三種香茅精油的化學成分及體外抗氧化和抗炎活性評價

石小翠，曹冬花，李 佳，魯建美，宋興震，羅明楚，肖春芬，許又凱,*

（1.中國科學院大學生命科學學院，北京 100049；2.中國科學院西雙版納熱帶植物園，云南勐臘 666303；3.南華大學附屬長沙中心醫(yī)院，湖南長沙 410004；4.普洱學院生物與化學學院，云南普洱 665000）

香茅屬（Cymbopogon）植物是禾本科植物的一大重要類群，主要分布于非洲、亞洲和美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1?2]，我國主產(chǎn)于廣東、臺灣、海南、福建、廣西、四川、貴州和云南等省，在其生長地區(qū)，廣泛用作食品和藥品。在泰國、新加坡、越南等東南亞國家，人們用香茅草（又名檸檬草，C.citratus）白色根莖做菜，或?qū)⑾忝┎萸薪z放于做好的米粉、蔬菜或肉類上, 或作為芳香調(diào)料與肉類一起烹飪[3]。在印度，檸檬草和曲序香茅（C. flexuosus）用于治療發(fā)燒和消化系統(tǒng)疾病[1]。同時由于香茅屬植物精油具有殺蟲[4?7]、抗腫瘤[8?9]、治療HIV 陽性并發(fā)癥鵝口瘡[10]、抗炎[11?13]、抗氧化[14?15]和殺菌[16?19]等多種生物活性，廣泛應用于食品、藥品、化妝品等行業(yè)[1]。

精油又稱揮發(fā)油，是多種揮發(fā)性物質(zhì)的混合物，成分復雜多樣。受地理位置、環(huán)境、氣候和采收季節(jié)等多種因素的影響，不同香茅屬植物精油的主成分及含量具有較大差異[20]。例如PADALIA[21]等對印度地區(qū)種植的蕓香草精油成分分析時，發(fā)現(xiàn)精油中主成分為順-1-甲基-4-異丙基-2-環(huán)己烯-1-醇（26.7%），而CHAUHAN 等[22]研究種植于喜馬拉雅山底部的蕓香草時，發(fā)現(xiàn)其主成分為反式檸檬醛（25.9%）。盡管如此，大多數(shù)的研究表明香茅屬植物含順式檸檬醛和反式檸檬醛的比例較高，精油中主要成分多為烯萜、酚、醇[20]。已有研究表明香茅屬植物精油具有良好的抗氧化活性，應用于營養(yǎng)食品、功能食品配方中，可以延緩食品中的脂質(zhì)氧化[14,20]。民族藥理學報道了香茅屬植物在消炎鎮(zhèn)痛方面具有悠久的使用歷史[1,20]，現(xiàn)代科學研究對一些香茅屬植物精油進行體外抗炎活性測定時，也發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎生物活性[23]，但是香茅屬植物中除檸檬草以外，其他植物精油的抗氧化活性和抗炎活性研究較為缺乏。

本研究以中國科學院西雙版納熱帶植物園內(nèi)資源豐富的爪哇香茅（C. winteranus）、檸檬草（C.citratus）和蕓香草（C. distans）為研究材料，測定了這三種植物精油的化學成分、體外抗氧化和抗炎活性，以便提高我們對于香茅屬植物精油的認知，為香茅屬植物資源開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬草、爪哇香茅和蕓香草 均于2018 年8 月采自中國科學院西雙版納熱帶植物園（以下簡稱版納植物園），由版納植物園肖春芬高級實驗師鑒定無誤后，標本于干燥密封的條件下保存在版納植物園標本館內(nèi)，憑證標本號分別為SXC001、SXC0002 和SXC0003；小鼠單核巨噬細胞白血病細胞株RAW 264.7 購于中國科學院昆明動物研究所動物種質(zhì)資源庫；胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青/鏈霉素、DMEM 高糖培養(yǎng)基 以色列Biological Industries公司；抗壞血酸（維生素C，VC）、地塞米松（Dexamethasone，Dex） 上海阿拉丁生化科技公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、二甲基亞砜（DMSO） 北京索萊寶科技公司；細菌脂多糖（LPS） 美國Sigma 公司；Griess 試劑盒、 MTS（ 3-（ 4,5-Dimethylthiazole-2-yl） -5-[3-（ carboxymethoxy） phenyl]-2-（ 4-sulfonatophenyl） -2H-tetrazole-3-ium）試劑盒 美國Promega 公司；乙醇（分析純，AR） 天津大茂化學試劑廠。

安捷倫7890/5975C 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國安捷倫公司；NIB-100 倒置生物顯微鏡 寧波永新光學公司；QP-80 型CO2培養(yǎng)箱、TGL-16M 高速冷凍離心機、BSC-1100IIB2-X-X 生物安全柜 浙江鑫貝西生物技術(shù)公司；振蕩器 上海邁瑞爾化學技術(shù)公司；MK3 酶標儀 美國Thermo scientific 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph 公司；電加熱套 天津泰斯特儀器公司；HH-1 型水浴鍋 江蘇常州市鴻澤儀器公司；實驗中所用玻璃儀器 均為國產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物精油提取及成分鑒定

1.2.1.1 植物精油的提取 采集新鮮材料，去除干枯及腐爛部分，切碎。取約500 g 的樣品放于球形燒瓶中加入3000 mL 去離子水，采用同步蒸餾溶劑萃取法提取，水溶液一側(cè)150 ℃下加熱，有機溶劑乙醚側(cè)45 ℃水浴加熱，3 h 后收集精油的乙醚溶液，通過減壓蒸餾（?0.06 MPa，30 ℃）去除乙醚即得精油樣品，稱重后置于冰箱（4±2）℃保存?zhèn)溆?。植物精油得率由下式得出?/p>

1.2.1.2 精油成分鑒定 精油揮發(fā)性成分采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）進行鑒定，樣品使用正己烷稀釋至5 μg/mL，設(shè)置相應參數(shù)，采用自動進樣進行檢測。

GC 條件：色譜柱：Agilent HP-5MS 石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：40 ℃保持1 min，以3 ℃/min 升至150 ℃，然后以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min；載氣（He）流速6 mL/min，進樣口壓力90 kPa，進樣量1 μL；分流比30:1。

MS 條件：質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描范圍m/z 50～550。

成分鑒定：通過NIST08 數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜圖進行比對獲得初步鑒定結(jié)果，運用公式轉(zhuǎn)換物質(zhì)保留時間為保留指數(shù)，與相關(guān)文獻中氣相色譜的保留指數(shù)[24]比對，從而對精油的化學成分定性。色譜峰用相對面積歸一化法定量，計算各組分的相對含量。保留指數(shù)由一系列直鏈烷烴（C8～C28）作為參考，計算公式為：

式中，n 為未知化合物流出前的正構(gòu)烷烴所含的碳原子數(shù)，tr（n）和tr（N）分別為未知化合物流出前后正構(gòu)烷烴的保留時間，tr（unknown）為未知化合物的保留時間。

1.2.2 體外抗氧化活性測定方法（DPPH 法） 無水乙醇配制100 μmol/L 的DPPH 溶液，4 ℃避光保存，備用。預試驗時發(fā)現(xiàn)待測樣品的IC50值濃度范圍差異較大，因而從最高濃度起2 倍稀釋將樣品用無水乙醇配制為不同濃度范圍的待測液，檸檬草精油溶液的濃度范圍為0.8～0.05 mg/mL，爪哇香茅精油溶液的濃度范圍為10～0.63 mg/mL，蕓香草精油溶液的濃度范圍為4～0.25 mg/mL，以常用抗氧化劑抗壞血酸（Vc，濃度范圍為20～1.25 μg/mL）為陽性對照。取100 μL 待測液與100 μL DPPH 溶液混勻，在室溫下避光反應30 min 后，517 nm 波長下測吸光度值，每個樣品平行測定3 次取平均值，清除率按下式計算[25]：

式中，OD1為待測液+DPPH 的吸光度；OD2為待測液+無水乙醇的吸光度；OD3為DPPH 溶液+無水乙醇的吸光度。

1.2.3 體外抗炎活性測定方法

1.2.3.1 細胞培養(yǎng) RAW 264.7 細胞使用完全培養(yǎng)基（DMEM 高糖培養(yǎng)基中加入10%（V/V）胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素），置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d 傳代一次。

1.2.3.2 細胞活力測定 MTS 測定細胞活性的原理與MTT 類似，代謝活躍的巨噬細胞在脫氫酶產(chǎn)生的NADPH 和NADH 作用下可將MTS 還原為一種可溶于培養(yǎng)基的甲臜產(chǎn)物，生成甲臜量與活細胞數(shù)目呈正相關(guān)，測定吸光度可計算出相對細胞活力[25]。將處于對數(shù)生長期的RAW 264.7 細胞調(diào)整至細胞密度1×106個/mL，以100 μL/孔接種于96 孔板中。培養(yǎng)18 h 后，除去原有培養(yǎng)基，加入100 μL 含有不同濃度精油的培養(yǎng)基（8、4、2、1 和0.5 μg/L），空白組只加入培養(yǎng)基，每組設(shè)3 個平行。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，采用MTS 試劑盒檢測精油對RAW 264.7 細胞活力的影響[26]，酶標儀492 nm 下測定OD 值，計算細胞存活率。

1.2.3.3 一氧化氮（NO）生成量測定方法 將處于對數(shù)生長期的 RAW 264.7 細胞調(diào)整至細胞密度1×106個/mL，以100 μL/孔接種至96 孔板，用1 μg/mL LPS進行誘導刺激，同時加入待測精油（濃度從8 μg/mL開始2 倍稀釋）處理，設(shè)置不含藥物組、地塞米松（Dex）陽性藥物組和空白培養(yǎng)基組做對照。培養(yǎng)24 h 后收集上清液，按Griess 試劑盒說明書檢測上清液中的NO 含量[27]，并計算NO 生成抑制率，從而計算半數(shù)抑制濃度（IC50值）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010（美國Microsoft 公司）、SPSS Statistics 25（美國IBM 公司）進行分析，Origin 2017（美國OriginLab 公司）進行圖處理，所有結(jié)果以平均值±SD（標準偏差）表示。組間比對采用單因素方差分析，P 值小于0.05 具有統(tǒng)計學意義，采用回歸分析計算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種香茅屬植物精油的化學成分分析

三種香茅屬植物檸檬草、爪哇香茅和蕓香草的精油得率分別為0.22%、0.9%、0.37%（Wt%，鮮重）。三種植物精油共鑒定出54 種成分，其中檸檬草22 種（占精油總含量的79.10%）、爪哇香茅25 種（占精油總含量的91.40%）、蕓香草26 種（占精油總含量的96.48%），具體如表1 所示。三種植物精油的成分差異較大，檸檬草的主要成分為反式檸檬醛（36.12%）、順式檸檬醛（26.60%）、月桂烯（8.83%），與LI 等[28]的研究結(jié)果基本一致；爪哇香茅主要成分為（+）-香茅醛（37.85%）、香葉醇（15.48%）、香茅醇（7.52%），與CHAGONDA 等[29]報道的主成分相同，但含量有所差異；蕓香草的主要成分為香葉醇（34.76 %）、乙酸香葉酯（18.95%）、胡椒酮（7.09%）、甲基丁香酚（6.72%），而PADALIA 等[21]研究蕓香草精油時發(fā)現(xiàn)香葉醛為含量最高的物質(zhì)，與本研究結(jié)果有差異。這三種植物的精油的主成分及含量與前人的研究相比，含量或成份有所差異，這可能是由于采收季節(jié)、氣候、提取方法、分析儀器及植物生長小環(huán)境差異等原因引起的。

表1 香茅屬三種植物精油化學成分Table 1 Chemical compositions of the essential oils from three Cymbopogon plants

從表2 中可看出，三種香茅屬植物精油的各類化合物中的萜烯類、萜醇類、萜酯、萜醛類等萜類物質(zhì)占比較大，爪哇香茅、檸檬草和蕓香草精油中的萜類物質(zhì)總含量分別為 89.91%、 76.35%以及80.49%。雖然這三種植物精油的主要成分都為萜類，但各精油中萜類物質(zhì)的主要化合物類型不同，檸檬草精油的萜類化合物主要類型為萜醛類化合物（63.05%），爪哇香茅精油中萜類化合物主要類型為萜醇類化合物（30.43%）和萜醛類（38.48%），蕓香草精油的萜類化合物主要類型為萜醇類化合物（39.06%）。

表2 香茅屬三種植物精油化合物類型匯總表Table 2 Compound types of essential oils from three Cymbopogon plants

2.2 三種香茅屬植物精油的抗氧化活性評價

DPPH 自由基的清除程度可反映物質(zhì)的抗氧化活性[25]。為了了解三種香茅屬植物精油的抗氧化活性，實驗測定了在不同濃度下精油對DPPH 自由基的清除率，結(jié)果如圖1 所示。爪哇香茅濃度由0.05 mg/mL 上升到0.80 mg/mL 時，DPPH 自由基的清除率由22.93%上升到58.56%；檸檬草濃度由0.63 mg/mL 上升到10.00 mg/mL 時，DPPH 自由基的清除率由25.83%上升到67.54%；蕓香草實驗濃度由0.25 mg/mL 上升到4.00 mg/mL 時，DPPH自由基的清除率由26.66%上升到56.35%；抗壞血酸濃度由1.25 μg/mL 上升到20.00 μg/mL 的時，DPPH 自由基的清除率明顯上升，由18.20%上升到89.81%。因此，三種香茅屬植物精油及陽性對照藥物抗壞血酸對DPPH 自由基的清除率與樣品濃度相關(guān)，DPPH 自由基的清除能力隨著樣品濃度的增大而增強，呈一定的劑量依賴性。三種香茅屬植物精油的IC50值分別為（0.417±0.119）mg/mL（爪哇香茅）、（3.481±0.842）mg/mL（檸檬草）和（2.528±0.96）mg/mL（蕓香草），抗氧化活性高低依次為爪哇香茅、蕓香草、檸檬草。爪哇香茅（主含香茅醛）的抗氧化活性高于蕓香草（主含香葉醇），與楊欣等[30]報道的爪哇香茅精油的高沸點提取段（主含香葉醇）抗氧化活性高于低沸點提取段（主含香茅醛）有差異，表明蕓香草與爪哇香茅的抗氧化活性差異可能不是由主成分差異引起的，它們的抗氧化活性差異可能是精油的各個組分協(xié)同效應引起的。此外，三種植物精油的萜類物質(zhì)總含量高低與抗氧化活性大小排序相同，表明香茅屬植物精油的抗氧化活性可能與萜類物質(zhì)的總含量有關(guān)。然而，三種植物精油的IC50值均高于陽性對照品抗壞血酸的IC50值（0.005±0.002）mg/mL，說明三種植物精油的抗氧化活性均弱于抗壞血酸。

圖1 各物質(zhì)對DPPH 自由基清除率的影響Fig.1 DPPH radical scavenger activity

2.3 三種香茅屬植物精油對RAW 264.7 細胞活力的影響

在相對細胞活力明顯下降的劑量下，精油對于細胞的損傷過強，對LPS 炎癥誘導模型的NO 生成量有一定的影響。為確定待測樣品的適宜實驗濃度，本實驗測定了不同濃度下三種香茅屬植物精油處理RAW 264.7 細胞時的細胞活力。如圖2 所示，與空白對照相比較，三種香茅屬植物精油僅在實驗濃度8 μg/mL 下對RAW 264.7 細胞活力具有極顯著（P<0.01）的抑制作用；在低劑量0.5～4 μg/mL 濃度下，RAW 264.7 細胞活力有逐漸增強的趨勢，并且爪哇香茅精油在4 μg/mL 濃度下和檸檬草精油在4、2 μg/mL 的濃度下對RAW 264.7 細胞的活力具有明顯（P<0.05）的促進作用。該結(jié)果表明三種香茅屬植物精油在一定的濃度范圍內(nèi)對RAW 264.7 細胞活力具有一定促進作用，但過高濃度的精油會對RAW 264.7 細胞造成損傷，細胞活力被顯著抑制，因此三種香茅屬植物精油的使用濃度宜在4 μg/mL 以下。

圖2 三種香茅屬植物精油對RAW 264.7 細胞活力的影響Fig.2 Effect of the essential oils of three Cymbopogon plants on RAW 264.7 cells viability

2.4 三種香茅屬植物精油對LPS 誘導RAW 264.7 細胞生成NO 的影響

NO 是一種高活性的氮自由基，由誘導型一氧化氮合酶（iNOS）產(chǎn)生，一氧化氮參與多種生物過程，是宿主先天免疫和多種病原體炎癥反應的重要介質(zhì)[31]。LPS 可刺激多種細胞如平滑肌細胞、巨噬細胞和肝細胞等，誘導iNOS 生成NO[32?33]，檢測LPS 致炎模型的NO 生成量可表示炎癥損傷程度。如圖3 所示，三種香茅屬植物爪哇香茅、檸檬草和蕓香草精油在不同的試驗濃度下，NO 的生成量均顯著（P<0.05）低于LPS 處理組，隨著精油濃度的增加NO 生成量總體呈下降的趨勢，表明在試驗濃度下，三種香茅屬植物精油均對LPS 誘導RAW 264.7 細胞炎癥狀態(tài)具有緩解作用，呈一定的劑量依賴性。三種植物精油在高于2 μg/mL 的濃度時，三種香茅屬植物精油的NO 產(chǎn)生量與陽性藥物組地塞米松的NO 生成量無顯著差異（P>0.05），表明三種植物精油在2～4 μg/mL的濃度下具有良好的抗炎效果，并且不損傷RAW 264.7 細胞，作為抗炎藥物、抗炎功能產(chǎn)品開發(fā)具有較大的潛力。

圖3 三種香茅屬植物精油對LPS 誘導RAW 264.7 細胞生成NO 的影響Fig.3 Effect of the essential oils of three Cymbopogon plants on NO production in LPS-induced RAW 264.7 cells

GBENOU 等[34]認為精油抗炎的物質(zhì)基礎(chǔ)可能是大量的醛分子。本研究中檸檬草精油含有63.05%的萜醛類物質(zhì)，爪哇香茅中含有萜醛類物質(zhì)37.85%，而蕓香草中幾乎不含萜醛類物質(zhì)，并且三種香茅精油的NO 生成抑制強度順序為檸檬草（IC50值為（0.472±0.121）μg/mL）>爪哇香茅（IC50值為（0.632±0.147）μg/mL）>蕓香草（IC50值為（0.669±0.131）μg/mL），檸檬草的抗炎活性最好，爪哇香茅次之，蕓香草的抗炎活性較差，抗炎活性與醛類物質(zhì)含量呈一定的相關(guān)性，表明香茅屬植物精油的抗炎活性高低可能與所含大量萜醛類物質(zhì)有關(guān)，與GBENOU 等[34]的觀點相符。但香茅屬植物精油的抗氧化活性與所含萜類物質(zhì)總含量的關(guān)系，以及香茅屬植物精油的抗炎活性與萜醛類物質(zhì)含量的相關(guān)性，還有待進行更為深入的實驗研究而探討。

3 結(jié)論

本研究測定分析出了三種香茅屬植物精油的54 種化合物，成分主要為萜類物質(zhì)，在研究三種香茅屬植物精油的體外抗氧化活性時發(fā)現(xiàn)精油的抗氧化活性與所含萜類物質(zhì)總量有一定的相關(guān)性。三種香茅屬植物精油具有一定的體外抗氧化活性，但弱于與常用強抗氧化劑抗壞血酸。三種香茅屬植物精油具有良好的體外抗炎能力，特別是在2～4 μg/mL 的濃度下，與陽性對照地塞米松對照（10 μmol/L）活性相當，其抗炎活性可能與香茅屬植物精油中萜醛類物質(zhì)含量有關(guān)。