基于群體感應(yīng)研究苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌腐敗特性的抑制作用

于淑池，邢文君，馮紫藍(lán)，梁宇晴，楊 波，徐小雄，裴志勝

（海南熱帶海洋學(xué)院，食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南三亞 572022）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是細(xì)菌之間信息交流的一種機(jī)制，細(xì)菌通過(guò)自身合成并釋放信號(hào)分子（autoinducer，AI）來(lái)感知環(huán)境變化，當(dāng)信號(hào)分子濃度積累到閾值時(shí)，便會(huì)與細(xì)菌體內(nèi)特異性受體相結(jié)合，從而啟動(dòng)腐敗相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)菌生物被膜的形成、胞外酶的分泌、致腐因子產(chǎn)生及細(xì)菌運(yùn)動(dòng)等腐敗特性[1]。群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）是以細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶點(diǎn)，干擾或抑制腐敗菌的生物被膜形成和致腐基因表達(dá)，且對(duì)細(xì)菌正常生命活動(dòng)不造成破壞[2]，不會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的形成，具有良好的生態(tài)安全性和環(huán)境友好性；QSI 主要包括天然來(lái)源和人工合成兩類[3]；從食品安全的角度考慮，天然來(lái)源QSI 具有毒副作用小或幾乎無(wú)毒[4]、成本低廉、便于合成、安全性較高等特點(diǎn)[1]，而逐漸成為研究熱點(diǎn)。

中草藥和藥食同源植物中發(fā)現(xiàn)大量具有 QSI 活性的天然物質(zhì)[5]，苦丁茶來(lái)源為冬青科植物大葉冬青的葉，主要產(chǎn)于我國(guó)南部及西南部地區(qū)，具有2000多年的飲用歷史，也是傳統(tǒng)的藥用植物，苦丁茶多酚主要包括兒茶素類、黃酮類、黃酮醇類、酚酸類等成分[6]；具有較強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)還具有降血壓、降脂、抗菌消炎等功效[7]；現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，茶多酚（tea polyphenols, TP）是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，是天然抗氧化劑，同時(shí)具有廣譜抗菌性，對(duì)有細(xì)胞壁和無(wú)細(xì)胞壁的革蘭氏陰性、陽(yáng)性菌均有良好的抑制作用[8]，在各種食品的保鮮應(yīng)用中已經(jīng)非常廣泛[9]，但作為群體感應(yīng)抑制劑研究應(yīng)用報(bào)道較少，黃旭鎮(zhèn)[10]研究發(fā)現(xiàn)茶多酚作為一種天然來(lái)源的QSI，最小抑菌濃度和亞抑菌濃度下可以阻斷腐敗希瓦氏菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，降低其致腐能力；劉五高等[11]發(fā)現(xiàn)茶多酚與常用抗菌藥物聯(lián)用對(duì)多重耐藥肺炎克雷伯菌具有協(xié)同殺菌作用，干擾其生物膜形成和胞外黏液樣物質(zhì)的產(chǎn)生；丹皮提取物與茶多酚復(fù)合作為群體感應(yīng)抑制劑[12]，具有協(xié)同保鮮效果，可以減緩冷藏大菱鲆魚(yú)塊的腐敗變質(zhì)速率?？喽〔瓒喾幼鳛槿后w感應(yīng)抑制劑，抑制水產(chǎn)品腐敗菌熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）群體感應(yīng)及腐敗特性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究從0 ℃貯藏的卵形鯧鲹魚(yú)肉中分離鑒定出一株優(yōu)勢(shì)腐敗菌熒光假單胞菌（P.fluorescens）[13]，研究表明，P. fluorescens是一種典型的革蘭氏陰性腐敗菌，廣泛存在于生魚(yú)、肉類、乳制品及新鮮蔬菜中[14]，是引起低溫條件下高蛋白和高脂肪食品腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)腐敗菌[15]。本文以報(bào)告菌株紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026 為檢測(cè)模型，以苦丁茶多酚作為群體感應(yīng)抑制劑，測(cè)定苦丁茶多酚對(duì)CV026 的群體感應(yīng)抑制活性；以熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）為目標(biāo)菌株，探究亞抑菌濃度下苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌群體感應(yīng)特性的抑制作用；以期拓寬苦丁茶多酚的應(yīng)用范圍，為植物源新型群體感應(yīng)抑制劑研究開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦丁茶 購(gòu)于三亞市勝利路旺豪超市；報(bào)告菌株紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）CV026購(gòu)于北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司；目標(biāo)菌株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens） 自冷藏卵形鯧鲹分離得到，被鑒定為冷藏卵形鯧鲹的特定腐敗菌，保存于實(shí)驗(yàn)室；無(wú)水乙醇、乙酸、氯化鈉、乙酸乙酯、結(jié)晶氯化鋁、氯化鋅、甲醇、葡萄糖 均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉、卡那霉素、堿性蛋白酶試劑盒 索萊寶生物科技有限公司；酵母粉 廣東一品鮮生物科技有限公司；脂肪酶檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所；N-己?；?L-高絲氨酸內(nèi)酯標(biāo)準(zhǔn)品（C6-HSL） Sigma 公司。

SHB-B95 循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；Multifuge XIR 高速冷凍離心機(jī)ThermoFisher 有限公司；RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；LT-DBX120F 精密可編程熱風(fēng)循環(huán)烘箱 立德泰勀（上海）科學(xué)儀器有限公司；T6 新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；HWS-26 超級(jí)恒溫水浴鍋 金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司；全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀 杭州迅數(shù)科技有限公司；歐諾新一代智能搖床 天津歐諾儀器股份有限公司；TECAN Infinice M NANO 酶標(biāo)儀 勒菲生物科技上海有限公司；SQ510C 高壓蒸汽滅菌鍋 重慶雅馬拓科技有限公司；SW-CJ-1FD 潔凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；BM2000 光學(xué)顯微鏡 南京江南永新光學(xué)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦丁茶多酚的制備 苦丁茶多酚的制備參照潘妍霓等[16]的方法并略有改動(dòng)，稱取100 g 苦丁茶粉末加入250 mL 的 45%乙醇溶液，90 ℃水浴浸提25 min，重復(fù)2 次后合并浸提液，調(diào)pH 至6.0，加入AlCl3（6 g）、ZnCl2（12 g）混合進(jìn)行沉淀，混合液離心（3000 r/min，10 min）取沉淀，加入12%鹽酸200 mL 將沉淀轉(zhuǎn)溶，抽濾后得上清液，400 mL 乙酸乙酯分2 次加入進(jìn)行萃取，將萃取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（真空度0.07 MPa，60 ℃）濃縮，進(jìn)一步干燥得到苦丁茶多酚干物質(zhì)20.3 g，以45%乙醇溶解，配成20 mg/mL母液，4 ℃冷藏備用，使用前經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過(guò)濾除菌。

1.2.2 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性及最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定

1.2.2.1 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的抑菌活性測(cè)定 參照?；鄢萚17]的方法并略有改動(dòng)。熒光假單胞菌于28 ℃，160 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜活化后，按2%比例接種于LB 肉湯（酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH7.2～7.4，121 ℃滅菌30 min，固體LB 培養(yǎng)基加入瓊脂20 g/L）中，繼續(xù)培養(yǎng)至菌體密度OD600nm約為0.4，吸取菌液100 μL，均勻涂布于LB 瓊脂培養(yǎng)基，牛津杯打孔，每孔加入50 μL不同濃度（2、10、20 mg/mL）苦丁茶多酚，以45%乙醇為空白對(duì)照。28 ℃培養(yǎng)靜置24 h，觀察苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)抑制情況。

1.2.2.2 苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌和熒光假單胞菌最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定 采用平板涂布法[18]測(cè)定，將苦丁茶多酚母液二倍比稀釋成6 個(gè)濃度，紫色桿菌、熒光假單胞菌最小抑菌濃度測(cè)定的濃度選擇分別是0.263、0.525、1.05、2.1、4.2、8.4 mg/mL 以及0.375、0.75、1.5、3.0、6.0、12.0 mg/mL，分別吸取2 mL 苦丁茶多酚溶液加入到無(wú)菌平皿內(nèi)，每皿再倒入18 mL 已滅菌的LB 瓊脂培養(yǎng)基，混勻，冷卻凝固后，于平板中央分別加入100 μL 過(guò)夜活化的熒光假單胞菌菌液，涂布均勻，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌的生長(zhǎng)情況，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的最低濃度為苦丁茶多酚的最低抑菌濃度（MIC），每個(gè)濃度重復(fù)操作3 次。

1.2.3 苦丁茶多酚的群體感應(yīng)抑制活性檢測(cè) 參照李晴等[19]的方法并稍作改進(jìn)，將?80 ℃保存的報(bào)告菌株紫色桿菌CV026 接種于LB 肉湯，28 ℃、160 r/min條件下?lián)u床振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，以2%接入量接種于10 mL含有10 μg/mL 卡那霉素的LB 肉湯中，搖床培養(yǎng)16 h 后，吸取1 mL 菌液與100 mL 冷卻至40 ℃左右LB 半固體培養(yǎng)基混勻，倒平板。待凝固后用牛津杯打孔，分別加入 100 μL 亞抑菌濃度（0.5、1. 0、1.5和 2. 0 mg/mL）的苦丁茶多酚（均含有20 μg/mL C6-HSL），以只加入100 μL 20 μg/mL C6-HSL 為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃靜置培養(yǎng) 1～2 d，觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。

1.2.4 苦丁茶多酚對(duì)紫色菌素產(chǎn)生及紫色桿菌生長(zhǎng)的影響 參照文獻(xiàn)[1]的方法，將過(guò)夜活化的紫色桿菌CV026，以1:100（體積比）的比例接種于LB 肉湯中，加入苦丁茶多酚，使其終濃度分別為0.5、1.0、1.5和2.0 mg /mL，并添加20 μg/mL 的信號(hào)分子C6-HSL，搖床振蕩培養(yǎng)（28 ℃、160 r /min）至OD595nm為1 左右，依次取300 μL 添加信號(hào)分子菌液于1.5 mL 無(wú)菌離心管中，加入150 μL 10%十二烷基硫酸鈉，室溫下渦旋振蕩5 s，靜置5 min，加入600 μL飽和正丁醇（正丁醇50 mL 與蒸餾水10 mL），渦旋振蕩8 s，離心（10000 r /min，5 min），取含有紫色色素上清液200 μL 加入96 孔板中，測(cè)定OD595nm，以未添加苦丁茶多酚的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。以空白對(duì)照組的OD595nm為100%，計(jì)算苦丁茶多酚各處理組的紫色菌素生成抑制率，計(jì)算公式為：

同時(shí)為測(cè)定苦丁茶多酚對(duì)報(bào)告菌株CV026 生長(zhǎng)的影響，以不加信號(hào)分子的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照，其余步驟同上，相同條件下培養(yǎng)，測(cè)定紫色桿菌CV026 生長(zhǎng)情況。

1.2.5 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響測(cè)定 參照王虹懿等[2]的方法，取活化好的熒光假單胞菌，按2%比例接種于LB 肉湯中，加入苦丁茶多酚，使其在培養(yǎng)基中的終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，設(shè)置未添加苦丁茶多酚的液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，于28 ℃、200 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)，每隔1 h 測(cè)1 次各組 OD600nm值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 苦丁茶多酚在亞抑菌濃度下對(duì)熒光假單胞菌腐敗特性的影響

1.2.6.1 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌蛋白酶活性的影響 配置脫脂牛奶平板[2]，15%的脫脂乳粉用純水溶解后單獨(dú)滅菌（115 ℃，30 min），取10 mL 脫脂乳與90 mL 含0.85%瓊脂的LB 半固態(tài)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基混合均勻，傾注到水瓊脂平板中，蛋白酶活性定性檢測(cè)參照文獻(xiàn)[20]的方法，培養(yǎng)基凝固后用牛津杯打孔，加入過(guò)夜培養(yǎng)的含有不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）苦丁茶多酚的熒光假單胞菌菌液100 μL，28 ℃ 靜置培養(yǎng)24 h，以不加苦丁茶多酚的菌液為空白對(duì)照，每個(gè)處理3 個(gè)平行，觀察并測(cè)量其水解圈直徑。

蛋白酶活性定量檢測(cè)采用堿性蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行，將上述步驟中過(guò)夜培養(yǎng)的含有不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）苦丁茶多酚的熒光假單胞菌菌液，離心（4 ℃，10000 r/min，10 min）后取上清液，并用0.22 μm 無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌，根據(jù)堿性蛋白酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定680 nm 處吸光度，計(jì)算蛋白酶活性，公式如下：

式中：?A測(cè)定=A測(cè)定管?A對(duì)照管；?A標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管?A空白管；Cpr 為樣液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

1.2.6.2 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌脂肪酶活性的影響 將含有不同濃度（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL）苦丁茶多酚過(guò)夜培養(yǎng)的熒光假單胞菌菌液分別于4 ℃，10000 r/min 離心10 min，取上清液并用0.22 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌備用。根據(jù)脂肪酶測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定420 nm 處吸光度，計(jì)算脂肪酶活性，公式如下：

式中: A1為第一次吸光度值；A2為第二次吸光度值；AS為標(biāo)準(zhǔn)吸光度。

1.2.6.3 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成量的影響 采用酶標(biāo)法[17]，將過(guò)夜活化的熒光假單胞菌，按1%的比例接種于LB 肉湯中，分裝至無(wú)菌離心管，每管1 mL，加入苦丁茶多酚使其終濃度為0.5、1.0、1.5 和 2.0 mg/mL，以無(wú)菌去離子水為對(duì)照，每組3 次重復(fù)，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h，測(cè)定菌液密度后，傾倒菌液，無(wú)菌水清洗3 次后，無(wú)菌風(fēng)干燥30 min，采用0.1%（W/V）結(jié)晶紫溶液染色15 min，倒去染液用無(wú)菌水沖洗5 次，加入33%冰醋酸1 mL 充分溶解，取200 μL 于96 孔板中，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)595 nm處測(cè)定OD 值。按下列公式計(jì)算生物被膜形成率：

式中：ODcontrol為對(duì)照組測(cè)得生物被膜的OD595nm值；ODQSI為抑制劑處理組的OD595nm值。

1.2.6.4 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生物被膜生成的影響 參照文獻(xiàn)[1]，將載玻片于無(wú)水乙醇和去離子水中分別超聲處理30 min，烘干滅菌備用。將過(guò)夜活化的熒光假單胞菌，按1%的比例接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，吸取10 mL 熒光假單胞菌菌液加入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再加入一定量的苦丁茶多酚，使其終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，將處理好的載玻片浸在其中，28 ℃培養(yǎng)72 h，同時(shí)以不添加苦丁茶多酚為空白對(duì)照組。培養(yǎng)完成后取出載玻片，先用無(wú)菌水清洗3 次，加入適量甲醇固定15 min，2% 結(jié)晶紫染色5 min，無(wú)菌水沖洗6 次，無(wú)菌風(fēng)干燥固定，采用光學(xué)顯微鏡（油鏡）觀察生物膜的生成情況。

1.2.6.5 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌群集性和泳動(dòng)性的影響 參考文獻(xiàn)[21]的方法配制群集瓊脂培養(yǎng)基（1%蛋白胨、0.5%葡萄糖、0.5%氯化鈉、0.5%瓊脂）和泳動(dòng)瓊脂培養(yǎng)基（1%胰蛋白胨、0.5%瓊脂、0.3%氯化鈉），將不同濃度的苦丁茶多酚經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾除菌后，分別與冷卻到40 ℃左右的群集、泳動(dòng)培養(yǎng)基混勻后倒平板，使苦丁茶多酚的終濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，以未添加苦丁茶多酚的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，待培養(yǎng)基冷卻后，向平板中央加入過(guò)夜活化的熒光假單胞菌菌液5 μL，無(wú)菌風(fēng)吹干，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株的遷移情況，并測(cè)量群集、泳動(dòng)平板中，熒光假單胞菌的群集或泳動(dòng)直徑，根據(jù)測(cè)得的直徑值，進(jìn)一步計(jì)算群集、泳動(dòng)面積并作圖。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及繪圖，組間數(shù)據(jù)差異顯著性采用SSPS17.0 進(jìn)行ANOVA 方差分析，顯著性水平設(shè)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁茶多酚的抑菌活性及最小抑菌濃度的測(cè)定

抑菌活性可通過(guò)抑菌圈的大小初步反映[22]。采用牛津杯打孔法測(cè)定苦丁茶多酚的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of Kuding tea polyphenols on P.fluorescens

由圖1 可知，對(duì)照組（圖1-1）及低濃度苦丁茶多酚（圖1-2）沒(méi)有抑菌圈產(chǎn)生，說(shuō)明其對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)未產(chǎn)生影響；隨著苦丁茶多酚濃度的升高，抑菌作用逐漸顯現(xiàn)，10、20 mg/mL（圖1-3、1-4）苦丁茶多酚處理組的抑菌圈直徑分別為8.58 mm 和13.66mm，說(shuō)明較高濃度的苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，在所選擇的濃度范圍內(nèi)，抑菌活性與濃度呈正相關(guān)。

最小抑菌濃度（MIC）可用于定量表示抑菌劑的抑菌性能。因此，后續(xù)苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌和熒光假單胞菌的最小抑菌濃度測(cè)定，采用1.2.2.2 中設(shè)定的濃度范圍展開(kāi)，采用平板涂布法經(jīng)過(guò)24 h 靜置培養(yǎng)后，觀察所取濃度范圍內(nèi)菌株的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)2.1、3.0 mg/mL 的苦丁茶多酚剛好完全抑制紫色桿菌和熒光假單胞菌的生長(zhǎng)，因此確定苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌、熒光假單胞菌的最小抑菌濃度（MIC）為2.1、3.0 mg/mL，為了保證后續(xù)各實(shí)驗(yàn)的效果不是由苦丁茶多酚的抑菌作用引起，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取苦丁茶多酚的亞抑菌濃度進(jìn)行，即選擇0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 4 個(gè)濃度。

2.2 苦丁茶多酚的群體感應(yīng)活性測(cè)定

紫色桿菌（Chnomobacterium violaceum）CV026報(bào)告菌株是野生菌株Chromobacterium violaceumATCC 31532 的mini-Tn5 突變體，具有卡那霉素抗性，其本身不產(chǎn)生紫色菌素，也不產(chǎn)生N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子（AHLs），但當(dāng)有外源信號(hào)分子AHLs 存在時(shí)，能感知其存在[23]，并產(chǎn)生紫色素；紫色桿菌CV026 紫色素的產(chǎn)生受細(xì)菌群體感應(yīng)調(diào)控，而群體感應(yīng)抑制劑會(huì)抑制其紫色素的產(chǎn)生。采用報(bào)告平板法測(cè)定苦丁茶多酚對(duì)報(bào)告菌株CV026 紫色素產(chǎn)生的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 顯示，平板中添加C6-HSL 信號(hào)分子處理組（圖2-1），孔徑周圍出現(xiàn)明顯的紫色，表明紫色桿菌CV026 感知到C6-HSL 信號(hào)分子存在并產(chǎn)生了紫色菌素；添加苦丁茶多酚的孔徑（圖2-2～5）周圍紫色逐漸減少，隨著苦丁茶多酚濃度的提高，顏色逐漸變淡，抑制作用呈劑量依賴性，說(shuō)明苦丁茶多酚抑制了紫色桿菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，降低了紫色素的產(chǎn)生。

圖2 苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌CV026 紫色素產(chǎn)生的抑制作用Fig.2 Inhibitory effects of Kuding tea polyphenols on violacein production of C. violaceum CV026

采用酶標(biāo)法測(cè)定對(duì)照組及苦丁茶多酚各處理組紫色菌素生成量，根據(jù)公式（1）計(jì)算紫色菌素生成抑制率；同時(shí)測(cè)定紫色桿菌菌液密度，以確定苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌CV026 菌落密度和紫色菌素生成抑制率的影響Fig.3 Effects of Kuding tea polyphenols on bacteria concentration and inhibitory rate of production of mycetin of C.violaceum CV026

圖3 顯示，亞抑菌濃度下，各處理組菌液密度值比較接近，表明苦丁茶多酚對(duì)紫色桿菌CV026 生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響（P>0.05）；隨著苦丁茶多酚濃度的升高，紫色桿菌色素生成抑制率逐漸升高，當(dāng)苦丁茶多酚濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，紫色菌素產(chǎn)量?jī)H為對(duì)照產(chǎn)量的31.11%（P<0.05），抑制率達(dá)到68.89%。說(shuō)明苦丁茶多酚在不影響菌株正常生長(zhǎng)條件下，對(duì)紫色桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)具有抑制作用。

2.3 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響

亞抑菌濃度下，苦丁茶多酚處理組對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)曲線影響情況見(jiàn)圖4。

圖4 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.4 Effects of Kuding tea polyphenols on the growth of P.fluorescens

由圖4 可知，亞抑菌濃度下的苦丁茶多酚處理12 h，各組P.fluorescens的生長(zhǎng)曲線與對(duì)照組生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，0～2 h 為熒光假單胞菌的生長(zhǎng)調(diào)整期，細(xì)菌密度基本變化不大，2 h 后開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌進(jìn)行快速地生長(zhǎng)，對(duì)照組和0.5、1.0 mg/mL 苦丁茶多酚處理組的生長(zhǎng)速度較快。到12 h 時(shí)生長(zhǎng)曲線已逐漸趨于穩(wěn)定，對(duì)照組和添加0.5、1.0 mg/mL苦丁茶多酚處理組的OD600nm值分別為1.17、1.18、1.15，菌株生長(zhǎng)水平整體變化不明顯；但2.0 mg/mL苦丁茶多酚處理組的生長(zhǎng)速度相較之下稍慢，在12 h時(shí)菌體密度OD600nm值為1.11。說(shuō)明隨著苦丁茶多酚濃度的升高，菌株活力逐漸受到抑制，細(xì)菌生長(zhǎng)速度稍微下降，但總體變化趨勢(shì)區(qū)別不大（P>0.05），苦丁茶多酚對(duì)菌株的生長(zhǎng)水平影響不明顯。

2.4 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

腐敗細(xì)菌在脫脂牛奶平板生長(zhǎng)過(guò)程中，通過(guò)分泌胞外蛋白酶，水解牛奶中的酪蛋白，形成明顯的透明圈，蛋白酶水解活性的高低可以通過(guò)觀察透明圈的大小來(lái)判斷[24]。熒光假單胞菌可分泌胞外蛋白酶水解水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)及游離氨基酸，產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物，使水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)[25]。由圖5 可知，未添加苦丁茶多酚的對(duì)照組（圖5-1）水解圈最大，為9.41 mm，經(jīng)苦丁茶多酚處理后蛋白酶水解圈直徑逐漸明顯減小，0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 苦丁茶多酚處理組的蛋白酶水解圈直徑分別為5.07、3.77、3.63、3.25 mm（圖5-2、3、4、5），水解圈直徑與苦丁茶多酚濃度呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明亞抑制濃度的苦丁茶多酚抑制了熒光假單胞菌的胞外蛋白酶活性。群體感應(yīng)抑制劑能夠抑制腐敗菌胞外蛋白酶活性，相關(guān)研究報(bào)道較多[1,2,17,19]。P. fluorescens是水產(chǎn)品中主要的蛋白分解菌，具有產(chǎn)生高活性蛋白水解酶的能力[26],該過(guò)程是由QS 現(xiàn)象調(diào)控的[24]，崔方超等[27]研究認(rèn)為，熒光假單胞菌胞外蛋白酶分泌活性受?；呓z氨酸內(nèi)酯類信號(hào)分子介導(dǎo)的QS 系統(tǒng)調(diào)控。為定量確定苦丁茶多酚抑制熒光假單胞菌胞外蛋白水解酶分泌能力，進(jìn)一步采用堿性蛋白酶檢測(cè)試劑盒定量測(cè)定了苦丁茶多酚對(duì)P.fluorescens蛋白酶活性的影響，按公式（2）計(jì)算蛋白酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖5 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig.5 Effects of Kuding tea polyphenols on extracellular protease activity of P. fluorescens

圖6 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌蛋白酶活性的影響Fig.6 Effects of Kuding tea polyphenols on extracellular protease activity of P. fluorescens

由圖6 可知，對(duì)照組熒光假單胞菌蛋白酶活性最高，蛋白酶活性達(dá)到2.9×10-2U/mg prot，隨著苦丁茶多酚濃度的升高，蛋白酶活性逐漸降低?？喽〔瓒喾訚舛葹?.0 mg/mL 時(shí)，蛋白酶活性為0.56×10?2U/mg prot，與對(duì)照相比其相對(duì)抑制率達(dá)到80.68%，差異顯著（P< 0.05）。表明苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的蛋白酶活性具有抑制作用。這與綠原酸[2]、花椒提取物[19]等對(duì)P. fluorescen蛋白水解酶活性的抑制作用測(cè)定結(jié)果相似，只是研究中發(fā)現(xiàn)P. fluorescens蛋白酶活性普遍偏低，可能與所用培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件等因素影響相關(guān)。

2.5 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌脂肪酶活性影響

肉制品腐敗菌通過(guò)產(chǎn)生脂肪酶降解肌肉組織，將甘油三酯降解為甘油或脂肪酸，從而改變肌肉組織導(dǎo)致腐敗發(fā)生[2]。按公式（3）計(jì)算脂肪酶活性，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌胞外脂肪酶活性的影響Fig.7 Effects of Kuding tea polyphenols on extracellular lipase activity of P. fluorescens

圖7 顯示，對(duì)照組的脂肪酶活性最高，為0.4 U/mL，處理組隨著苦丁茶多酚濃度的增加，熒光假單胞菌的脂肪酶活性逐漸降低，苦丁茶多酚濃度為2.0 mg/mL時(shí)，脂肪酶活性為0.186 U/mL，與對(duì)照相比其相對(duì)抑制率達(dá)到53.50%，差異顯著（P<0.05）。說(shuō)明苦丁茶多酚能抑制熒光假單胞菌胞外脂肪酶的活性，且濃度越高，抑制能力越強(qiáng)，研究結(jié)果與綠原酸對(duì)P. fluorescens脂肪酶活性抑制作用相似[2]。

2.6 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成的影響

在外界環(huán)境條件不利的情況下，細(xì)菌相互粘連并將其自身克隆聚集纏繞于自身的分泌物以及崩解物中，形成的膜樣物為生物被膜（biofilm，BF）[28]，其廣泛存在于食品加工設(shè)備表面，不易清理，對(duì)食品容易造成污染[29]，苦丁茶多酚對(duì)生物膜形成抑制作用的定量測(cè)定，按公式（4）計(jì)算生物膜形成率，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的菌液密度和生物被膜形成的影響Fig.8 Effects of Kuding tea polyphenols on bacteria concentration and biofilm formation of P. fluorescens

圖8 顯示，各組菌液密度值都接近，差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響；對(duì)照組的生物被膜形成率為100%，0.5 mg/mL 苦丁茶多酚處理組的生物被膜形成率為94.36%；當(dāng)苦丁茶多酚的濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，生物被膜的形成率僅為55.10%，抑制率達(dá)到44.90%?？喽〔瓒喾幽軌蛎黠@抑制熒光假單胞菌生物被膜的形成，且濃度與生物被膜形成率呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌的生長(zhǎng)無(wú)影響，在其菌液密度基本一致的情況下，苦丁茶多酚可以抑制其生物被膜的形成，圖9 為苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的影響顯微鏡觀察結(jié)果圖。

圖9 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)影響的光學(xué)顯微鏡圖（100×）Fig.9 Effects of Kuding tea polyphenols on biofilm of P. fluorescens under optical microscope（100×）

由圖9 可見(jiàn)，對(duì)照組（圖9-1）的菌體成大片聚集膜狀，比較致密，外凸，能夠牢固粘附在載玻片表面，生物膜形成較成熟；處理組（圖9-2～5）的生物膜細(xì)胞密度、細(xì)胞團(tuán)塊的大小隨著苦丁茶多酚濃度的升高而降低，0.5 mg/mL 苦丁茶多酚處理組的菌體生物膜產(chǎn)生空隙，呈薄片的網(wǎng)狀分布，形成稀疏的小菌落粘附在載玻片表面，1.0 mg/mL 以上苦丁茶多酚處理組的生物膜形態(tài)逐漸被破壞，呈稀疏狀分散，顏色逐漸變淺，菌體膜狀物逐漸稀疏，單個(gè)分布呈分散狀在載玻片上。說(shuō)明苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌生物膜的形成有抑制作用，能夠減少并阻止生物膜的形成。顯微鏡觀察結(jié)果與生物被膜形成定量測(cè)定結(jié)果相吻合。茶多酚通過(guò)干擾細(xì)菌群體感應(yīng)中信號(hào)分子的合成從而影響細(xì)菌成膜能力[9]，對(duì)細(xì)胞膜形成起到了抑制作用，茶多酚對(duì)肺炎克雷伯菌的生物膜形成也具有類似抑制作用。其機(jī)制可能與細(xì)菌的群體感應(yīng)作用有關(guān)，本研究也進(jìn)一步證實(shí)了茶多酚的這種抑制機(jī)制。推測(cè)苦丁茶多酚具有干擾P. fluorescens粘附于接觸面的能力，可以通過(guò)調(diào)控?zé)晒饧賳伟娜后w感應(yīng)活性來(lái)調(diào)控其生物被膜的生成。

2.7 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌群集性與泳動(dòng)性的影響

群集和泳動(dòng)是細(xì)菌通過(guò)鞭毛介導(dǎo)的的兩種遷移方式，主要指細(xì)菌在大于0.45%或小于0.45%的瓊脂培養(yǎng)基表面遷移[30]。圖10 為亞抑菌濃度下苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌群集與泳動(dòng)性的抑制效果圖。

圖10 顯示，熒光假單胞菌在群集及泳動(dòng)平板表面培養(yǎng)24 h 后，有向外遷移的趨勢(shì)，對(duì)照組（圖10A-1、B-1）遷移能力最強(qiáng)，苦丁茶多酚處理組隨著濃度的升高，遷移擴(kuò)散直徑逐漸減小，表明苦丁茶多酚能有效地抑制熒光假單胞菌的群集和泳動(dòng)能力，抑制活性與質(zhì)量濃度存在劑量依賴性，這與孫曉佳等[1]及陳桂芳[31]研究結(jié)果相似。說(shuō)明苦丁茶多酚能夠調(diào)控?zé)晒饧賳伟倪w移（群集和泳動(dòng)），從而干擾了鞭毛吸附于附著物的能力[32]，進(jìn)而抑制其致腐能力。

圖10 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌群集（A）、泳動(dòng)性（B）的影響Fig.10 Effects of Kuding Tea polyphenols on swarming（A）and swimming（B）of P. fluorescens

圖11 為苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌運(yùn)動(dòng)區(qū)面積和直徑的影響結(jié)果。從圖11 可以看出，隨著苦丁茶多酚的濃度增加，P. fluorescens遷移受到了一定的抑制，群集及泳動(dòng)的直徑及面積與對(duì)照相比，均明顯減弱，苦丁茶多酚濃度超過(guò)1.0 mg/mL 時(shí)，減小趨勢(shì)顯著（P<0.05）；當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌群集和泳動(dòng)（直徑）的抑制率分別達(dá)到79.56%和90.12%。

圖11 苦丁茶多酚對(duì)熒光假單胞菌運(yùn)動(dòng)區(qū)面積和直徑的影響Fig.11 Effects of Kuding tea polyphenolson diameter and area of the motility zone of P. fluorescens

泳動(dòng)有利于細(xì)菌生物膜的形成以及細(xì)菌在宿主表面的黏附聚集[19]。細(xì)菌遷移運(yùn)動(dòng)在生物被膜形成過(guò)程中具有極其重要的作用[1,32]，苦丁茶多酚對(duì)P.fluorescens群集、泳動(dòng)的抑制作用結(jié)果，與上述抑制生物膜形成的結(jié)果可以互相驗(yàn)證。

單寧含量豐富的草莓可以通過(guò)抑制P.aeruginosa的群體感應(yīng)系統(tǒng)來(lái)干擾其遷移能力[21]。TP 是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，又叫茶單寧或茶鞣質(zhì)，主要包括黃烷醇類（兒茶素）、黃酮類、黃酮醇類、花色苷類、酚酸類等成分，特別是兒茶素含量達(dá)60%～80%[33]，占茶葉干重的30%～40%[34]。黃旭鎮(zhèn)[10]研究認(rèn)為，茶多酚通過(guò)其主要成分兒茶素類化合物，調(diào)控腐敗希瓦氏菌QS 的形成及腐敗指標(biāo)?？喽〔瓒喾又悬S烷醇類也是主要成分，黃烷醇類物質(zhì)中又以兒茶素類物質(zhì)為主[12]。推測(cè)苦丁茶多酚的群體感應(yīng)活性與其多酚中兒茶素成分更相關(guān)。曾亮等[35]研究發(fā)現(xiàn)，兒茶素25～80 ℃時(shí)抑菌效果最好，熱穩(wěn)定性高，且活性不受溫度的影響，在酸性條件下更穩(wěn)定。本研究所制備的苦丁茶多酚與曾亮等的研究報(bào)道相似，提取溫度高達(dá)90 ℃，同時(shí)制備過(guò)程中，用強(qiáng)酸轉(zhuǎn)溶，60 ℃烘箱干燥，活性依然保持，顯示出苦丁茶多酚良好的熱穩(wěn)定性及酸穩(wěn)定性，揭示苦丁茶多酚作為群體感應(yīng)抑制劑具有良好的應(yīng)用前景。

3 結(jié)論

以紫色桿菌CV026 為報(bào)告菌株，通過(guò)添加外源信號(hào)分子，證明了苦丁茶多酚在亞抑菌濃度下，對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)不產(chǎn)生影響，能夠顯著抑制細(xì)菌的群體感應(yīng)活性，抑制CV026 紫色菌素的產(chǎn)生，苦丁茶多酚濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，紫色菌素生成抑制率達(dá)到68.89%；在該濃度下，對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性抑制率為80.68%，脂肪酶活性抑制率53.50%，生物被膜形成抑制率44.90%，群集和泳動(dòng)能力的抑制率分別達(dá)到79.56%和90.12%；抑制作用具有濃度依賴性，制備過(guò)程中發(fā)現(xiàn)苦丁茶多酚具有較好的熱穩(wěn)定性及酸穩(wěn)定性，研究結(jié)果可以為其天然群體感應(yīng)抑制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。