干擾PIM3的表達對人胰腺癌AsPC-1細胞增殖和凋亡的影響及作用機制研究

陳慧，常瑛，劉振國

西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科臨床藥學(xué)室，西安 710000

由于早期癥狀不明顯、發(fā)現(xiàn)晚、預(yù)后差，胰腺癌已經(jīng)成為全球病死率最高的惡性腫瘤之一。迄今為止，胰腺癌的臨床治療策略仍僅局限于手術(shù)切除、化療和放療等傳統(tǒng)的治療方法，治療效果不理想。因此，尋找更加有效的治療策略對胰腺癌的治療至關(guān)重要。

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展有明顯進步，研究者開始從分子和基因水平研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展。PIM3作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在胰腺癌中異常表達，主要通過磷酸化特異性底物使其失去活性，導(dǎo)致細胞增殖增多、凋亡減少，表現(xiàn)為細胞增殖相關(guān)的分子Ki-67的表達升高，促凋亡分子的表達上調(diào)，如B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2），而抑制凋亡相關(guān)的分子的表達下調(diào)，如Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和caspase 3，最終促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前關(guān)于PIM3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中作用的研究較少。RNA沉默技術(shù)，作為一種重要的基因調(diào)控機制越來越受到臨床的重視，包括小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。因此，本研究通過設(shè)計和合成

PIM3

siRNA，體外轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細胞，觀察抑制

PIM3

的表達對胰腺癌細胞AsPC-1增殖和凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、主要試劑和儀器

人胰腺癌AsPC-1細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。裸鼠購自北京華阜康生物有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自浙江天杭生物公司，0.25%胰蛋白酶購自上海生工生物有限公司，四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl terazolium，MTT）購自美國賽默飛公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司，

Ki-67

、

Bcl-2

、

BAX

、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物均于華大基因公司合成，Jet PRIME DNA&siRNA體外轉(zhuǎn)染試劑購自Polyplus公司，山羊抗兔β-actin單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗兔PIM3單克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物有限公司，T7體外逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國TakaRa公司。Galius FACS流式細胞儀購自美國貝克曼公司，Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀購自美國Corbett Research公司，HBS-1101酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞轉(zhuǎn)染 人胰腺癌AsPC-1細胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期、生長狀況良好的人胰腺癌AsPC-1細胞接種至6孔板中，1×10/孔，待細胞貼壁增殖至50%左右，將加入抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基換成無抗生素的培養(yǎng)基。利用轉(zhuǎn)染試劑Jet PRIME，將

scramble

siRNA（陰性對照，10 μg）和

PIM3

siRNA（干擾

PIM3

的表達，10 μg）分別轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細胞，分別作為scramble-siRNA組和PIM3-siRNA組，以1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）作為溶劑對照，將100 μl的PBS轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細胞，作為溶劑對照組。轉(zhuǎn)染6～8 h后將無抗生素的DMEM培養(yǎng)基換成加入抗生素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h（用于實時熒光定量RT-PCR檢測mRNA的表達）或72 h[用于蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測相關(guān)蛋白的表達]。1.2.2 實時熒光定量RT-PCR 檢測人胰腺癌AsPC-1細胞

PIM3

、

Bcl-2

、

BAX

、

Ki-67

、

caspase3

mRNA的相對表達量 取對數(shù)生長期的scramblesiRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對照組人胰腺癌AsPC-1細胞接種于96孔板中，1×10/孔，培養(yǎng)48 h后PBS充分洗滌后，參照Trizol試劑盒說明書提取細胞總RNA。按照說明書配制反應(yīng)體系：dNTP mix（4 μl）、primer mix（2 μl）、RNA 和 RNase-free wate（r最高13 μl），用70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min。繼續(xù)向反應(yīng)液中加入以下試劑：5×RT Buffe（r4 μl）、DTT（2 μl）和HiFi Scrip（t1 μl），50℃孵育15 min，85℃孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA進一步擴增，加入cDNA（4 μl）、SYBR Green mix（8 μl）、正向引物（2 μl）、反向引物（2 μl）。PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃45 s，50個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保持。以

GAPDH

為內(nèi)參，2法計算目的基因的相對表達量。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 MTT 法檢測人胰腺癌AsPC-1細胞增殖能力 取對數(shù)生長期的scramble-siRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對照組人胰腺癌AsPC-1細胞接種于96孔板中，1×10/孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，離心，去上清，加入 100 μl 二 甲 基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。采用酶標(biāo)儀測定OD570和OD630各孔的吸光度以O(shè)D630為校正值，計算細胞增殖抑制率=[1-（實驗組-空白對照組）（/陰性對照組-空白對照組）]×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細胞儀檢測人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡能力 取對數(shù)生長期的scramble-siRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對照組人胰腺癌AsPC-1細胞培養(yǎng)48 h后，采用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡能力，參照說明書操作，最后用流式細胞儀檢測。將Annexin V與PI聯(lián)合使用時，早期凋亡細胞被標(biāo)記為Annexin VPI，而晚期凋亡細胞呈雙陽性Annexin VPI，本實驗統(tǒng)計前期凋亡和晚期凋亡的綜合凋亡比例。

1.2.5 Western blot 法檢測人胰腺癌AsPC-1細胞PIM3、Bcl-2、BAX、caspase3蛋白的相對表達量取對數(shù)生長期的scramble-siRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對照組人胰腺癌AsPC-1細胞培養(yǎng)72 h后，收集細胞，依據(jù)試劑盒說明書提取總蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在 5%的脫脂牛奶中，室溫下?lián)u動封閉1 h。然后加入TBST洗滌3次，每次10 min，加入一抗（山羊抗兔PIM3、β-actin單克隆抗體，稀釋比例均為1∶1000），4℃過夜孵育。在室溫下洗膜，加入二抗（2%的脫脂牛奶按照1∶2000的比例稀釋），室溫孵育1 h。洗滌3次，每次10 min。最后進行發(fā)光顯影，Image J軟件分析蛋白表達灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算PIM3蛋白的相對表達量。

1.2.6 皮下荷瘤小鼠模型的建立及治療 30只6周齡雄性非肥胖糖尿病/嚴重聯(lián)合免疫缺陷（nonobesediabetic/severecombined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠，體重（20±1）g，全部飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中。常規(guī)收集AsPC-1細胞并計數(shù)，于每只小鼠腋下左側(cè)荷1×10個細胞，1周后，所有小鼠均有腫瘤出現(xiàn)。隨后將30只荷瘤小鼠隨機分為control組、陰性對照組和實驗組，每組10只，control組小鼠瘤內(nèi)注射 1×PBS 共 100 μl，陰性對照組和實驗組小鼠瘤內(nèi)分別注射25 μg的

scramble

siRNA和

PIM3

siRNA，100 μl體系。各組小鼠均治療4次后，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長和寬，計算腫瘤體積=長×寬/2，處死小鼠，取出腫瘤，進行稱重。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PIM3mRNA和PIM3蛋白相對表達量的比較

轉(zhuǎn)染后，PIM3-siRNA組細胞

PIM3

mRNA和PIM3蛋白的相對表達量均明顯低于溶劑對照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 3組人胰腺癌AsPC-1細胞PIM3 mRNA和PIM3蛋白相對表達量的比較（±s）

2.2 干擾PIM3的表達對人胰腺癌AsPC-1細胞增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，PIM3-siRNA組細胞的增殖抑制率均明顯高于溶劑對照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。干擾

PIM3

的表達對人胰腺癌AsPC-1細胞增殖相關(guān)基因

Ki-67

表達影響的結(jié)果顯示，PIM3-siRNA組細胞

Ki-67

mRNA的相對表達量明顯低于溶劑對照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表3、表4）

表3 轉(zhuǎn)染不同時間3組人胰腺癌AsPC-1細胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表4 3組人胰腺癌AsPC-1細胞增殖相關(guān)基因Ki-67 mRNA相對表達量的比較（±s）

2.3 干擾PIM3的表達對人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡能力的影響

轉(zhuǎn)染后，PIM3-siRNA組人胰腺癌AsPC-1細胞的凋亡率為（50.77±2.81）%，明顯高于溶劑對照組和scramble-siRNA組細胞的（2.33±0.12）%和（2.17±0.09）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。干擾

PIM3

的表達對人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡相關(guān)基因

Bcl-2

、

BAX

、

caspase 3

表達影響的結(jié)果顯示，PIM3-siRNA組細胞

Bcl-2

mRNA的相對表達量明顯低于溶劑對照組和scramble-siRNA組，

BAX

、

caspase 3

mRNA的相對表達量均明顯高于溶劑對照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。干擾

PIM3

的表達對人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX、caspase 3表達影響的結(jié)果顯示，PIM3-siRNA組細胞Bcl-2蛋白的相對表達量明顯低于溶劑對照組和scramble-siRNA組，BAX、caspase 3蛋白的相對表達量均明顯高于溶劑對照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表5、表6）

表5 3組人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、BAX、caspase 3 mRNA相對表達量的比較（±s）

表6 3組人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX、caspase 3蛋白相對表達量的比較（±s）

2.4 干擾PIM3的表達對荷瘤小鼠人胰腺癌AsPC-1細胞的影響

實驗組小鼠的腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均明顯低于control組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表7）

表7 3組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積的比較（±s）

3 討論

隨著分子生物學(xué)在腫瘤領(lǐng)域的發(fā)展，研究者開始從分子水平探討胰腺癌治療的新靶點，原癌基因也由此成為臨床關(guān)注和研究的重點。目前，腫瘤本身在胰腺癌發(fā)病中具有始動作用，可使某些促進腫瘤細胞增殖的分子異常，如PIM3?；蛎庖咧委熞殉蔀橹委熞认侔┯袘?yīng)用前景的可行策略，引起研究人員的廣泛關(guān)注。目前，研究者經(jīng)常采用siRNA技術(shù)抑制小分子基因片段，即靶向抑制目的基因的表達，其主要機制是雙鏈RNA被其特異核酸酶酶切降解，產(chǎn)生發(fā)揮作用的siRNA，這些siRNA通過與同源的靶序列互補結(jié)合而特異性降解目的片段，最終抑制目的基因的表達。該技術(shù)需要表達的元件較少且片斷較小，利于導(dǎo)入細胞內(nèi)，操作簡單。

有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用特異性靶向

PIM3

的siRNA能明顯抑制人肝癌細胞系HepG2和Hep3B在體外的增殖，并顯著誘導(dǎo)細胞早期凋亡；這種現(xiàn)象也發(fā)生在胰腺癌細胞中，若采用短發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）去干擾胰腺癌細胞系PANC.1和PCI35中PIM3的表達，細胞的增殖也會受到明顯抑制，細胞凋亡率也會明顯上升。但應(yīng)用siRNA技術(shù)對人胰腺癌AsPC-1細胞的生物學(xué)影響還未見報道。本研究結(jié)果顯示，

PIM3

siRNA可以明顯抑制人胰腺癌AsPC-1細胞的增殖，

PIM3

siRNA轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細胞后，

Ki-67

mRNA的相對表達量明顯降低，表明人胰腺癌AsPC-1細胞的增殖可以被

PIM3

siRNA抑制。本研究結(jié)果顯示，干擾PIM3的表達后，人胰腺癌AsPC-1細胞的凋亡率明顯升高，與既往研究結(jié)果一致。目前，學(xué)者們對細胞凋亡現(xiàn)象進行了廣泛、深入的研究，但凋亡的分子和生化機制仍未徹底明了，已經(jīng)形成的初步認識多源于對

Bcl-2

基因家族的研究。有報道指出，Bcl-2是細胞存活的促進因子，屬于膜整合蛋白，可保護腫瘤細胞免受DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡作用，Bcl-2還可與促凋亡因子BAX形成二聚體，若BAX的表達水平高于Bcl-2，BAX同二聚體的數(shù)量就會增多，從而促進了細胞凋亡。在凋亡通路中，caspase 3發(fā)揮著不可替代的作用，正常情況下，caspase 3以caspase 3酶原形式存在，且caspase 3酶原并沒有活性。當(dāng)受到機體內(nèi)部或外界刺激時，caspase 3酶原被激活，裂解為活性體，激活凋亡的級聯(lián)反應(yīng)，提示caspase 3是凋亡通路的關(guān)鍵執(zhí)行者。本研究對

PIM3

siRNA促進人胰腺癌AsPC-1細胞凋亡的機制進行了探討，結(jié)果表明，干擾

PIM3

的表達后，Bcl-2的表達受到抑制，BAX、caspase 3的表達被上調(diào)，最終促進了人胰腺癌AsPC-1細胞的凋亡。

本研究結(jié)果顯示，干擾PIM3的表達可抑制人胰腺癌AsPC-1細胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的生長，這可能與PIM3 siRNA干擾PIM3的表達，從而直接抑制腫瘤細胞的生長并誘導(dǎo)細胞凋亡有關(guān)。本研究為PIM3 siRNA對胰腺癌的抗腫瘤活性研究提供了科學(xué)依據(jù)，是臨床藥物研發(fā)的基礎(chǔ)研究。未來將進一步探討PIM3 siRNA對其他胰腺癌細胞的作用，為PIM3 siRNA在胰腺癌治療方面提供更多的實驗和理論依據(jù)。

綜上所述，PIM3 siRNA可通過干擾PIM3的表達，誘導(dǎo)人胰腺癌AsPC-1細胞的凋亡，在體內(nèi)體外均可抑制胰腺癌AsPC-1細胞的生長。