一測多評法測定羊肚菌中17 種氨基酸的含量

楊慧麗，杜 瑩，汪建文，梁光斐，伍 慶，岑 銳，洪 江,*

（1.貴州師范大學(xué)山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴州貴陽 550001；2.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001；3.貴州省科學(xué)院，貴州貴陽 550001；4.貴陽市第三實驗中學(xué)，貴州貴陽 550001；5.國藥集團同濟堂（貴州）制藥有限公司，貴州貴陽 550001）

羊肚菌（Morchella esculenta） 是四大名貴食用菌之一，因其菌蓋表面有許多不規(guī)則凹陷且多有褶皺，狀似羊肚而得名，主要分布于云南、貴州、青海、西藏等地[1?7]。羊肚菌肉質(zhì)鮮美，風(fēng)味獨特，營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、多糖等物質(zhì)，具有提升免疫力、抗癌等功效[8?11]。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本組成單元和人體的所需營養(yǎng)成分，具有多種不同的生理功能[12]，能判斷食品的營養(yǎng)價值，同樣也關(guān)聯(lián)和影響食品的風(fēng)味，是食品質(zhì)量評價的重要指標(biāo)，所以羊肚菌中氨基酸的含量是衡量羊肚菌品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)[13?16]。

在國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124-2016 中，測定氨基酸采用外標(biāo)法[17]，吳素蕊[18]、張航[19]、黃世群[20]等對羊肚菌氨基酸的研究多數(shù)均采用外標(biāo)法，但該方法不能消除實驗中的誤差以及標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣品之間的基體差異所導(dǎo)致的基質(zhì)效應(yīng)，對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確度有一定影響[21?24]；內(nèi)標(biāo)法由于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和待測組分來自同一基體，當(dāng)實驗條件發(fā)生非人為變化時，兩者會受到相同影響，消除了系統(tǒng)誤差，使分析更加準(zhǔn)確[25?26]。為了更好地評價羊肚菌的品質(zhì)，需對羊肚菌中氨基酸的含量進行全面、準(zhǔn)確的控制，但檢測物質(zhì)較多，成本過高且耗時過長。QAMS 法通過測定一個成分而實現(xiàn)多個成分的同步測定，大幅度降低成本和實驗人員的工作量[27?38]，比傳統(tǒng)質(zhì)量控制方法更加經(jīng)濟、高效、簡單。

本研究采用一測多評法測定羊肚菌中17 種氨基酸的含量，并對云南、新疆、貴州等6 個不同地區(qū)的羊肚菌測定研究，本文為衡量羊肚菌的食用價值和品質(zhì)優(yōu)劣提供了科學(xué)依據(jù), 為羊肚菌的開發(fā)利用指明了方向。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羊肚菌 采集于新疆伊犁州、云南麗江市、貴州劍河縣、貴州銅仁市萬山區(qū)、貴州貴陽市長坡嶺森林公園、貴州貴陽市烏當(dāng)區(qū)長坡六個地區(qū)，羊肚菌置于干燥箱70 ℃烘干后，粉碎處理，過60 目篩，粉末密封待用；甲醇、乙腈、三乙胺、正己烷 均為色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；異硫氰酸酯（PITC）純度大于98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙酸銨、冰醋酸 均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；超純水 自制；18 種氨基酸 [天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甲硫氨酸（Met）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、絲氨酸（Ser）、茶氨酸（The）] 純度均大于98%，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

Agilent 1100 高效液相色譜儀（方法學(xué)考察所用）、Agilent 1260 高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；DZKW- 電熱恒溫水浴鍋 天津天泰儀器有限公司；200T 粉碎機 永康鉑歐五金制品有限公司；AL-104 電子天平 梅特勒-托利多公司；CH-250 超聲波清洗機 北京創(chuàng)新德超聲電子研究所；Discovery DV215CD 分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司；202-1 型恒溫干燥箱 上海實驗儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制

1.2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取茶氨酸，配制濃度為0.404 mg/mL 的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 精確稱取 Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys 等17 種氨基酸至10 mL 容量瓶中，加水定容得到混標(biāo)儲備液。移取1 mL 混標(biāo)儲備液和0.5 mL 內(nèi)標(biāo)溶液于5 mL 容量瓶，加水定容，得到0.0397、0.0496、0.0218、0.0208、0.0078、0.1017、0.0311、 0.0447、 0.0277、 0.0182、 0.0207、 0.0061、0.0184、0.0263、0.0170、0.0181、0.0446 mg/mL 的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.1.3 衍生化試劑 衍生試劑A：取1.4 mL 1 mol/L的三乙胺溶液至10 mL 容量瓶，用乙腈定容，搖勻；衍生試劑B：吸取125 μL PITC 至10 mL 容量瓶，用乙腈定容至刻度，搖勻。

1.2.2 樣品溶液制備與衍生化

1.2.2.1 樣品溶液與空白溶液制備 準(zhǔn)確稱取20 mg羊肚菌于安瓿瓶中，加6.0 mol/L 的HCl 溶液2 mL，吹入氮氣后密封，將其置于（105±5）℃ 恒溫干燥箱中24 h，使氨基酸完全水解。取出冷卻后置80 ℃水浴揮干，多次加水揮發(fā)鹽酸。加1 mL 蒸餾水溶解，超聲后得到樣品溶液。將0.5 mL 的內(nèi)標(biāo)溶液和樣品溶液移加至5 mL 容量瓶，加水定容，得到樣品供試溶液，等待衍生。吸取0.5 mL 的內(nèi)標(biāo)溶液加至5 mL 容量瓶，加水定容，得空白溶液。

1.2.2.2 氨基酸的衍生化 精密吸取 200 μL 的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（或樣品供試溶液、空白液）于離心管中，加入衍生試劑A、B 各100 μL，置40 ℃水浴鍋中反應(yīng) 1 h，加入400 μL 正己烷，振蕩靜置10 min。取澄清的下層液，過0.45 μm 濾膜，即得待測樣品。

1.2.3 色譜條件 分離柱為依利特 Hypersil ODS2（5 μm, 250 mm×4.6 mm）；流動相A：0.05 mol/L 乙酸銨溶液（pH6.5）；流動相B：乙腈；梯度洗脫（0 min,0.8% B; 14 min, 5% B; 16 min, 6% B; 16.1 min, 4%B; 21 min, 4% B; 21.1 min, 3.5% B; 30 min, 3.5% B; 32 min,8% B; 40 min, 15% B; 40.1 min, 16.5% B; 44 min,16.5% B; 44.1 min, 20.8% B; 50 min, 23% B; 60 min,25% B）；流速為1 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為5 μL；

1.2.4 一測多評方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性考察 精確吸取0.25、0.5、1、2、4 mL的混標(biāo)儲備液，分別置于5 mL 容量瓶，再分別加入0.5 mL 內(nèi)標(biāo)溶液，加水定容，搖勻，進行衍生化處理，按上述的色譜進樣測定。以氨基酸對照品的濃度（mg/mL）為X 軸，峰面積為Y 軸進行線性回歸。

1.2.4.2 相對校正因子的計算 平行取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液6 份，進行衍生化處理，按上述的色譜條件測定。以Glu 為內(nèi)參物，根據(jù)相對校正因子（RCF，fkm）公式fkm=（Ck×Am）/（Cm×Ak）, 計算相對校正因子，式中Ck、Cm為內(nèi)參物和待測成分的濃度，Am、Ak為內(nèi)參物和待測成分的峰面積[29]。

1.2.4.3 精密度試驗 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進行衍生化處理后按上述的色譜條件連續(xù)測定6 次，記錄17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD 值以評價儀器的精密度。

1.2.4.4 重復(fù)性試驗 吸取6 份平行羊肚菌樣品供試溶液，進行衍生化處理，按上述的色譜條件進樣測定，記錄17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD 值以考察實驗的重復(fù)性。

1.2.4.5 穩(wěn)定性試驗 取樣品供試溶液，衍生化后，于 0、2、4、8、16、24 h 進樣分析，記錄17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積，計算RSD 值以評價樣品的穩(wěn)定性。

1.2.4.6 加樣回收率試驗 精密稱量已知含量的羊肚菌樣品9 份，每份10 mg，置于安瓿瓶中，按150%、100%、50%的比例加入標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)“1.2.2.1”操作后進行衍生化處理，在上述“1.2.3”的色譜條件下測定。根據(jù)測得的氨基酸的量，計算回收率和RSD 值。

1.2.5 樣品含量的測定 平行取3 份云南羊肚菌樣品溶液，進行衍生化處理，按上述的色譜條件測定。采用一測多評法和內(nèi)標(biāo)法對羊肚菌中17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的含量進行計算。

1.2.6 耐用性考察

1.2.6.1 不同色譜柱的考察 精確吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，進行衍生化處理后，在Agilent 1100 高效液相色譜儀，“1.2.3”的色譜條件下考察依利特 Hypersil ODS2（ 250 mm×4.6 mm, 5 μm） 和 Agilent C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）對氨基酸相對校正因子的影響。

1.2.6.2 不同儀器的考察 精密吸取混合對照品溶液，進行衍生化處理后，采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）在“1.2.3”色譜條件下，考察兩臺不同色譜儀Agilent 1100 HPLC、Agilent 1260 HPLC 對氨基酸相對校正因子的影響。

1.2.6.3 色譜峰定位 精密吸取混合對照品溶液，進行衍生化處理后，采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm），在Agilent 1100 HPLC、Agilent 1260 HPLC 中測定并計算以Glu 為內(nèi)參物，其他氨基酸的相對保留時間。

1.2.7 不同地區(qū)羊肚菌的測定 精密稱量6 個不同地區(qū)的羊肚菌，按“1.2.2.1”方法制備樣品供試溶液，進行衍生化處理，按“1.2.3”色譜條件進樣分析，采用一測多評法對氨基酸進行含量計算。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進行t檢驗，實驗譜圖Origin Pro 9.1 處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及空白色譜圖

在前期研究中，最初選擇鄰苯二甲醛為柱前衍生試劑，但衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定，實驗的重現(xiàn)性較差。在文獻調(diào)研后，選擇了異硫氰酸苯酯為柱前衍生試劑，其反應(yīng)條件溫和、衍生產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，重復(fù)性好。在前期的色譜條件研究中，考察了衍生時間對17 種氨基酸出峰面積的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，衍生30 min 的出峰面積與衍生60 min 的出峰面積有一定差異，衍生30 min 時間較短，可能導(dǎo)致衍生不完全，影響含量測定的準(zhǔn)確度；衍生90 min 與衍生60 min 的出峰面積一致，考慮效率問題，選擇衍生時間為60 min。

空白、標(biāo)準(zhǔn)品及樣品的HPLC 色譜圖如圖1 所示。由圖1 可知，在“1.2.3”色譜條件下，17 種氨基酸的峰型良好，干擾較少，分離清晰。

圖1 羊肚菌氨基酸高效液相色譜圖Fig.1 HPLC analysis of amino acids in Morchella esculenta

2.2 一測多評方法學(xué)考察

2.2.1 線性考察 精密吸取不同濃度對照品溶液，衍生化處理后注入色譜儀，結(jié)果見表1。由表1 可知，17 種氨基酸在線性范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2>0.9990。詳見表1。

表1 17 種氨基酸的線性回歸方程Table 1 Linearity relationships of 17 kinds of amino acids

2.2.2 相對校正因子的計算 通過研究發(fā)現(xiàn)，蘇氨酸、谷氨酸、賴氨酸和天冬氨酸在羊肚菌中的含量均較高且較穩(wěn)定[18?19]。但從質(zhì)控成本角度來看，谷氨酸較其他三種成分價格更加低廉且附近干擾峰較少。根據(jù)QAMS 法內(nèi)參物易得、價廉、有效、穩(wěn)定的選擇原則，本研究最終選擇谷氨酸作為內(nèi)參物進行相對校正因子的計算。

以Glu 為內(nèi)參物，計算其與其他16 種氨基酸的相對校正因子，結(jié)果表明，16 種氨基酸的相對校正因子RSD≤1.73%，詳見表2。

表2 16 種氨基酸的相對校正因子Table 2 Relative correction factor of 17 amino acids

2.2.3 精密度試驗 按“1.2.4.3”項下進行試驗，結(jié)果顯示，17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面積RSD（n=6）為0.89%、0.46%、1.08%、0.61%、 1.17%、 0.31%、 0.50%、 0.80%、 0.80%、1.89%、 0.45%、 0.52%、 0.90%、 0.53%、 0.88%、0.54%、0.57%，RSD 均小于2.0%，表示儀器的精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 按“1.2.4.4”項方法進行測定，結(jié)果顯示，17 種氨基酸峰（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）面積的RSD 為0.56%、1.72%、1.87%、0.42%、 1.53%、 1.85%、 1.49%、 0.80%、 0.93%、1.68%、 0.60%、 1.17%、 0.92%、 1.48%、 0.77%、0.96%、1.65%，RSD 均小于2.0%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 按“1.2.4.5”項方法進行測定，結(jié)果顯示，17 種氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys） 峰面積的 RSD 為 0.63%、 1.48%、 0.99%、1.37%、 1.03%、 1.49%、 1.02%、 1.41%、 0.78%、0.67%、 1.32%、 1.24%、 1.38%、 0.75%、 1.54%、1.24%、0.75%，RSD 均小于2.0%，說明樣品供試溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗 按“1.2.4.6”項下進行試驗，結(jié)果表明，羊肚菌中17 種氨基酸的平均回收率在92.42%～101.16%之間，RSD<2.0%，說明氨基酸的回收率較好。詳見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果Table 3 Result of recovery tests

2.2.7 樣品含量測定 按“1.2.5”項下采用QAMS和內(nèi)標(biāo)法計算羊肚菌中17 種氨基酸的含量，結(jié)果見表4。由表4 可知，QAMS 和內(nèi)標(biāo)法測定結(jié)果基本一致。對2 種方法測得結(jié)果進行t檢驗分析，結(jié)果顯示，2 種方法測定的17 種有效成分的含量均無顯著差異（P>0.05）。說明一測多評法在測定羊肚菌氨基酸中的適用性和可行性得到了驗證，在對照品缺乏的情況下，所建立的一測多評法可以作為一種經(jīng)濟、準(zhǔn)確、快捷的方法應(yīng)用羊肚菌質(zhì)量的評價。

表4 羊肚菌氨基酸含量測定（mg/mL）Table 4 Amino acid content of Morchella esculenta（mg/mL）

2.2.8 耐用性考察

2.2.8.1 不同色譜柱的考察 采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）、Agilent C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色譜柱在Agilent 1100 HPLC 測定16 種氨基酸的相對校正因子影響見表5。由表5 可知，16 種氨基酸的相對校正因子在不同色譜柱下的RSD 均小于1.85%，說明相對校正因子在不同品牌色譜柱下具有良好的重復(fù)性。

2.2.8.2 不同儀器的考察 采用依利特 Hypersil ODS2（250 mm×4.6 mm, 5 μm）色譜柱，考察Agilent 1100 HPLC、Agilent 1260 HPLC 對16 種氨基酸相對校正因子的影響見表5。由表5 可知，不同儀器下的氨基酸相對校正因子的RSD 均不大于1.57%，重復(fù)性良好，說明此方法適用于不同的色譜體系。

表5 不同色譜柱、色譜儀對相對校正因子的影響Table 5 Effect of different chromatographic columns and instruments on RCF

2.2.8.3 色譜峰定位 色譜峰的準(zhǔn)確定位是保證QAMS 法應(yīng)用的前提。以谷氨酸為內(nèi)參物，采用不同色譜柱及高效液相色譜儀，驗證相對保留時間定位色譜峰的準(zhǔn)確性，詳見表6。由表6 可知，在不同色譜柱和色譜系統(tǒng)下，相對保留時間變化幅度較小，RSD 均≤1.14%，可準(zhǔn)確定位。

表6 不同色譜柱、色譜儀的相對保留時間Table 6 Relative retention times of different chromatographic columns and instruments

2.3 不同地區(qū)羊肚菌的測定

采用一測多評法測定6 個地區(qū)羊肚菌中17 種氨基酸的含量見表7。由表7 可知，羊肚菌富含8 種必需氨基酸，其占氨基酸總量的47.22%～55.34%，其中Thr 含量是最高的，占總量的16.55%～21.77%。甜味氨基酸占總量的36.60%～45.77%，鮮味氨基酸占總量的21.63%～27.34%。Leu 和Val 具有焙烤風(fēng)味和特殊甜味，這些氨基酸在羊肚菌香味的形成過程中有重要作用，這是羊肚菌具有獨特風(fēng)味的重要原因。

表7 不同地區(qū)羊肚菌氨基酸含量測定（g/100 g）Table 7 Amino acid content of Morchella esculenta（g/100 g）

藥用氨基酸種類齊全，占氨基酸總量的47.74%～56.42%，其中Glu、Lys 平均占藥用氨基酸總量的17.29%、17.05%。羊肚菌中含有的豐富賴氨酸可以補充谷物中賴氨酸的不足，Glu 對腦神經(jīng)損傷、癲癇有效，還具有護肝功效。綜上所述，羊肚菌富含各類藥用氨基酸為其開發(fā)各種保健食品、藥品以及日常食用的藥膳提供了一定的基礎(chǔ)。

不同產(chǎn)地羊肚菌之間氨基酸總量有明顯差異，長坡嶺森林公園下野生的羊肚菌樣品氨基酸總量最高，新疆羊肚菌氨基酸總量最少，且不同地區(qū)的各氨基酸含量有一定差異，由此可知，其品質(zhì)差異與其環(huán)境、氣候、種植方式等因素有關(guān)。

對六個不同地區(qū)的羊肚菌氨基酸測定結(jié)果顯示，羊肚菌中氨基酸含量豐富，且富含人體所需的必需氨基酸和藥用氨基酸，有較高的食用價值，可作為人體必需氨基酸營養(yǎng)的天然來源之一，且極具開發(fā)作為補充氨基酸的功能性食品；其鮮味、甜味氨基酸含量較高，是開發(fā)食品調(diào)味劑的天然寶庫。綜上所述，羊肚菌在食品、醫(yī)療領(lǐng)域具有很大的開發(fā)潛力和廣闊的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

采用QAMS 法測定羊肚菌中17 種氨基酸的含量，建立并應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法驗證該方法同時測定羊肚菌中17 種氨基酸含量的可行性，結(jié)果表明，兩種方法測得的結(jié)果無顯著性差異（P>0.05），不同色譜柱和儀器之間的相對校正因子重復(fù)性良好，且QAMS 法操作簡單，極大程度提高了工作效率，可為建立羊肚菌的質(zhì)量評價提供參考。同時，為羊肚菌的應(yīng)用提供一定的理論支持，為羊肚菌的開發(fā)利用指明了方向，對推動羊肚菌行業(yè)的發(fā)展有重要意義。