植物類黃酮化合物生物合成調(diào)控研究進(jìn)展

趙 瑩，楊欣宇，趙曉丹，鐘 以

（北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京 100048）

類黃酮化合物是參與植物發(fā)育和防御的次生代謝產(chǎn)物，因其具有抗氧化、清除自由基、抑菌等多種功能而受到廣泛關(guān)注，對(duì)人類健康有重要意義[1]。類黃酮具有結(jié)構(gòu)和特征多樣性，其化合物基本骨架為C6-C3-C6，兩個(gè)苯環(huán)通過三個(gè)碳原子結(jié)合而成，如圖1[2]，根據(jù)分子結(jié)構(gòu)可分為6 大類，包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類、異類黃酮類、黃烷醇類、花色素類[3]等。類黃酮化合物普遍存在于植物體內(nèi)的生物合成途徑當(dāng)中，并產(chǎn)生及其豐富的次生代謝產(chǎn)物[4]，是次生代謝產(chǎn)物中最大的類群之一，是植物色素的主要來源，在植物的各個(gè)部位都有積累。發(fā)育階段的早晚和環(huán)境溫度、濕度的強(qiáng)弱對(duì)類黃酮在植物中積累的影響有所不同，它是果蔬氣味、顏色的重要組成部分。此外，類黃酮化合物還有助于提高植物產(chǎn)品的農(nóng)藝、工業(yè)和營養(yǎng)價(jià)值。它會(huì)影響種子和果實(shí)的品質(zhì)、植物產(chǎn)品的澀味和食品的保健價(jià)值[5]。目前，關(guān)于類黃酮的研究主要集中在提取、純化、結(jié)構(gòu)鑒定、生理功能等方面，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的人開始注重一些外界因素例如輻射、氮素、溫度、酶基因等對(duì)于類黃酮化合物合成代謝途徑的調(diào)控方面的研究，以期為食品營養(yǎng)以及功能食品和天然產(chǎn)物的開發(fā)提供參考[4]。

圖1 類黃酮的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of flavonoids

1 植物類黃酮化合物合成代謝途徑

類黃酮是多酚類中最大的一類化合物，植物類黃酮合成的起始底物是來自苯丙烷代謝途徑的香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A，如圖2 所示[2,6]。首先苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下生成肉桂酸，肉桂酸在肉桂酸4-羥化酶（C4H）的作用下進(jìn)一步發(fā)生羥基化反應(yīng)，轉(zhuǎn)化成香豆酸，然后在4-香豆酸輔酶A 連接酶（4CL）的催化下形成香豆酰輔酶A，香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A（來自乙酰輔酶A）為前體，二者在查耳酮合成酶（CHS）（此酶催化生成所有類黃酮的查耳酮骨架）的催化下生成查耳酮，接著在查耳酮異構(gòu)酶（CHI）的異構(gòu)化作用下生成無色柚皮素，柚皮素作為主要的代謝產(chǎn)物進(jìn)入其他類黃酮的合成途徑。由于類黃酮化合物的合成途徑在植物中是保守的，所以由于外界因素的不同，許多酶會(huì)改變類黃酮的基本骨架，從而生成不同種類的類黃酮化合物[3,7]。

圖2 植物類黃酮生物合成途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of plant flavonoids

2 植物類黃酮化合物合成代謝途徑的調(diào)控

2.1 外界因素對(duì)類黃酮化合物合成的調(diào)控

外界環(huán)境因素對(duì)植物次生代謝起著重要的調(diào)控作用，可以引起次生代謝物含量的顯著性改變，這些外界因素包括光照、溫度、水分、輻射、激素、礦物質(zhì)等。下面對(duì)上述因素進(jìn)行綜述，以期為植物類黃酮的調(diào)控提供參考[8]。

2.1.1 光照 光對(duì)類黃酮合成的影響體現(xiàn)在光照強(qiáng)度、光照時(shí)間和光質(zhì)等方面，主要通過影響相關(guān)酶和基因的活性，從而提高類黃酮的積累量[9]。ZORATTI等[10]對(duì)野越桔和高叢藍(lán)莓的花青素組成進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)季節(jié)、溫度和光照可以通過影響類黃酮3',5'羥化酶（F3′5′H）基因來影響受測(cè)野越桔的花青素含量。ALBERT 等[11]發(fā)現(xiàn)大多數(shù)植物花色苷的積累與光照強(qiáng)度成正相關(guān)，光照強(qiáng)度越強(qiáng)，越容易誘導(dǎo)花色苷合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，矮牽?；ㄉ刂挥性诟吖庹障律L(zhǎng)才會(huì)出現(xiàn)強(qiáng)烈的著色現(xiàn)象，說明存在一種光誘導(dǎo)調(diào)控因子，負(fù)責(zé)激活花青素途徑。鑒于Lc（一種來自玉米的bHLH 調(diào)節(jié)因子）和An11（一種WD40 的調(diào)節(jié)因子）均在矮牽牛中組成性表達(dá)，且MYB 花青素調(diào)節(jié)劑Rosea1 能夠調(diào)節(jié)光照下矮牽?；ㄉ氐暮铣?，推測(cè)內(nèi)源性調(diào)控因子可能是MYB 蛋白[12]。GUAN 等[13]指出在葡萄中遮光處理可以改變花色苷合成和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的表達(dá)從而降低其含量，恢復(fù)光照后花色苷迅速積累，表明光照對(duì)葡萄花色苷的積累起正調(diào)控作用。這些調(diào)節(jié)與花青素生物合成途徑的結(jié)構(gòu)、調(diào)控基因表達(dá)的改變以及花青素轉(zhuǎn)運(yùn)基因的變化有關(guān)。XU 等[14]通過對(duì)銀杏的不同處理，發(fā)現(xiàn)不同的光照強(qiáng)度對(duì)銀杏幼苗生物量的積累有顯著影響，100%光照對(duì)銀杏葉類黃酮的生物合成和積累起促進(jìn)作用，PAL、CHS、F3H（黃酮-3-羥化酶）、FLS（黃酮醇合成酶）各種酶表達(dá)量也非常高，基因表達(dá)水平與類黃酮醇含量呈顯著正相關(guān)。AZUMA 等[15]利用離體葡萄漿果進(jìn)行了體外環(huán)境實(shí)驗(yàn)，研究了溫度和光照條件對(duì)類黃酮（花青素和黃酮醇）合成及相關(guān)基因表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)低溫（15 ℃）加光照處理下，葡萄果皮花青素積累量充足，而高溫（35 ℃）或暗處理嚴(yán)重抑制花青素積累，驗(yàn)證了低溫對(duì)花青素的積累起正調(diào)控作用，另外還發(fā)現(xiàn)許多類黃酮生物合成相關(guān)基因在低溫和光照下均獨(dú)立上調(diào)，說明低溫和光對(duì)類黃酮合成途徑內(nèi)基因的表達(dá)具有協(xié)同作用。

2.1.2 溫度 次生代謝物的形成和積累與溫度密切相關(guān)，高溫和低溫都會(huì)影響植物次生代謝產(chǎn)物酶的活性，低溫更有利于植物類黃酮的生成[4]。KIM 等[16]發(fā)現(xiàn)高溫通過E3 泛素連接酶COP1 和擬南芥花青素生物合成的正調(diào)控因子（HY5）抑制了擬南芥花青素生物合成，HY5 是花青素合成的正調(diào)控因子，但高溫條件下誘導(dǎo)了它的降解，從而抑制了MYBL2 基因的表達(dá)，因此引起高溫對(duì)花青素生物合成的抑制。環(huán)境溫度的升高降低了擬南芥花青素生物合成途徑早期和晚期所需基因的表達(dá)，于是他認(rèn)為高環(huán)境溫度通過COP1-HY5 信號(hào)模塊抑制花青素的合成，低溫更有利于類黃酮化合物的合成。WANG 等[17]的研究成果也支持了該觀點(diǎn)，通過研究溫度對(duì)銀杏葉黃酮量的影響，發(fā)現(xiàn)溫度對(duì)類黃酮化合物含量、C4H 和4CL 的活性及可溶性糖含量的影響很大，在較低溫度和土壤水分條件下，可溶性糖和酶活性（PAL、C4H 和4CL）的增加正向促進(jìn)類黃酮的積累。同時(shí)BROSSA 等[18]研究了圣櫟在夏季和冬季時(shí)的類黃酮含量，建立了測(cè)定圣櫟葉中黃酮類化合物含量和相對(duì)豐度的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法，發(fā)現(xiàn)冬季圣櫟中的類黃酮成分顯著高于夏季，表明低溫更有助于類黃酮化合物的生成與積累，也得出了與前者相同的結(jié)論。YU 等[19]為探討光照和溫度對(duì)獼猴桃花青素積累的影響，在36 個(gè)與花青素相關(guān)的AccR2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子中，AcMYB10 在紅肉獼猴桃果皮中表達(dá)量最高。AcMYB10 的表達(dá)與成熟過程中自然著色果實(shí)的花青素積累以及光/溫度誘導(dǎo)的愈傷組織著色高度相關(guān)。BHATIA 等[20]報(bào)道了低溫增強(qiáng)黃酮醇生物合成對(duì)光照的嚴(yán)格要求，通過基因敲除、過表達(dá)等研究發(fā)現(xiàn)，與野生型（WT）相比，在低溫環(huán)境下擬南芥HY5 和轉(zhuǎn)錄因子MYB11、MYB111、MYB12突變體與類黃酮生物合成相關(guān)基因的表達(dá)下降并且黃酮醇合成受到抑制，在HY5 突變體中過表達(dá)AtHY5 恢復(fù)了在低溫下黃酮醇的合成，AtMYB12 的過表達(dá)有利于低溫和光照條件下黃酮醇的積累?？傊蜏卣T導(dǎo)黃酮醇合成需要HY5 和黃酮醇特異性MYB 調(diào)控因子的幫助。WANG 等[21]發(fā)現(xiàn)參與原花青素合成的MYB 轉(zhuǎn)錄因子可分為TT2 型和PA1 型,并從紅肉蘋果中鑒定了一個(gè)PA1 型MYB 轉(zhuǎn)錄因子MdMYBPA1，通過在蘋果愈傷組織中過表達(dá)和敲除表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子的方式鑒定了其在類黃酮合成中的作用，還探索了TT2 和PA1 型MYB 轉(zhuǎn)錄因子之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MdMYB9/11/12 可以結(jié)合MdMYBPA1啟動(dòng)子。此外，MdMYBPA1 通過正向調(diào)控類黃酮的生物合成途徑過程中原花青素生成花青素的過程來響應(yīng)低溫。在結(jié)合分析中，MdbHLH33 直接結(jié)合MdMYBPA1 啟動(dòng)子的低溫響應(yīng)（LTR）順式元件并促進(jìn)其表達(dá)。此外，表達(dá)MdMYBPA1 和MdbHLH33的愈傷組織在低溫下形成復(fù)合物，誘導(dǎo)產(chǎn)生更多花青素。常麗等[22]研究發(fā)現(xiàn)低溫能增強(qiáng)C4H 酶的活性，同一土壤含水量條件下，低溫環(huán)境比高溫條件下更加促進(jìn)了槲皮素、山柰酚、異鼠李素的合成，表明低溫（15 ℃）更有利于銀杏葉類黃酮化合物的生成和積累，而高溫（35 ℃）對(duì)銀杏葉類黃酮化合物的生成起到抑制作用。

2.1.3 水分 水分作為構(gòu)成植物的必要成分，是其賴以生存的必不可少的因子之一。大部分研究表明，適度干旱、土壤含水量偏低反而會(huì)促進(jìn)植物類黃酮化合物的合成。類黃酮的抗氧化性在植物抗旱脅迫適應(yīng)中發(fā)揮了重要作用，已經(jīng)有許多研究表明干旱脅迫過程中植物體內(nèi)類黃酮成分含量顯著增加，適度的水分干旱有利于類黃酮化合物的積累[4,23]。CUI 等[24]采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定葡萄花青素的種類和含量，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRTPCR）分析花青素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)，通過提高基因UFGT（類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶）和MYBA1 的表達(dá)水平，研究了干旱脅迫和病毒GLRaV3侵染對(duì)花青素積累的影響，通過方差分析和相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)GLRaV3 侵染是增加花青素積累的決定因素,而干旱脅迫可以進(jìn)一步增強(qiáng)感染GLRaV3 的葡萄葉片中花青素的積累。LI 等[25]研究發(fā)現(xiàn)UGT79B2和UGT79B3 的過表達(dá)顯著增強(qiáng)了植物對(duì)低溫和干旱、鹽脅迫的耐受性，而RNAi（RNA 干擾）和CRISPRCas9 產(chǎn)生的UGT79B2/B3 雙突變體更容易受到不利條件的影響。另外還鑒定了UGT79B2/B3 在添加原花青素UDP-鼠李糖苷和3-O-葡萄糖苷時(shí)的酶活性，UGT79B2/B3 的過表達(dá)顯著增加了花青素的積累，增強(qiáng)了抗氧化活性，而UGT79B2/B3 雙突變體花青素水平降低。當(dāng)UGT79B2/B3 在不能合成花青素的突變體tt18 上過度表達(dá)時(shí)，這兩個(gè)基因都不能提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)能力，表明UGT79B2 和UGT79B3 通過調(diào)節(jié)花青素的積累賦予非生物脅迫耐性。謝岳等[26]對(duì)葡萄施以不同程度的水分脅迫，通過HPLC 測(cè)定葡萄果皮中花色苷含量以及結(jié)合qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)適度的水分脅迫上調(diào)花色苷合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因PAL、CHS1、DFR（二氫黃酮醇還原酶基因）、F3′H、F3′5′H、UFGT 和轉(zhuǎn)錄因子MYBA1的表達(dá)，從而提高類黃酮化合物的積累，而過度的干旱則會(huì)抑制其含量的積累，這一結(jié)論也驗(yàn)證了適度的水分對(duì)類黃酮物質(zhì)的合成起到正向調(diào)控作用。

2.1.4 UV 輻射 類黃酮化合物的生物合成和積累在植物發(fā)育和環(huán)境中受到控制，UV-B 輻射是一種類黃酮合成的外界調(diào)控因素。適當(dāng)劑量的UV-B 輻射作為啟動(dòng)子對(duì)類黃酮化合物的積累是很重要的，高劑量反而會(huì)抑制類黃酮化合物的合成[7]。莫運(yùn)才等[27]為探討環(huán)境中太陽紫外線（UV-B）輻射對(duì)鐵皮石斛幼苗生理代謝的影響，對(duì)鐵皮石斛分別進(jìn)行5.1 μW/cm2和15.6 μW/cm2強(qiáng)度的UV-B 輻射實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UV-B 輻射處理期間，5.1 μW/cm2輻射的類胡蘿卜素含量、類黃酮含量和 PAL 酶活性均高于對(duì)照組（未經(jīng)輻射處理）；而15.6 μW/cm2的UV-B 輻射的類胡蘿卜素含量、類黃酮含量和PAL 酶活性在第8 d達(dá)最大值后迅速降低，表明高強(qiáng)度UV-B 輻射下鐵皮石斛可以合成較多的類黃酮，UV-B 輻射的增強(qiáng)誘導(dǎo)苯丙氨酸解氨酶活性增強(qiáng)，苯丙氨酸解氨酶作為植物類黃酮合成代謝的起始酶，促進(jìn)了類黃酮的合成。HENRY-KIRK 等[28]為了了解紫外線對(duì)類黃酮化合物合成的影響，將蘋果在光譜濾光器下生長(zhǎng)，濾光器可以改變太陽紫外線的透射率。果實(shí)分析表明，在一個(gè)季節(jié)的發(fā)育過程中，紫外線誘導(dǎo)了生理、代謝和基因表達(dá)水平的變化?；ㄇ嗨卣{(diào)節(jié)因子MYB10 激活MYB22 的啟動(dòng)子，MYB22 的存在增強(qiáng)了HY5 激活FLS 啟動(dòng)子的過程，從而誘導(dǎo)類黃酮化合物的生成，而降低紫外照射的強(qiáng)度會(huì)下調(diào)FLS、HY5、MYB10 和MYB22 這些調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄水平，從而降低花青素和黃酮醇的積累。YANG 等[29]分析了采前UV-B/-C 輻射和采后UV-A/-B/-C 輻射對(duì)藍(lán)莓發(fā)育過程中黃酮醇、原花青素和花青素的基因表達(dá)和代謝譜，發(fā)現(xiàn)采前和采后紫外光照射均顯著增加了果實(shí)發(fā)育早期黃酮醇積累量和果實(shí)發(fā)育后期花青素和原花青素含量，基因表達(dá)的變化與紫外照射后黃酮含量的變化平行，VcMYBPA1 轉(zhuǎn)錄因子在采前和采后紫外線照射下與VcLAR（無色花青素還原酶）和VcANR（無色花青素合成酶）密切相關(guān)，因此猜測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子可能與花青素的生物合成有關(guān)。

2.1.5 激素 類黃酮的生物合成受激素的調(diào)控，采用外源激素可用于調(diào)控植物類黃酮的生物合成[4]。近年來，關(guān)于激素調(diào)控類黃酮代謝途徑的研究已成為熱點(diǎn)。沈欣杰[30]對(duì)轉(zhuǎn)色期前櫻桃外源施用脫落酸（ABA）,使用超高效液相色譜對(duì)花色苷含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)ABA 處理相對(duì)于對(duì)照組可以顯著促進(jìn)櫻桃果實(shí)花色苷的合成，ABA 生物合成抑制劑NDGA 處理則顯著抑制了果實(shí)花色苷的合成，除了花色苷物質(zhì)積累方面，在分子水平上，ABA 處理的果實(shí)中六個(gè)花色苷合成路徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組。李棟棟[31]用不同濃度ABA 處理開花兩周后的草莓果實(shí)，并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)外源ABA 處理能增強(qiáng)PAL、TAL、4CL、DFR（二氫黃酮醇還原酶）等與草莓中類黃酮化合物合成相關(guān)的酶的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)花青素合成積累。有研究認(rèn)為MYB基因的表達(dá)是由許多植物激素誘導(dǎo)的，包括脂基激素茉莉酸酯（MeJA）。MeJA 是一種內(nèi)源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可調(diào)控類黃酮化合物等次生代謝物的合成，劉生財(cái)?shù)萚32]為了解MeJA 對(duì)莧菜細(xì)胞中類黃酮合成的影響，以莧菜懸浮細(xì)胞為材料，結(jié)合qRT-PCR 技術(shù)，檢測(cè)不同濃度MeJA 和添加時(shí)間處理對(duì)類黃酮積累的影響，結(jié)果顯示，在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的第4 d 添加200 μmol/L 時(shí)類黃酮含量達(dá)到最大；與對(duì)照（MeJA 0 μmol/L）相比，不同濃度MeJA 處理下，PAL、F3H、CHI、CHS基因表達(dá)量均極顯著上調(diào)，與類黃酮含量具有正相關(guān)性。本研究表明MeJA 濃度和添加時(shí)間對(duì)莧菜懸浮細(xì)胞中類黃酮和類胡蘿卜合成起著重要調(diào)控作用。LI 等[33]將MeJA 加入到甘草細(xì)胞懸液中，通過RNA 測(cè)序技術(shù)分析來識(shí)別差異表達(dá)的基因，結(jié)果顯示MeJA 對(duì)MYB 轉(zhuǎn)錄因子GlMYB4和GlMYB88 具有顯著的誘導(dǎo)作用，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)GlMYB4 和GlMYB88 蛋白定位于細(xì)胞核，通過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)GlMYB4 和GlMYB88 可以正向調(diào)節(jié)甘草細(xì)胞中黃酮類化合物的合成。GONZALEZ 等[34]為研究ABA 是否參與了酚類化合物的積累，特別是花青素苷的生物合成，以干旱脅迫下的智利漿果為研究對(duì)象，施用氟立酮（ABA 生物合成抑制劑），并在24、48 和72 h 的干旱脅迫條件下在幼苗和完全展開的葉片上施用ABA，收獲植株后，分別采集葉片，檢測(cè)生化狀態(tài)。觀察到，氟立酮處理顯著降低了受脅迫植物的ABA 濃度和總花青素濃度，使此濃度達(dá)到了對(duì)照組植物的水平。施用ABA 可恢復(fù)脅迫植株在48 h 內(nèi)的ABA 水平和總花青素濃度。qRT-PCR 結(jié)果顯示，經(jīng)氟立酮處理的植株葉片中，AcUFGT基因表達(dá)降低，而隨后施用ABA 則增加了AcUFGT的表達(dá)。綜上所述，ABA 參與調(diào)控干旱脅迫下花青素苷的生物合成。YANG 等[35]為了探索ABA 是否參與多酚生物合成，通過高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜，從葡萄提取物中鑒定出16 個(gè)多酚類物質(zhì)，外源褪黑激素和ABA 處理均顯著促進(jìn)了黃酮醇和黃烷醇各組分的生物合成，尤其是兒茶素在褪黑激素200 μmol/L 處理時(shí)幾乎增加了一倍，參與類黃酮生物合成的4CL、CHS、F3H、FLS（類黃酮醇合成酶）、UFGT等基因的表達(dá)也明顯上調(diào)。JIA 等[36]利用一種新建立的煙草病毒誘導(dǎo)草莓果實(shí)基因沉默技術(shù)，下調(diào)ABA 生物合成關(guān)鍵酶基因FaNCED1 的表達(dá)，導(dǎo)致草莓果實(shí)中ABA 含量顯著下降，果實(shí)著色明顯減少。另外在轉(zhuǎn)基因RNA 干擾（RNAi）果實(shí)中也觀察到類似的無色表型，病毒誘導(dǎo)的基因沉默下調(diào)了ABA 受體基因FaCHLH/ABAR的表達(dá)。更重要的是，外源ABA 可以恢復(fù)但不能逆轉(zhuǎn)基因FaCHLH下調(diào)引起的RNAi 果實(shí)的無色表型，此外還觀察到FaCHLH/ABAR基因的表達(dá)水平下調(diào)不僅改變了ABA 水平和糖含量，還改變了一組ABA 和糖響應(yīng)基因，外源糖可以顯著促進(jìn)果實(shí)成熟，同時(shí)刺激ABA 積累。這些數(shù)據(jù)表明ABA 是促進(jìn)草莓成熟的信號(hào)分子，ABA 受體FaCHLH/ABAR是草莓成熟過程中響應(yīng)ABA 的正調(diào)節(jié)因子，可以影響草莓類黃酮化合物的生物合成。

2.1.6 礦物質(zhì) 土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)植物生長(zhǎng)以及次生代謝物的合成有重要作用，鉀含量降低會(huì)導(dǎo)致C4H 和PAL 酶的表達(dá)下調(diào)，降低許多中草藥中類黃酮化合物的含量，有研究學(xué)者認(rèn)為這可能是由于缺鉀對(duì)類胡蘿卜素合成途徑的影響導(dǎo)致的[37]。LEA 等[38]通過將擬南芥種子置于不同含氮量的培養(yǎng)基上播種來研究氮對(duì)類黃酮化合物合成的影響，研究發(fā)現(xiàn)氮元素缺乏反而會(huì)增強(qiáng)MYB 及bHLH 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)最終促進(jìn)擬南芥類黃酮合成。同樣DONG 等[39]對(duì)龍井茶進(jìn)行不同水平氮處理，使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量分析以及PCR 分析顯示，正常的氮水平通過基因調(diào)控和底物碳水化合物的積累促進(jìn)了龍井茶黃酮醇糖苷的生物合成，而異常的氮尤其是過量的氮對(duì)類黃酮的合成有抑制作用。YU 等[40]為深入了解鈣誘導(dǎo)花青素積累的分子機(jī)制，在全株噴鈣后一周對(duì)葡萄皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鈣處理共影響了1894 個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs），其中上調(diào)基因1266 個(gè)，下調(diào)基因628 個(gè)，此外還發(fā)現(xiàn)鈣觸發(fā)了大量與鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、花青素的生物合成和轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控以及植物激素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的DEGs。通過分析上調(diào)、下調(diào)的DEGs，明確了外源鈣可能通過以下四個(gè)途徑改善葡萄漿果顏色：鈣通過激活與花青素生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)花青素積累；鈣通過刺激鈣和UFGT 的相互作用促進(jìn)花青素的積累；鈣調(diào)素可能調(diào)節(jié)與花青素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而刺激花青素生物合成途徑中的基因；鈣信號(hào)刺激茉莉酸和乙烯的生物合成，通過增加內(nèi)源糖含量或直接激活與花青素生物合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，提高花青素含量。XU 等[41]為探討鈣處理對(duì)果實(shí)花色苷和酚類化合物含量的影響以及鈣處理對(duì)類黃酮合成途徑基因表達(dá)的影響，用不同濃度（10、20、50 mmol/L）的CaCl2溶液噴灑整個(gè)植株，比較了紅果和黃果兩種草莓品種的總酚類物質(zhì)和花色苷含量，以及花色苷結(jié)構(gòu)基因在草莓果實(shí)和其它組織中的表達(dá)譜。通過高效液相色譜和qRT-PCR 等技術(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)鈣處理提高了紅果果實(shí)中黃酮3-羥化酶（F3H1）、二氫黃酮醇4-還原酶（DFR2）、花青素合成酶（ANS1）和UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UGT1）等花青素關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平，使總酚和花青素含量提高了20%以上。JIA[42]等分析了缺磷脅迫下煙草植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)期的生理和分子變化，qRT-PCR 分析顯示，在缺磷葉片中，參與黃酮醇生物合成的基因NtCHS、NtCHI、NtF3H、NtF30H和NtFLS的轉(zhuǎn)錄水平升高。相比之下，花青素生物合成的關(guān)鍵基因NtDFR的轉(zhuǎn)錄水平在磷缺乏狀態(tài)下沒有升高，結(jié)果表明，在磷缺乏的情況下，煙草植株會(huì)積累黃酮醇，而不是花青素，此外還檢測(cè)到NtDFR上游調(diào)控基因NtAN2 的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，因此猜測(cè)缺乏磷的煙草葉片花青素合成失活的原因之一可能是NtAN2 需要其他轉(zhuǎn)錄因子的激活。周銹連[43]采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法比較了磷充足和磷缺乏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)了7 d 的擬南芥幼苗的蛋白質(zhì)譜，利用液相色譜-二級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS-MS）法結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析差異表達(dá)蛋白，分析發(fā)現(xiàn)磷缺乏有利于增強(qiáng)花青素的積累。

2.2 基因（轉(zhuǎn)錄因子）對(duì)黃酮化合物合成的調(diào)控

植物類黃酮的生物合成途徑由一系列結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因協(xié)同完成[44]，其合成結(jié)構(gòu)基因編碼催化合成途徑中的酶，這些關(guān)鍵結(jié)構(gòu)酶包括PAL、C4H、CHS、CHI、F3H、DFR 等，并受轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH、WD40 和NAC 以及其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[45]，下面重點(diǎn)對(duì)這幾類轉(zhuǎn)錄因子在不同類型植物中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行歸納總結(jié)[46]。

2.2.1 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 MYB 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同植物結(jié)構(gòu)基因和類黃酮合成影響不同，MYB 蛋白在調(diào)控類黃酮生物合成途徑中起著關(guān)鍵作用[47]。ZHAI 等[48]在梨果實(shí)中克隆了3 個(gè)候選MYB 轉(zhuǎn)錄因子，分別為PbMYB10b、PbMYB9 和PbMYB3，并通過過表達(dá)和RNAi 瞬時(shí)檢測(cè)進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果表明PbMYB10b 作為花青素通路和原花青素通路的激活劑，但其功能可被其他MYB 轉(zhuǎn)錄因子補(bǔ)充，闡明了在梨果實(shí)中類黃酮合成與MYB 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式的關(guān)系。PbMYB9 是原花青素、花青素和黃酮醇途徑的激活劑，其作用是梨果實(shí)類黃酮生物合成所必需的。PbMYB3 是PbMYB10 的潛在調(diào)節(jié)因子。同時(shí)，PbMYB3 的同源基因MdMYB3 過表達(dá)可以激活果實(shí)中CHS、CHI、UFGT、FLS幾個(gè)類黃酮途徑基因的表達(dá)[49]，因此認(rèn)為這幾種MYB 轉(zhuǎn)錄因子可能是梨果中類黃酮生物合成的調(diào)控因子[48]。ANWAR等[50]從中國水仙中鑒定了一個(gè)R2R3 MYB 轉(zhuǎn)錄因子NtMYB2，并對(duì)其進(jìn)行了功能表征。通過瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)NtMYB2 轉(zhuǎn)錄因子參與了花青素生物合成途徑的調(diào)控，并可能通過下調(diào)中國水仙關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄來抑制花青素生物合成。ZHU 等[51]從菊花中分離出編碼R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子的CmMYB8基因并對(duì)其進(jìn)行了功能表征，發(fā)現(xiàn)CmMYB8 是菊花R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)木質(zhì)素和類黃酮化合物的合成起到負(fù)調(diào)控作用。LI 等[52]對(duì)鳶尾科單子葉開花植物小蒼蘭的R2R3-MYB 的基因FhMYB5 的功能進(jìn)行了鑒定，相關(guān)分析表明，F(xiàn)hMYB5 基因的表達(dá)與小蒼蘭體內(nèi)花青素和原花青素的積累具有很好的一致性，F(xiàn)hMYB5 單獨(dú)作用時(shí)，輕微上調(diào)晚期類黃酮合成基因DFR和無色花色素雙加氧酶基因（LDOX），而當(dāng)FhMYB5 與bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因FhTT8L和FhGL3L共同發(fā)揮作用時(shí)，早期和晚期類黃酮合成基因均被明顯激活，F(xiàn)hMYB5 在煙草和擬南芥中的過表達(dá)也可明顯上調(diào)參與總黃酮途徑的基因表達(dá)，表明FhMYB5 在小蒼蘭總類黃酮途徑中發(fā)揮調(diào)控作用。TIAN 等[53]對(duì)協(xié)同調(diào)控原花青素和花青素生物合成的海棠的兩種R2R3-MYB 轉(zhuǎn)錄因子McMYB12a 和McMYB12b 進(jìn)行了功能表征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)McMYB12a 主要通過與花青素生物合成基因啟動(dòng)子的結(jié)合來上調(diào)花青素生物合成基因的表達(dá)，而對(duì)原花青素生物合成基因的調(diào)控作用僅為次要，而McMYB12b 則優(yōu)先結(jié)合原花青素生物合成基因的啟動(dòng)子。煙草中過表達(dá)McMYB12a 和McMYB12b改變了類黃酮生物合成基因的表達(dá)，促進(jìn)了煙草花瓣中原花青素和花青素的積累，而利用保守的基因區(qū)域瞬時(shí)沉默會(huì)導(dǎo)致原花青素和花青素產(chǎn)量減少。同時(shí)，這兩個(gè)基因在海棠果實(shí)中過表達(dá)和煙草中過表達(dá)具有相似的作用，在海棠中沉默McMYB12 轉(zhuǎn)錄因子與在煙草中沉默該轉(zhuǎn)錄因子也具有相似的作用，揭示了海棠葉片依賴于McMYB12a 和McMYB12b 表達(dá)的自調(diào)節(jié)平衡來調(diào)控花青素積累。

2.2.2 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄因子最大的家族之一，在類黃酮化合物等多種次生代謝產(chǎn)物的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。ZHAO 等[54]在羊草中發(fā)現(xiàn)了bHLH 型轉(zhuǎn)錄因子LcbHLH92，在擬南芥中表達(dá)該轉(zhuǎn)錄因子發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與種子顏色、花青素合成酶（ANS）和花青素還原酶（ANR）轉(zhuǎn)錄水平呈負(fù)相關(guān)，過表達(dá)LcbHLH92 會(huì)導(dǎo)致葉片和種子中花青素和原花青素的積累減少。ZHAO 等[55]克隆并鑒定了bHLH 家族蛋白PabHHL1 的功能，PabHLH1與參與類黃酮生物合成的IIIf 亞家族bHLH 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)，瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明，PabHLH1 存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明其具有交互活性，當(dāng)PabHLH1 在附子草中表達(dá)時(shí)，雙芐基和黃酮類化合物的含量與這些化合物生物合成途徑中相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，當(dāng)PabHLH1 在擬南芥中異源表達(dá)時(shí)，激活了黃酮類化合物和花青素的合成，參與了黃酮類化合物合成早期和晚期結(jié)構(gòu)基因的上調(diào)。在矢車菊中，DENG 等[56]篩選出4 個(gè)R2R3-CcMYB轉(zhuǎn)錄因子分類為4 或6 亞群，1 個(gè)CcbHLH1 轉(zhuǎn)錄因子分類為IIIf 亞群，進(jìn)一步分離出黃酮3-羥化酶（CcF3H）和二氫黃酮醇4-還原酶（CcDFR）啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)CcMYB6-1 顯著上調(diào)上述兩個(gè)啟動(dòng)子的活性，刺激花青素積累，與CcbHLH1 共同浸染后，其活性明顯增強(qiáng)。此外，酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)均顯示了這兩種激活劑之間的相互作用，因此表明轉(zhuǎn)錄因子CcMYB6-1 和CcbHLH1 分別是R2R3MYB和IIIfbHLH 的同源物，它們協(xié)同參與調(diào)控花青素的生物合成。葡萄中，WANG 等[57]化學(xué)合成了密碼子優(yōu)化的葡萄VvbHLH1 基因，VvbHLH1 的過表達(dá)上調(diào)了參與類黃酮合成、ABA 信號(hào)通路、脯氨酸合成和活性氧清除系統(tǒng)的基因，因此認(rèn)為葡萄bHLH 轉(zhuǎn)錄因子基因VvbHLH1 可能被用于增加類黃酮化合物含量以及提高類黃酮和其他植物對(duì)非生物脅迫的耐受性。在蘋果花青素代謝的分子機(jī)制研究中，XU 等[58]利用酵母雙雜交、蛋白質(zhì)體外結(jié)合和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明，MdMYB16 與MdbHLH33 形成同源二聚體并相互作用，而LBSMdMYB16 不與MdbHLH33 相互作用，在過表達(dá)MdMYB16 的愈傷組織中過表達(dá) MdbHLH33， 發(fā)現(xiàn)它減弱了MdMYB16 對(duì)花青素合成的抑制作用，這些結(jié)果表明MdMYB16 和MdbHLH33 可能是控制花青素合成途徑的重要調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的一部分。

2.2.3 WD40 轉(zhuǎn)錄因子 WD40 是一個(gè)基因家族，編碼一類WD40 蛋白，該蛋白是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)類黃酮的三大轉(zhuǎn)錄因子之一，它主要通過結(jié)構(gòu)域與其他蛋白發(fā)生互作，以此來行使它的調(diào)控功能[59]。WD40 蛋白又稱WD40 結(jié)構(gòu)域蛋白，是真核生物中的一個(gè)大基因家族。LIU 等[60]鑒定了178 個(gè)馬鈴薯WD40（StWD40）基因，并對(duì)其染色體分布、基因結(jié)構(gòu)和保守基元進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與一種WD40 蛋白TTG1 相互作用的蛋白有112 對(duì)，其中27 對(duì)在色素組織中差異表達(dá)，表明馬鈴薯WD40 蛋白可能與花青素的生物合成和非生物脅迫反應(yīng)有關(guān)。此外，有研究表明蘋果花青素和原花青素的積累受到MYB、bHLH 和WD40 蛋白這三類調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)格調(diào)控。AN 等[61]鑒定了一種促進(jìn)花青素積累的蘋果WD40蛋白（MdTTG1），當(dāng)MdTTG1 基因在擬南芥中過度表達(dá)時(shí)，類黃酮途徑下游所需的生物合成基因上調(diào)，酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)表明，蘋果MdTTG1 基因通過與bHLH 蛋白相互作用調(diào)節(jié)花青素的合成與積累。

2.2.4 其它 NAC 轉(zhuǎn)錄因子家族是植物類特有的一種轉(zhuǎn)錄因子超家族，該轉(zhuǎn)錄因子由一個(gè)保守的N 端結(jié)構(gòu)域和高度可變的C 端轉(zhuǎn)錄激活域組成，NAC 轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要作用[62]。SUN 等[63]鑒定了一種NAC 轉(zhuǎn)錄因子MdNAC52，其基因轉(zhuǎn)錄水平在蘋果著色過程中升高，蘋果愈傷組織MdNAC52 過表達(dá)積累了花青素。通過酵母單雜交、電泳遷移、染色質(zhì)免疫沉淀和熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)表明，MdNAC52 可與MdMYB9 和MdMYB11的啟動(dòng)子相互作用，參與花青素合成的調(diào)控。MdNAC52 還可與LAR 啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)，促進(jìn)花青素合成。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了MdNAC52 結(jié)合MdMYB9 和MdMYB11 的啟動(dòng)子促進(jìn)花青素的生物合成。JIANG 等[64]在荔枝果實(shí)中，通過電泳遷移和瞬時(shí)表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)LcNAC13 轉(zhuǎn)錄因子直接與花青素生物合成相關(guān)基因（LcCHS1/2、LcCHI、LcF3H、LcF3H、LcDFR、LcMYB1）啟動(dòng)子結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄，而LcR1MYB1 與LcNAC13 發(fā)生物理作用，逆轉(zhuǎn)LcNAC13 的負(fù)作用，因此推測(cè)LcNAC13 和LcR1MYB1 可能在荔枝果實(shí)成熟過程中協(xié)同調(diào)控花青素生物合成，這為花青素生物合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了新的思路。另外還有HD-Zip I 轉(zhuǎn)錄因子，此前研究表明HD-Zip I 亞家族基因參與了環(huán)境脅迫反應(yīng)、果實(shí)成熟等，但對(duì)其在花青素積累中的作用研究較少。HD-Zip 蛋白由同源框結(jié)構(gòu)域（HD）和同源框結(jié)構(gòu)域相關(guān)亮氨酸拉鏈（Zip）組成，JIANG 等[64]報(bào)道了HD-Zip I 轉(zhuǎn)錄因子MdHB1 也參與了花青素積累的調(diào)控。MdHB1 沉默導(dǎo)致蘋果果肉中花青素的積累，而其過表達(dá)降低了紅肉蘋果果肉中花青素的含量。此外，過表達(dá)MdHB1 的轉(zhuǎn)基因煙草花的著色明顯減少，瞬時(shí)啟動(dòng)子激活試驗(yàn)和酵母單雜交結(jié)果表明，MdHB1 間接抑制花青素生物合成基因DFR和UFGT的表達(dá)。酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)證實(shí)MdHB1 能與細(xì)胞質(zhì)中的MYB、bHLH 和WD40 相互作用，分析表明MdHB1 可以抑制MdMYB10、MdbHLH3、MdTTG1 進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而間接抑制MdDFR、MdUFGT 的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)MdHB1 被沉默時(shí)，這些轉(zhuǎn)錄因子被釋放，激活MdDFR 和MdUFGT 的表達(dá)和花青素的生物合成[65]。另外還有一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控下游基因的表達(dá)在植株應(yīng)答非生物逆境的過程中扮演重要角色。SHI 等[66]發(fā)現(xiàn)擬南芥鋅指轉(zhuǎn)錄因子（ZAT6）水平被H2O2誘導(dǎo)激活，調(diào)節(jié)AtZAT6 的表達(dá)對(duì)花青素和總黃酮的濃度均有正向影響。AtZAT6 通過與CHI、F3H、DFR、MYB12 和MYB111 基因的啟動(dòng)子結(jié)合，直接激活了這些基因的表達(dá)，MYB12 和MYB111 的激活上調(diào)了CHS和F3H酶基因的表達(dá)，表明AtZAT6 通過直接與幾個(gè)參與花青素合成的基因啟動(dòng)子結(jié)合，在H2O2激活的花青素合成中發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)論

類黃酮化合物作為植物中廣泛分布的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。越來越多的研究表明，類黃酮化合物對(duì)人類健康有重要意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，類黃酮化合物的合成途徑和調(diào)控機(jī)制已逐步闡明，不論是外界環(huán)境因素還是生物因子的研究都已逐步深入，本文綜述了近年來對(duì)類黃酮化合物生物合成途徑的調(diào)控，包括外界環(huán)境因素和生物因子兩方面的研究成果。近年來，基因組信息和各種組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為我們的深入研究提供了工具，由于類黃酮化合物的各種功能對(duì)人體健康的益處，在實(shí)際生活中有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前的研究水平大多是通過調(diào)控積累產(chǎn)物的量和在基因水平對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行過表達(dá)或抑制，通過基因或酶表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)來觀察產(chǎn)物的量，而與類黃酮合成相關(guān)的酶基因和啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能、調(diào)控基因的作用機(jī)理還有環(huán)境條件對(duì)植物蛋白質(zhì)組差異表達(dá)的影響、基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析以及類黃酮化合物分解代謝等方向還有待于進(jìn)一步研究，以期為植物類黃酮化合物的開發(fā)和利用提供更具體深入的理論依據(jù)[4,47]。