鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展

郭寶琴，魏 暢，李 強(qiáng)

( 1.大連海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連 116023； 2.鹽城工學(xué)院 海洋與生物工程學(xué)院，江蘇 鹽城 224051 )

鯉皰疹病毒Ⅱ型(CyprinidherpesvirusⅡ,CyHV-2)，又稱為皰疹造血器官壞死病毒(或金魚(yú)造血器官壞死病毒)，屬皰疹病毒目、皰疹病毒科、鯉皰疹病毒屬(Cyprinivirus)。由于是第二個(gè)分離自鯉科魚(yú)類的皰疹病毒，該病毒被國(guó)際病毒系統(tǒng)分類委員會(huì)命名為鯉皰疹病毒Ⅱ型[1-2]。該病毒為雙鏈DNA病毒，無(wú)囊膜包被的核衣殼呈六角形或球形，囊膜包被下的病毒粒子成橢圓形，大小為175～200 nm[3]。該病毒在中國(guó)、日本、美國(guó)、澳大利亞、新西蘭及歐洲一些國(guó)家均有報(bào)道，可造成養(yǎng)殖鯽魚(yú)(Carassiusauratus)和金魚(yú)大量死亡。現(xiàn)階段針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的感染尚無(wú)有效的防控措施，不能有效地控制該病的暴發(fā)，因此，早診斷、早隔離、早防控是控制該病蔓延的有效手段。筆者基于國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究進(jìn)展，就鯉皰疹病毒Ⅱ型的免疫學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)分離等檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了詳細(xì)的分析與梳理，以期為鯉皰疹病毒Ⅱ型的及早診斷及防控提供借鑒和思路。

1 研究機(jī)構(gòu)分布

隨著鯉皰疹病毒Ⅱ型在世界范圍內(nèi)傳播，并對(duì)金魚(yú)、鯽魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，國(guó)內(nèi)外研究人員對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展了多方面的研究，以期做到病毒的早診斷、早隔離、早防控。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道共有60余篇，國(guó)內(nèi)授權(quán)相關(guān)發(fā)明專利10余項(xiàng)。國(guó)內(nèi)的研究機(jī)構(gòu)主要有上海海洋大學(xué)、中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)、蘇州大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京師范大學(xué)、西南大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)等(圖1、表1)。世界范圍內(nèi)，除我國(guó)外，日本、美國(guó)、德國(guó)、英國(guó)、捷克、法國(guó)、波蘭、意大利、澳大利亞以及印度等對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測(cè)方法也進(jìn)行了相關(guān)研究(圖2)。

圖1 國(guó)內(nèi)研究鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu)分布(以發(fā)表論文數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì))Fig.1 Distribution of research institutions which have investigated CyHV-2 detection technology in domestic (based on the number of published papers)

表1 國(guó)內(nèi)研究鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu)分布(以授權(quán)的發(fā)明專利進(jìn)行統(tǒng)計(jì))

圖2 國(guó)內(nèi)外關(guān)于鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)技術(shù)相關(guān)論文發(fā)表統(tǒng)計(jì)Fig.2 Statistics of the number of published papers on CyHV-2 detection technology in the worldwide

2 免疫學(xué)檢測(cè)方法

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)技術(shù)是利用抗原抗體特異性結(jié)合進(jìn)行免疫反應(yīng)的定性和定量檢測(cè)方法，是免疫學(xué)中的經(jīng)典檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、適用于基層等優(yōu)點(diǎn)。目前，已建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)技術(shù)主要有兩種：雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。徐曄等[4]以抗ORF90單克隆抗體作為捕獲抗體，酶標(biāo)抗ORF90多克隆抗體為檢測(cè)抗體，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)技術(shù)。該檢測(cè)方法具有良好的特異性，與鯉春病毒血癥病毒、流行性造血器官壞死病毒、傳染性造血器官壞死癥病毒、錦鯉皰疹病毒、傳染性胰腺壞死病毒、鮭魚(yú)傳染性貧血病毒、草魚(yú)出血病病毒等無(wú)交叉反應(yīng)；檢測(cè)靈敏度高，對(duì)40份無(wú)臨床癥狀的樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，夾心酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定方法的陽(yáng)性檢出率為45%，而PCR技術(shù)的陽(yáng)性檢出率僅為37.5%。此外，以抗ORF25單克隆抗體為檢測(cè)抗體，以酶標(biāo)羊抗鼠IgG為二抗，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型間接酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)技術(shù)。利用該技術(shù)對(duì)無(wú)感染和感染鯉皰疹病毒Ⅱ型銀鯽(Carassiusauratusgibelio)的脾臟、鰓、腎臟的總蛋白進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)鯉皰疹病毒Ⅱ型感染魚(yú)的脾臟、鰓和頭腎樣品中，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性(P/N值>2.1)，而未感染鯉皰疹病毒Ⅱ型魚(yú)組織檢測(cè)為陰性(P/N值<2.1)[5]。

2.2 免疫熒光檢測(cè)技術(shù)

3 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

3.1 普通PCR檢測(cè)技術(shù)

3.2 雙重PCR檢測(cè)技術(shù)

雙重PCR是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過(guò)程與普通PCR相同，但更為高效、快捷和準(zhǔn)確。羅丹等[17]針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型三聯(lián)體蛋白基因的兩段保守序列作為擴(kuò)增靶標(biāo)合成引物，建立了雙重PCR檢測(cè)技術(shù)，可特異性擴(kuò)增出218 bp和369 bp兩條目的片段，對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測(cè)限為3×102拷貝/μL，與基于相同基因而建立的普通PCR檢測(cè)技術(shù)(檢測(cè)限為2×104拷貝/μL)[14]相比，雙重PCR檢測(cè)的靈敏度更高。謝亞君等[18]針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型解旋酶基因建立的雙重PCR檢測(cè)技術(shù)，可特異性擴(kuò)增出800 bp和250 bp兩條目的片段，對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測(cè)限為1.4×104拷貝/μL。對(duì)不同地區(qū)采集的54尾異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)組織樣本進(jìn)行鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)，檢出率為72.2%。由此可見(jiàn)，鯉皰疹病毒Ⅱ型三聯(lián)體蛋白基因保守序列更適合作為雙重PCR檢測(cè)技術(shù)的擴(kuò)增標(biāo)靶。

3.3 巢式PCR檢測(cè)技術(shù)

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

3.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，是指針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件保溫30～60 min，完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，具有簡(jiǎn)單、快速、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，檢測(cè)成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。目前，已建立的鯉皰疹病毒Ⅱ型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)主要聚焦于病毒基因序列中較為保守的解旋酶基因[32-36]，不同學(xué)者建立的方法、檢測(cè)時(shí)間和靈敏度有所不同，其檢測(cè)時(shí)間最短可在30 min內(nèi)完成[33-34]，檢測(cè)靈敏度最高可達(dá)10-3拷貝/μL[35]。此外，還建立了針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型末端酶基因、DNA聚合酶基因和三聯(lián)體蛋白基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，經(jīng)驗(yàn)證均具有良好的特異性和靈敏度[18,37-39]。Li等[40]針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了一種環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增與橫向流動(dòng)試紙條相結(jié)合的一種新穎的檢測(cè)技術(shù)。該檢測(cè)需在64 ℃下反應(yīng)60 min，最低的檢測(cè)限為4.93×104拷貝/μL；特異性強(qiáng)，對(duì)鯉皰疹病毒Ⅰ型、錦鯉皰疹病毒、傳染性脾腎壞死病毒、傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對(duì)蝦白斑綜合征病毒以及青蟹呼腸孤病毒等多種病毒無(wú)交叉反應(yīng)。該方法耗時(shí)相對(duì)較長(zhǎng)，且靈敏度相對(duì)不高，但操作簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中的現(xiàn)場(chǎng)操作。郝貴杰等[41]也建立了一種結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增和核酸橫向測(cè)流的檢測(cè)方法，經(jīng)驗(yàn)證，此方法對(duì)低拷貝病毒樣本、保存條件較差的鯉皰疹病毒Ⅱ型DNA也有良好的檢測(cè)效果，對(duì)凍融次數(shù)多達(dá)20次的帶毒樣本依然具有100%的檢出率。

3.6 其他分子檢測(cè)技術(shù)

Ding等[42]針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了基于寡核苷酸探針的鯉皰疹病毒Ⅱ型熒光原位雜交(FISH)檢測(cè)技術(shù)，此技術(shù)具有良好的特異性，經(jīng)驗(yàn)證在43 ℃時(shí)熒光強(qiáng)度最大，探針質(zhì)量濃度在5 ng/μL時(shí)獲得足夠特異的熒光，但探針質(zhì)量濃度過(guò)高(50 ng/μL)，會(huì)導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增高而特異性降低。Wang等[43]通過(guò)制備鯉皰疹病毒Ⅱ型感染魚(yú)樣品的外周血細(xì)胞涂片，建立了原位雜交技術(shù)(ISH)，發(fā)現(xiàn)探針與感染鯉皰疹病毒Ⅱ型的魚(yú)樣品相結(jié)合呈藍(lán)色反應(yīng)，而與未感染魚(yú)樣品不結(jié)合。Yang等[44]根據(jù)GenBank中公布的鯉皰疹病毒Ⅱ型和鯉春病毒血癥病毒的核苷酸序列信息設(shè)計(jì)引物，建立了可同時(shí)檢測(cè)鯉皰疹病毒Ⅱ型和鯉春病毒血癥病毒的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，此方法對(duì)兩種病毒的最低檢測(cè)限約為88個(gè)拷貝，且具有良好的特異性。齊立斐等[45]以鯉皰疹病毒Ⅱ型基因保守區(qū)域片段為靶序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了一種集核酸快速提取和競(jìng)爭(zhēng)性互補(bǔ)介導(dǎo)核酸恒溫?cái)U(kuò)增(CAMP)微流控芯片于一體的檢測(cè)方法，其對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測(cè)限為10 拷貝/μL，與鯉皰疹病毒Ⅲ型無(wú)特異性擴(kuò)增，特異性良好，對(duì)89批次樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢出率為100%。郝中香等[46-47]分別通過(guò)設(shè)計(jì)合成ORF6基因和DNA聚合酶基因特異性引物及TaqMan探針，建立了鯉皰疹病毒Ⅱ型微滴式數(shù)字PCR(ddPCR)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型最低檢測(cè)限為3.77拷貝/μL。徐進(jìn)等[48]根據(jù)鯉皰疹病毒Ⅱ型的helicase基因編碼序列設(shè)計(jì)交叉引物，建立了一種交叉引物擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，此技術(shù)對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型具有良好的特異性；最低檢測(cè)限為10 拷貝/μL。Wang等[49]針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型建立了一種基于重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)與側(cè)向流動(dòng)免疫層析(LFD)技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方法。此方法在38 ℃水浴中反應(yīng)10 min，通過(guò)肉眼便可觀察到檢測(cè)結(jié)果，對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測(cè)限高達(dá)5 pg，比常規(guī)PCR技術(shù)靈敏度高近百倍，且均不與傳染性皮下及造血組織壞死病毒、對(duì)蝦白斑綜合征病毒、草魚(yú)出血病病毒、鯉春病毒血癥病毒、錦鯉皰疹病毒等水生病毒發(fā)生反應(yīng)，具有良好的特異性。此外，利用終點(diǎn)PCR技術(shù)和重組酶介導(dǎo)擴(kuò)增(RAA)技術(shù)對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型檢測(cè)，也表現(xiàn)出良好的特異性和靈敏度[50-53]。

4 細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)

5 展 望

眾所周知，鯉皰疹病毒Ⅱ型為引起金魚(yú)和鯽魚(yú)造血器官壞死病的病原，此病原給我國(guó)鯽魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)鯉皰疹病毒Ⅱ型的檢測(cè)國(guó)內(nèi)外建立了免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)、分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)分離技術(shù)等，這些技術(shù)均具有較好的靈敏度和特異性，但需要昂貴的儀器設(shè)備以及熟練的技能，比較適用于高技能的實(shí)驗(yàn)人員操作，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)等公開(kāi)場(chǎng)合具有一定的局限性，因此急需建立操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的方法。膠體金免疫層析檢測(cè)試紙條(CGIS)是一種具有檢測(cè)速度快、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單以及用肉眼即可判斷出檢測(cè)結(jié)果的檢測(cè)方法，其在水生動(dòng)物多種病原檢測(cè)中已表現(xiàn)出良好的優(yōu)越性，但目前仍未有關(guān)于鯉皰疹病毒Ⅱ型膠體金免疫層析試紙條相關(guān)的技術(shù)報(bào)道，下一步本實(shí)驗(yàn)室將致力于鯉皰疹病毒Ⅱ型膠體金免疫層析試紙條的開(kāi)發(fā)。