白斑狗魚Dmrta1基因克隆及其表達分析

李 菁，趙瑞陽，唐 露，張俊杰，古麗帕日·艾克拜

( 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052 )

果蠅Dsx基因和線蟲Mab-3基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A1(Dmrta1)基因是Dmrt家族的亞族Dmrta中的一員。Dmrt是目前關(guān)注度較高的性別相關(guān)基因家族之一，該家族成員廣泛參與到動物的性別決定與兩性分化中。Dmrt家族基因是目前已知保守的性別分化相關(guān)基因，最初是在果蠅的性別調(diào)控基因Doublesex中發(fā)現(xiàn)了DM結(jié)構(gòu)域[1]。在魚類、鳥類、哺乳類、爬行類均發(fā)現(xiàn)其存在，表明該基因在動物的進化過程中具有高度的保守性[2-5]。

目前，在動物中已克隆出Dmrt家族成員基因約有10個[6]。Dmrta基因家族成員包括Dmrta1(Dmrt4), Dmrta2 (Dmrt5), Dmrta3(Dmrt3)[7]。在小家鼠(Musmusculus)中，Dmrt4基因在性腺、肝臟、腎等組織中均有表達[8]。Dmrt4基因在半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)精巢中的表達量顯著高于卵巢[9]。江東能等[10]研究表明，Dmrt4基因在金錢魚(Scatophagusargus)精巢和卵巢及鰓中均有較高表達。鑒于Dmrta1基因廣泛參與了魚類的性別形成與分化，有必要研究其參與調(diào)控的分子機制。在脊椎動物的進化過程中，魚類作為低等動物有著舉足輕重的進化地位。對Dmrta1基因的研究有助于了解從低等的無脊椎動物到高等生物進化過程的性別決定機制。

白斑狗魚(Esoxlucius)，屬鮭形目、狗魚屬，分布于世界各大水域[11]。在我國主要分布于新疆額爾齊斯河流域[12]。白斑狗魚作為自然水域中的主要捕食者，攝食范圍廣，能適應(yīng)溫度范圍變化大的生活環(huán)境，生長迅速，營養(yǎng)價值高，是新疆地區(qū)額爾齊斯河流域重要的水產(chǎn)品之一。近年來對白斑狗魚的研究主要是對其生長性能、胚胎發(fā)育及外源性激素誘導(dǎo)性別發(fā)育等[13-15]。目前白斑狗魚的性別分化機制尚未闡明，關(guān)于Dmrta1基因在其性腺發(fā)育過程中的研究未見報道。筆者通過RT-PCR方法克隆得到白斑狗魚的Dmrta1基因，通過實時熒光定量PCR方法對白斑狗魚Dmrta1基因在生長發(fā)育不同階段的組織中表達情況進行分析，從而探討其在性別形成與分化中的作用，為白斑狗魚性別決定機制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚為本實驗室人工繁殖的白斑狗魚仔魚，繁殖所用親魚購于烏魯木齊北園春市場的烏倫古湖野生白斑狗魚，飼養(yǎng)于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)實驗室，取180日齡和320日齡的白斑狗魚，雌雄各3尾，共12尾。將魚體解剖，分別取出腦、肌肉、腎臟、性腺、頭腎、鰓、腸等組織，將其迅速置于液氮里，于超低溫冰箱中-80 ℃保存。

1.2 試驗試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScritTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(寶生物工程大連有限公司)、Trizol試劑(Invitrogen公司)、熒光定量PCR檢測試劑盒(TIANGEN生化科技有限公司)、PCR試劑盒TaKaRa TaqTM(寶生物工程大連有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的白斑狗魚轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果序列(NC_047592.1)，根據(jù)已報道鮭科魚類的Dmrta1保守區(qū)域設(shè)計引物Dmrta1-F-Primer及Dmrta1-R-Primer，用于白斑狗魚Dmrta1基因擴增。根據(jù)克隆得到的Dmrta1基因序列設(shè)計熒光定量PCR特異性引物Dmrta1-GSP-F和Dmrta1-GSP-R；采用實驗室之前設(shè)計的白斑狗魚的肌動蛋白(β-actin)基因引物Actin1F和Actin1R，上述引物均采用Primer 5.0設(shè)計，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 白斑狗魚Dmrta1基因克隆及熒光定量PCR引物

1.3.2 總RNA的提取和cDNA的制備

將180日齡、320日齡兩個時期的性腺(精巢、卵巢)、腦、肌肉、腎臟、頭腎、鰓、腸道、肝臟等8種不同的組織分別在加入液氮的研缽中充分研磨，用Trizol法對RNA進行提取，全程在冰上操作，用DEPC處理過的雙蒸水溶解上述得到的白色沉淀，將RNA放置于冰箱-80 ℃保存。用紫外光分光光度計檢測RNA的光密度值；用瓊脂糖凝膠電泳檢測各組織的總RNA的完整性。以500 ng的RNA為初始模板進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄步驟按照TaKaRa試劑盒說明書進行，cDNA于冰箱-20 ℃保存，用于后續(xù)熒光定量PCR使用。

1.3.3 Dmrta1基因的克隆

以白斑狗魚精巢的cDNA為起始模板，加入2.5 mmol/L dNTP Mixture，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Dmrta1-F/R-Primer各2 μL；TaKaRa TaqTM(5 U/μL)，0.5 μL；cDNA，3 μL；雙蒸水補齊至50 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃終止程序。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在1%的瓊脂糖凝膠電泳中以D2000 DNA Marker作為分子質(zhì)量標準進行檢測，并置于紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果，產(chǎn)物回收送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.3.4 Dmrta1基因的生物信息學(xué)分析

采用DNAMAN軟件將測序所得cDNA序列進行拼接，運用BLAST查詢該物種在數(shù)據(jù)庫中同其他物種的Dmrta1基因序列同源性相似程度；使用生物信息學(xué)網(wǎng)絡(luò)平臺上的ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)工具分析白斑狗魚Dmrta1基因序列的開放閱讀框，進一步推導(dǎo)出該基因的氨基酸序列；使用CD Search程序搜索該基因的蛋白功能結(jié)構(gòu)域；采用SMART分析蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域；運用ExPASy和Swiss-model分析Dmrta1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；采用DNAMAN軟件進行氨基酸序列多重對比；最后使用Clustal X和MEGA 5.1軟件基于鄰接法對其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.5 白斑狗魚Dmrta1基因的表達分析

采用相對定量的方法對白斑狗魚Dmrta1基因在2個時期不同組織的表達量進行測定。以各個組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為起始模板，選擇內(nèi)參β-actin基因、目標基因Dmrta1，分別對所選不同組織進行實時熒光定量PCR，每個樣品重復(fù)測定3次。實驗室采用BIO-RAD CFX 96定量PCR儀，SYBR Green I熒光染料。以20 μL為反應(yīng)體系，其中2×SuperReal PreMix Plus(TianGen)10 μL，正反向引物各0.6 μL，cDNA模板為1 μL，最后補齊無RNA酶單蒸水7.8 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，39個循環(huán)；95 ℃ 30 s。根據(jù)Dmrta1基因和β-actin基因，在各組織中擴增得到的Ct值，通過2-ΔCt法計算白斑狗魚各組織中Dmrta1基因的相對表達量。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤差。采用SPSS 21.0進行單因素方差分析，并使用LSD方法進行多重比較。

2 結(jié) 果

2.1 白斑狗魚Dmrta1基因的克隆和序列分析

將cDNA模板與特異性引物進行PCR擴增，最終產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，分子大小約1500 bp，長度符合目的基因序列。對測序片段進行拼接，獲得Dmrta1基因的cDNA序列，長度為1408 bp。通過與美國國立生物技術(shù)信息中心上已知的白斑狗魚轉(zhuǎn)錄組測序基因序列比對，相似性達99.7%。運用美國國立生物技術(shù)信息中心上ORF Finder對白斑狗魚Dmrta1基因的開放閱讀框進行查詢，得出1條序列長度為1302 bp的開放閱讀框，編碼433個氨基酸(圖2)。對開放閱讀框進行生物信息學(xué)分析，得到Dmrta1蛋白的分子質(zhì)量為36.047 ku，理論等電點為5.94。運用SMART對該基因的結(jié)構(gòu)功能域進行分析發(fā)現(xiàn)，Dmrta1基因具有2個保守結(jié)構(gòu)域，分別為DM和DMA結(jié)構(gòu)域。說明該基因符合Dmrt基因家族成員特征，在進化過程中具有高度的保守性。該DM結(jié)構(gòu)域共編碼47個氨基酸，將推導(dǎo)出的氨基酸序列與其他物種的DM結(jié)構(gòu)域進行對比，發(fā)現(xiàn)其與6種哺乳動物的DM結(jié)構(gòu)域完全一致(圖3)，而與其他3種動物僅有1個位點不同。運用Swiss-model預(yù)測白斑狗魚與黑猩猩(Pantroglodytes，XP_528576.1)Dmrta1基因的DM結(jié)構(gòu)域氨基酸的三維結(jié)構(gòu)模型圖(圖4)，對比發(fā)現(xiàn)，這1個氨基酸位點的差異并未影響DM結(jié)構(gòu)域的改變，表明Dmrta1基因的DM結(jié)構(gòu)域在不同物種的進化上具有高度的保守性。

圖1 白斑狗魚Dmrta1基因PCR擴增結(jié)果Fig.1 The PCR amplification result of Dmrta1 gene in northern pike E. lucius1.白斑狗魚擴增結(jié)果； M.DNA marker.1.the amplification result of E. lucius; M.DNA marker.

圖2 白斑狗魚Dmtra1基因的cDNA序列和推測的氨基酸序列Fig.2 cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of Dmtra1 gene in northern pike E. luciusATG為翻譯起始子，*為翻譯結(jié)束終止子.ATG indicates translation initiation codon ，* indicates translation termination codon.

圖3 Dmrta1基因DM結(jié)構(gòu)域的序列多重比對Fig.3 Multiple sequence alignment of DM domain of Dmrta1 gene

圖4 白斑狗魚(a)和黑猩猩(b)Dmrta1基因的DM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列模擬三維結(jié)構(gòu)Fig.4 Three dimensional structure comparison of DM domain in Dmrta1 gene from northern pike E. lucius (a) and chimpanzee P. troglodytes (b)

2.2 Dmrta1基因同源比較和進化分析

通過BLAST對白斑狗魚的Dmrta1蛋白進行氨基酸同源性分析發(fā)現(xiàn)，該氨基酸序列與美國國立生物技術(shù)信息中心上已公布的其他物種的Dmrta1氨基酸序列具有較高的相似性，結(jié)果顯示，氨基酸序列與銀大麻哈魚(XP_020326315.1)同源性為80.32%；與紅大麻哈魚(XP_029510939.1)同源性為80.09%；與虹鱒(XP_021433981.1)、大西洋鮭(Salmosalar，XP_014061928.1)的同源性分別為79.41%，79.64%，與黃金鱸(Percaflavescens，XP_028419844.1)同源性為63.95%。通過MEGA 5.1 軟件用鄰接建樹法對16個物種的Dmrta1氨基酸構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖5)，發(fā)現(xiàn)白斑狗魚與虹鱒、紅大麻哈魚的親緣關(guān)系最近，屬于同一分支。將該基因編碼的氨基酸序列與其他9個物種的氨基酸序列進行比對(圖6)，根據(jù)比對結(jié)果推測其保守特征序列。

圖6 白斑狗魚與其他物種Dmrta1基因的氨基酸序列比對分析Fig.6 Multiple sequence alignment analysis of amino acid sequences of Dmrta1 gene in northern pike E. lucius and other species為Dmrta1保守序列位置.Black box is the conserved sequence position of Dmrta1.

2.3 Dmrta1基因的定量表達分析及其在不同時期的表達差異

通過檢測2對引物的擴增效率基本一致，運用2-ΔCt法計算Dmrta1基因的相對表達量。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，白斑狗魚Dmrta1基因在不同日齡期的不同組織中的表達具有差異，Dmrtal基因只在白斑狗魚的鰓、性腺、肌肉中表達，在腸道和肝臟、腦、腎臟、頭腎中各齡期幾乎不表達(圖7～8)。

圖7 實時熒光定量PCR檢測的Dmrta1基因在白斑狗魚180日齡期不同組織的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of Dmrta1 gene detected in different tissues in 180 days old northern pike E. lucius by real-time PCR *為差異顯著(P<0.05)； **為差異極顯著(P<0.01)；下同.* indicates significant difference at P<0.05 level； ** indicates very significant difference at P<0.01 level； et sequentia.

圖8 實時熒光定量PCR檢測的Dmrta1基因在白斑狗魚320日齡期不同組織的相對表達量Fig.8 Relative expression levels of Dmrta1 gene detected in different tissues in 320 days old nothern pike E. lucius by real-time PCR

180日齡期，Dmrta1基因在精巢、鰓中有較高表達(圖7)。精巢的表達量顯著高于肌肉(P<0.05)，其他組織之間表達量不存在顯著性差異(P>0.05)。在180日齡的雌魚卵巢幾乎不表達；對比同一時期的雌雄性腺表達量可知，Dmrta1基因在精巢中的表達量顯著高于卵巢(P<0.05)。

在320日齡期，Dmrta1基因在精巢中的表達依然顯著高于卵巢(P<0.05)(圖8)，并且在320日齡期卵巢中開始出現(xiàn)微量的表達。對比兩個時期精巢的表達量可知，在320日齡期精巢的表達量是180日齡期的2倍，Dmrta1基因在精巢中的表達呈明顯增長趨勢。

3 討 論

3.1 白斑狗魚Dmrta1基因結(jié)構(gòu)預(yù)測及進化位的關(guān)系

Dmrta1基因是Dmrt基因家族中的一員，Dmrt家族成員共同特征是都含有一個鋅指DM結(jié)構(gòu)域[3]，作為性別決定機制中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子可以與特異的DNA序列結(jié)合。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測，本試驗中的Dmrta1基因同樣存在著一個鋅指結(jié)構(gòu)的保守結(jié)構(gòu)域，推測其可以與DNA進行特異結(jié)合，從而在性別的分化及發(fā)育過程中起到調(diào)節(jié)作用。在本試驗中，白斑狗魚Dmrta1基因與其他6種哺乳動物的DM結(jié)構(gòu)域一致，說明在進化過程中該結(jié)構(gòu)域高度保守。在人類中，Dmrt基因位于人常染色體區(qū)域的9P24.3[4]，它的表達模式與性別決定基因SRY相似，參與了雄性的性別決定過程，僅在雄性性腺中表達。而魚類的原始生殖腺具有雙向發(fā)展?jié)摿Γ譃榇菩郛愺w型和雌雄同體型[16]。因此研究魚類的性別控制機制更加復(fù)雜。

通過氨基酸同源性的比對可知，白斑狗魚Dmrta1基因同目前已報道的眾多物種Dmrta1氨基酸序列具有75%以上的同源性，表明Dmrta1基因在不同物種中是高度保守的。通過選擇處于動物分類系統(tǒng)中不同進化位的各類動物Dmrta1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)白斑狗魚與同屬鮭科的魚類聚為一個分支，遺傳距離最近，與兩棲綱、爬行綱、哺乳綱的分支遺傳距離較遠。從分子進化關(guān)系上看該基因符合傳統(tǒng)的物種進化理論。

3.2 Dmrta1基因的表達模式分析

通過實時熒光定量PCR技術(shù)獲得了白斑狗魚Dmrta1基因在不同時期不同組織的相對表達量，結(jié)果表明，Dmrta1基因在精巢中表達，在卵巢中幾乎無表達。Dmrta1基因在白斑狗魚精巢的不同時期表達量有所差異，隨著日齡期的增加，表達量呈上升趨勢。表明Dmrta1(Dmrt4)基因?qū)Π装吖肤~的精巢生長發(fā)育可能具有維持作用。有研究表明，在小鼠的各個組織中，Dmrt1基因只在睪丸中表達，其他組織中不表達，說明該基因?qū)π坌跃驳姆只鹬匾饔肹3]；黑斑蛙(Rananigromaculata)[17]Dmrt4基因在雌、雄成體中的各組織表達無明顯差異；周麗青等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在蝦夷扇貝(Patinopectenyessoensis)性別決定機制中，pyDmrt4基因與雄性的性別形成有關(guān)；吳啟迪等[19]對菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)Dmrt4-like-2基因的研究發(fā)現(xiàn)，通過雌二醇處理，該基因在精巢中的表達量顯著上調(diào)，說明其與性別分化、性腺發(fā)育形成有關(guān)。白斑狗魚Dmrta1(Dmrt4)基因在精巢中的表達量顯著高于卵巢，這與紅鰭東方鲀[20]、青鳉(Oryziaslatipes)[21]Dmrt4基因在精巢中表達量高于卵巢，Dmrt4基因在精巢中較高表達，在卵巢中較低表達情況相一致。在本試驗中，Dmrta1基因在雌、雄白斑狗魚的鰓中均有較高表達，并且表達量隨時間的延長而呈現(xiàn)上升趨勢，這與Wen等[22]的研究結(jié)果——Dmrta1基因在褐牙鲆(P.olivaceus)的精巢中表達量顯著高于雌性卵巢，并且在鰓中表達也顯著高于其他組織相符合。這說明Dmrta1基因可能與性別的形成和分化有關(guān)，并且在一定程度上對鰓弓的形成和發(fā)育過程起重要作用。

4 結(jié) 論

本試驗通過克隆得到白斑狗魚Dmrta1基因，并對其進行生物信息學(xué)分析，該基因具有典型的DM、DMA保守結(jié)構(gòu)域。運用實時熒光定量PCR對Dmrta1基因在雌、雄各組織中的表達情況進行了分析，得到Dmrta1基因在精巢及卵巢中的表達量存在顯著差異，并且在雌、雄的鰓中均有表達；可以推斷，該基因在維持精巢的發(fā)育及鰓弓的形成中具有重要的支持作用，而有關(guān)Dmrta1基因在白斑狗魚精巢中的作用機理，則有待今后進一步研究。