水，采用3D噴墨生物打印系統(tǒng)，通過逐層沉積的方式成功制備直徑約3 mm的具有懸垂結(jié)構(gòu)的3D直線形和鋸齒形管狀結(jié)構(gòu)[154]。生物墨水液滴通過壓電打印頭（ID = 120 μm）噴到CaCl2（濃度為2%）溶液中，形成凝膠細(xì)胞海藻酸鈣層。該制備方法有可能被應(yīng)用于具有復(fù)雜幾何形狀和結(jié)構(gòu)的血管的生物打印。類似地，通過基于液體支撐的噴墨生物打印方法可生成具有分叉的血管樣結(jié)構(gòu)。使用壓電噴墨打印頭（ID = 120 μm）噴射生物墨水液滴，該液滴由海藻酸鈉溶液（濃度為1%）和NIH/3T3成纖維細(xì)胞組成，交聯(lián)劑為CaCl2溶液（濃度為2%）。以水平方式[圖4（a-I）、（a-II）、（b-I）和（b-II）]或垂直方式[圖4（a-III）、（a-IV）、（b-III）和（b-IV）]在CaCl2溶液（濃度為2%）中對(duì)血管結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物打印。分叉結(jié)構(gòu)的血管的平均直徑為3 mm，壁厚約為1 mm [35]。在另一個(gè)實(shí)例中，將凝血酶（50 U·mL-1）和CaCl2（80 mmol·L-1）的生物墨水與人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular EC, HMVEC）混合，并沉積到纖維蛋白原基質(zhì)（60 mg·mL-1，所謂的“生物紙”）中，形成直徑小于100 μm的纖維蛋白通道，以模擬微血管結(jié)構(gòu)。生物打印的細(xì)胞排列在纖維蛋白通道內(nèi)并可增殖，而且生物打印微血管的通道結(jié)構(gòu)在21 d內(nèi)都能保持穩(wěn)定[155]。

4.3. 光輔助生物打印和光固化生物打印

激光輔助生物打印是一種無打印頭的生物打印方法，該方法利用激光脈沖將生物墨水從供體載玻片沉積到接收器上[156]。一項(xiàng)研究證明了激光輔助生物打印技術(shù)在利用含有小鼠成纖維細(xì)胞的海藻酸（濃度為8%或2%）作為生物墨水制造直線形和Y形管狀結(jié)構(gòu)方面的潛力。當(dāng)采用優(yōu)化參數(shù)（激光注量：1445 mJ·cm?2；重復(fù)頻率：10 Hz；基質(zhì)速度：80 mm·min?1；向下運(yùn)動(dòng)步長(zhǎng)：25 μm）時(shí)，構(gòu)建單元平均直徑為5 mm [38]。利用激光輔助生物打印技術(shù)，采用HUVEC和HUVSMC構(gòu)建了可模擬天然組織血管網(wǎng)絡(luò)的簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)。當(dāng)每個(gè)激光脈沖的能量為0.5～1.5 μJ時(shí)，直徑約為50 μm的生物打印液滴按照50～150 μm的間距進(jìn)行沉積[157]。

圖4. 小口徑血管的噴墨生物打印。（a）圖示為水平（I、II）和垂直（III、IV）分叉管狀結(jié)構(gòu)的噴墨生物打印，其中有/無細(xì)胞的海藻酸鈉液滴（濃度1%），沉積在平臺(tái)上，然后與CaCl2溶液交聯(lián)；（b）水平打印產(chǎn)生的海藻酸分叉管的頂視圖（I）和全局視圖（II），以及垂直打印產(chǎn)生的海藻酸分叉管的正視圖（III）和全局視圖（IV）。經(jīng)Wiley許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[35]，?2015。

基于動(dòng)態(tài)數(shù)字微鏡器件（DMD）的光固化生物打印是另一種高分辨率制作方法[158]。這項(xiàng)技術(shù)使得制造具有微米級(jí)分辨率的高度復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)成為可能。利用水凝膠包封相關(guān)細(xì)胞，制備具有嵌入式血管系統(tǒng)的體積組織結(jié)構(gòu)[159]。例如，采用基于DMD的立體光刻生物打印方法制造3D血管化肝臟模型，其中肝小葉由包封在GelMA（濃度為5%）中的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cell, hiPSC）誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝細(xì)胞獲得，隨后，使用HUVEC和包封在甲基丙烯酸縮水甘油酯透明質(zhì)酸（濃度為1%）和GelMA（濃度為2.5%）中的脂肪源性干細(xì)胞來構(gòu)建血管系統(tǒng)[46]。這些3D生物打印的肝臟結(jié)構(gòu)，尺寸為3 mm × 3 mm，厚度約為200 μm，由六角排列的hiPSC誘導(dǎo)的肝細(xì)胞小葉及其周圍的HUVEC層和脂肪衍生的干細(xì)胞組成。這種血管化肝臟模型為病理生理學(xué)和藥物篩選研究提供了一個(gè)平臺(tái)[46]。在另一項(xiàng)研究中，采用同樣的方法建立了預(yù)血管化組織結(jié)構(gòu)；使用三個(gè)數(shù)字掩模來制造帶圖案的組織結(jié)構(gòu)，以均勻的（圖5）[43]或梯度血管通道形成血管網(wǎng)絡(luò)[142]。血管通道的大小為50～250 μm。血管化組織的基底層由六邊形區(qū)域組成，六邊形區(qū)域由包封在GelMA（濃度為5%）中的HepG2細(xì)胞，通過具有六邊形圖案的數(shù)字掩模制成。血管通道區(qū)域由包封在水凝膠（濃度為2.5% GelMA+濃度為1%的甲基丙烯酸縮水甘油酯透明質(zhì)酸）中的HUVEC和10T1/2小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，使用血管通道掩膜制成。最后，使用平板掩模在血管網(wǎng)絡(luò)的頂部覆蓋GelMA（濃度為5%），生成大小為4 mm × 5 mm的血管化組織結(jié)構(gòu)，厚度為600 μm。生物打印組織中的HUVEC在體外構(gòu)建自發(fā)形成的管腔樣結(jié)構(gòu)。此外，將生物打印的預(yù)血管化和非預(yù)血管化（無細(xì)胞）組織植入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠背部皮膚下14 d，并證明預(yù)血管化組織結(jié)構(gòu)可內(nèi)皮化[142]。

4.4. 其他生物打印策略

除了上述用于制造血管結(jié)構(gòu)的生物打印方法外，犧牲生物打印是一種經(jīng)典的間接（生物）打印方法。血管化組織的犧牲生物打印，利用在生物打印完成后、通常通過物理提取或溫度改變?nèi)コ囊兹艿纳锬?，留下可灌注通道[62]。使用瓊脂糖作為犧牲模板，通過擠出生物打印方法，將圓柱形瓊脂糖纖維生物打印在含有細(xì)胞的GelMA水凝膠中[88,160]。然后去除瓊脂糖纖維，在GelMA內(nèi)形成可灌注血管。這些血管的ID為800 μm～2 mm，壁厚為50～100 μm。這些可灌注血管可增加黏稠水凝膠的質(zhì)量運(yùn)輸能力，并支持單層內(nèi)皮細(xì)胞的形成。使用Pluronic F127，在GelMA水凝膠中使用類似的生物打印方法生成空心血管。將HUVEC灌流至中空通道形成單層內(nèi)皮細(xì)胞層[161]。

圖5. 基于光固化的微血管化組織生物打印。（a）顯示預(yù)血管化組織結(jié)構(gòu)制作的示意圖；（b）熒光顯微照片顯示生物打印組織結(jié)構(gòu)，包括通道中的HUVEC（紅色）和周圍水凝膠基質(zhì)中的HepG2細(xì)胞（綠色）；（c）3D共聚焦重建顯微照片顯示微通道中的內(nèi)皮細(xì)胞，用紅色熒光標(biāo)記，并用綠色對(duì)CD31進(jìn)行染色。經(jīng)Elsevier許可，轉(zhuǎn)載自參考文獻(xiàn)[43]，?2013。

另外，采用碳水化合物玻璃配方（50 mL反滲透水與25 g葡萄糖、53 g蔗糖、10g葡聚糖混合），利用鋼制打印頭（ID = 1.2 mm或0.84 mm），在110 ℃下打印開放互聯(lián)的犧牲碳水化合物玻璃晶格[162]。在50 ℃下玻璃化后，將打印的碳水化合物玻璃晶格浸入聚（d-丙交酯-共-乙交酯）溶液中作用5 min，可防止糖類溶解引起的包膜細(xì)胞滲透性損傷。負(fù)載各種細(xì)胞的水凝膠，包括負(fù)載人胚腎（HEK）293細(xì)胞的PEG水凝膠[包含PEG-二丙烯酸酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%、10%或20%）、1 mmol·L?1丙烯酸酯-PEG-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-絲氨酸（RGDS）和Irgacure 2959（濃度為0.05%）]、負(fù)載10T1/2細(xì)胞的纖維蛋白凝膠（10 mg·mL?1，包含纖維蛋白原和凝血酶）、負(fù)載10T1/2細(xì)胞的海藻酸凝膠（濃度為2%）、負(fù)載原代大鼠肝細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞的瓊脂糖凝膠（濃度為2%）以及負(fù)載10T1/2細(xì)胞的基質(zhì)凝膠，用于包封3D打印玻璃晶格。ECM交聯(lián)后，將整個(gè)結(jié)構(gòu)浸入介質(zhì)中，除去犧牲的碳水化合物玻璃，留下ECM水凝膠內(nèi)的開放通道。這些血管通道中排列著HUVEC，在高壓脈沖流下向其灌注血液。結(jié)果表明，在3D生物打印組織中，這些血管通道能夠支持原代大鼠肝細(xì)胞的代謝功能。按照相同的方法，使用100 g異麥芽和10 g右旋糖酐，通過鋼制打印頭（ID = 0.84 mm），在60 mL反滲透水中打印犧牲碳水化合物玻璃纖維絲，并將其包封在纖維蛋白凝膠（10 mg·mL?1）中[163]。用磷酸鹽緩沖鹽水沖洗，然后將HUVEC注射到中空通道中，去除犧牲的碳水化合物纖維。將這些3D生物打印的血管化組織植入小鼠后肢缺血模型中，顯示出增強(qiáng)的血管生成和工程血管與宿主血管系統(tǒng)的整合，最終實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端缺血組織的灌注。同樣，當(dāng)將這些生物打印的血管化組織應(yīng)用于心肌梗死的小鼠模型時(shí)，其被證明能挽救部分心臟功能，而且射血分?jǐn)?shù)和心輸出量與健康對(duì)照組的相似。

在另一項(xiàng)研究中，研究人員使用明膠（濃度為10%）作為犧牲材料，在3D I型膠原基質(zhì)（3 mg·mL-1）內(nèi)構(gòu)建兩個(gè)流體血管通道；先在流動(dòng)腔上生物打印膠原前體，然后再生物打印兩種明膠纖維[164]。將HUVEC和正常人肺成纖維細(xì)胞包封在兩個(gè)明膠纖維之間的纖維蛋白凝膠中，打印后，在其頂部生物打印出幾層膠原覆蓋整個(gè)結(jié)構(gòu)。去除犧牲的明膠，將HUVEC注射到通道中，然后讓通道與培養(yǎng)基一起流動(dòng)。這項(xiàng)研究表明，通過將HUVEC和成纖維細(xì)胞包封在兩條血管通道之間的纖維蛋白凝膠中，可以形成微血管網(wǎng)絡(luò)。

最近有研究報(bào)道了使用一個(gè)有三個(gè)打印頭的生物打印機(jī)，通過按需噴射式生物打印方法構(gòu)建血管結(jié)構(gòu)[10,11]。明膠（濃度為5%）或含有HUVEC的明膠（濃度為3%）作為犧牲打印的中間核心，用直徑為150 μm的打印頭進(jìn)行打印。另外兩個(gè)直徑為0.3 mm的打印頭用于制作肌肉層，其中一個(gè)打印頭打印含有凝血酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶和氯化鈣的交聯(lián)劑溶液液滴，而另一個(gè)打印頭打印纖維蛋白原（濃度為2.5%）-人臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞懸浮液滴。最后，在生物打印過程完成后，通過將纖維蛋白原（濃度為1.25%）-膠原（體積分?jǐn)?shù)為0.18%）混合物包封在肌肉層周圍形成血管外層。因此，產(chǎn)生的可灌注血管通道，直徑為1 mm，壁厚為425 μm，包含內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞層、成纖維細(xì)胞和周圍的ECM。

5. 未來展望

生物打印技術(shù)的進(jìn)步促進(jìn)了生物工程化制備可灌注血管結(jié)構(gòu)以及不同形狀、大小和功能的血管化組織結(jié)構(gòu)（表3）[110,116,148-151,153]。然而，大多數(shù)生物打印血管組織仍然缺乏天然血管的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分、力學(xué)性能、生理特性。每種生物打印方式都有其優(yōu)缺點(diǎn)。理想的打印模式應(yīng)最大程度地提高其分辨率和生物打印速度等能力，并具有能廣泛運(yùn)用于優(yōu)化血管生成潛能的生物墨水。此外，以往的研究多是以HUVEC為模型細(xì)胞類型。然而，為了實(shí)現(xiàn)臨床相關(guān)血管組織的形成，生物打印血管應(yīng)該能夠通過相關(guān)細(xì)胞來源進(jìn)行重塑和功能轉(zhuǎn)變。因此，進(jìn)一步探索改進(jìn)的生物打印工藝，開發(fā)先進(jìn)的生物墨水，用于制備具有適當(dāng)?shù)牧W(xué)行為和良好生物學(xué)性能的功能性小口徑血管移植物以及血管化的組織移植物。其中一些生物學(xué)性能可以通過加入灌注生物反應(yīng)器等動(dòng)態(tài)培養(yǎng)條件進(jìn)一步提高，以促進(jìn)成熟。最后，對(duì)血管生物學(xué)的持續(xù)了解，如不同血管層，包括內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和周圍支持細(xì)胞以及ECM之間的相互作用，將為改進(jìn)生物工程設(shè)計(jì)提供更好的見解。

表3 生物打印小口徑血管的代表性參數(shù)和特性

Acknowledgements

This work was supported by funding from the US National Institutes of Health (R00CA201603, R21EB025270, R21EB026175, and R01EB028143) and the Brigham Research Institute.

Compliance with ethics guidelines

Xia Cao, Sushila Maharjan, Ramla Ashfaq, Jane Shin, and Yu Shrike Zhang declare that they have no conflict of interest or financial conflicts to disclose.