虎杖苷通過抑制miR-301a促進胃癌SGC-7901細胞凋亡的機制研究

肖永琴，張 珂，曹靜平

（1.四川省腫瘤醫(yī)院，四川 成都 610041；2.重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院，重慶 400000）

目前，胃癌是常見的惡性消化道腫瘤之一，因早期診斷率較低，且總體上預后較差，所以胃癌的發(fā)病率高、死亡率高[1]。已有研究表明，中醫(yī)藥能夠通過調節(jié)多個信號通路誘導胃癌細胞的凋亡[2-3]。因此研究中醫(yī)藥治療胃癌具有重要意義。

虎杖苷（polydatin，PD）是從虎杖的干燥根莖中提取的單體成分，也可在多種植物中被提取。藥理研究表明，虎杖苷具有抗炎[4]、抗過敏[5]、抗腫瘤[6]的功效?；⒄溶盏目鼓[瘤作用已在多種腫瘤中證實，例如鼻咽癌[7]、肺癌[8]、乳腺癌[9]等。本研究以人胃癌SGC-7901為研究對象，探究虎杖苷通過調節(jié)miR-301a表達進而促進胃癌SGC-7901細胞凋亡的作用機制，為后續(xù)進一步研究抗腫瘤藥物靶點提供基礎。

1 實驗材料

1.1 細胞 人胃癌細胞株SGC-7901（CL-0206）、人正常胃上皮細胞GES-1（CL-0563）購于武漢普諾賽生命科技有限公司，用含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱對細胞進行培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑 虎杖苷（polydatin，批號：HY-N0120A，純度為98.95%，美國Med Chem Express公司）；細胞培養(yǎng)基RPMI-1640（貨號：PM150110，上海雅吉生物科技有限公司）；青鏈霉素（貨號：30-004-ci，corning公司）；胎牛血清（貨號：abs972，上海優(yōu)寧維生物科技有限公司）；胰蛋白酶（貨號：T4049，Sigma公司）；逆轉錄試劑盒（貨號：RR037A）、熒光定量PCR檢測試劑盒（貨號：DRR096A）（大連寶生物工程有限公司）；Lipo6000 TM轉染試劑（貨號：C0526）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（貨號：C1062M）、CCK8試劑盒（貨號：C0038）（碧云天生物科技有限公司）；GAPDH（貨號：AF5009，小鼠單抗，碧云天生物科技有限公司）；Survivin抗體（貨號：ab469，兔多抗）、Bcl-2抗體（貨號：ab59348，兔多抗）、Bax抗體（貨號：ab182733，兔單抗）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號：ab205718）、山羊抗小鼠IgG H&L（HRP）（貨號：ab6789）（abcam公司）；miR-301a及NC-mimics由上海吉瑪制藥公司設計并合成。

1.3 主要儀器Multiskan FC型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CFX Connect型實時熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司）；ZE5型流式細胞儀（美國Bio-Rad公司）；Micro21R型高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞分組與轉染 取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞（密度為2×105）接種于6孔板中，實驗分組為：（1）對照組、miR-301a mimics組、NC mimics組；（2）對照組、虎杖苷組、虎杖苷+miR-301a mimics組、虎杖苷+NC mimics組。按照實驗設計分別轉染SGC-7901細胞，分別用100μL無血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋5μL Lipo6000 TM轉染試劑和100 pmol轉染物，室溫靜置5 min，然后混合，在室溫靜置5 min。將該混合物均勻滴加到孔內，輕輕混勻。8 h后更換完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

2.2 CCK8實驗 取處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞（密度為5×103）接種于96孔板中，具體分組為：（1）對照組、50μmol/L虎杖苷組、100μmol/L虎杖苷組、150μmol/L虎杖苷組；（2）虎杖苷組、虎杖苷+miR-301a mimics組、虎杖苷+NC mimics組。進行不同濃度的虎杖苷處理或轉染NC/miR-301a mimics后，培養(yǎng)24、48、72 h后，向每孔中加入20μL CCK8試劑，并在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后使用酶標儀測定其450 nm處吸光度值。

2.3 qRT-PCR實驗 根據(jù)TRIzol Reagent使用說明書提取人SGC-7901和GES-1細胞中的總RNA，并按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。按照說明書配制qRT-PCR反應體系，反應條件為95℃預變性30 s，40個循環(huán)擴增反應（95℃5s，60℃20 s）。以U6為內參，通過2-△△Ct法計算miR-301a的相對表達量。具體引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 取處于生長期的SGC-7901細胞至6孔板中，具體分組為：（1）NC組、50μmol/L虎杖苷組、100μmol/L虎杖苷組、150μmol/L虎杖苷組；（2）虎杖苷組、虎杖苷+miR-301a mimics組、虎杖苷+NC mimics組。進行不同濃度的虎杖苷處理或NC/miR-301a mimics轉染后培養(yǎng)48 h。然后用0.25%胰酶對人SGC-7901細胞消化，1 000 r/min離心5 min，收集細胞。然后加入500μL的1×binding buffer對細胞進行重懸，加入5μL的Annexin V-FITC和10μL的PI并輕輕搖晃混勻，室溫避光孵育10 min，使用流式細胞儀上機檢測，并計算細胞的凋亡率。

2.5 Western blotting實驗 取處于生長期的SGC-7901細胞至6孔板中，進行處理或轉染后培養(yǎng)48 h。收集細胞并使用細胞裂解液對細胞進行裂解，使用BCA法進行蛋白定量。配制濃縮膠和分離膠，取25μg蛋白進行上樣，采用恒壓進行電泳，然后濕轉至PDVF膜上。使用5%的脫脂奶粉對膜封閉1 h。加入相應的一抗（1∶1 000），4℃過夜孵育，1×PBST清洗3次。加入二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，1×PBST清洗3次。在膜上逐滴加入ECL顯影液進行顯影，并通過Image J軟件對蛋白條帶進行分析。

2.6 統(tǒng)計學方法 使用Graph Pad Prism 8統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料均用（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)之間比較則采用t檢驗。3組及3組以上數(shù)據(jù)間的比較先采用單因素方差分析（ANOVA），當確定具有顯著差異時，再進行LSD-t檢驗。以P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 虎杖苷對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響CCK8實驗結果顯示，與對照組比較，虎杖苷在不同時間梯度處理后，對人胃癌SGC-7901細胞增殖能力均有一定程度的抑制作用，具有一定的時間依賴性。虎杖苷在不同濃度梯度處理后，細胞增殖速率減緩具有一定的劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。為此選用150μmol/L虎杖苷處理48 h進行后續(xù)相關實驗。（見圖1A）

流式細胞術實驗結果顯示，與對照組比較，虎杖苷處理后，人胃癌SGC-7901細胞凋亡率增加，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。（見圖1B）

圖1 虎杖苷對胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的影響

3.2 虎杖苷對胃癌SGC-7901細胞中miR-301a表達的影響qRT-PCR結果顯示，與人正常胃上皮細胞GES-1細胞比較，miR-301a在人胃癌SGC-7901細胞中高表達（P〈0.05）。（見圖2A）與對照組比較，在人胃癌SGC-7901細胞中使用虎杖苷處理后miR-301a表達量降低，且具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）。（見圖2B）

圖2 虎杖苷對胃癌SGC-7901細胞中miR-301a表達的影響

3.3 miR-301a過表達能夠部分消除虎杖苷抑制胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的作用qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，轉染miR-301a mimics組的細胞中miR-301a表達量增加，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.05）；轉染NC mimics組中miR-301a表達與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見圖3A）與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中miR-301a表達增加（P〈0.01）；而虎杖苷+NC mimics組miR-301a表達與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見圖3B）

CCK8實驗結果顯示，與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中胃癌SGC-7901細胞增殖能力增加（P〈0.05）；而虎杖苷+NC mimics組胃癌SGC-7901細胞增殖能力與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見圖3C）

流式細胞術實驗結果顯示，與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中胃癌SGC-7901細胞的凋亡率降低（P〈0.05）；而虎杖苷+NC mimics組中細胞凋亡率與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見圖3D）

圖3 miR-301a過表達能夠部分消除虎杖苷抑制胃癌SGC-7901細胞增殖、凋亡的作用

3.4 miR-301a過表達能夠部分消除虎杖苷抑制凋亡相關基因的表達Western blotting實驗結果顯示，與對照組比較，虎杖苷處理的胃癌SGC-7901細胞中survivin、Bcl-2蛋白含量表達降低（P〈0.05），Bax蛋白表達增加（P〈0.05）。與虎杖苷組比較，虎杖苷+miR-301a mimics組中胃癌SGC-7901細胞中survivin、Bcl-2蛋白含量增加（P〈0.05），Bax蛋白含量下降（P〈0.05），而虎杖苷+NC mimics組中蛋白表達與虎杖苷組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見圖4）

圖4 miR-301a過表達能夠部分消除胃癌SGC-7901細胞中虎杖苷抑制凋亡相關基因的表達

4 討 論

胃惡性腫瘤起源于胃壁最表層的黏膜上皮細胞，可發(fā)生于胃的各個部位[10]。臨床上常應用順鉑、紫杉醇、奧沙利鉑等對胃癌進行治療，但是具有一定的副作用[11]。現(xiàn)代中醫(yī)學家認為臟腑陰陽失調、氣滯血瘀、肺氣抑郁等是多種癌癥發(fā)生的主要病因[12]。因此，應該以扶正培本、清熱解毒、活血化瘀為中醫(yī)藥治療癌癥的基本原則?；⒄溶帐且环N天然活性成分，藥理學研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[13-14]。鐘華林等[7]研究發(fā)現(xiàn)虎杖苷能夠通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路進而抑制鼻咽癌DNE-1細胞增殖及誘導細胞凋亡，且呈濃度依賴性。本研究結果顯示不同濃度虎杖苷處理人胃癌SGC-7901細胞，能夠抑制SGC-7901細胞增殖能力并誘導細胞凋亡，且對SGC-7901細胞增殖的抑制作用具有一定的劑量依賴性，提示虎杖苷在胃癌細胞中具有抗腫瘤作用。

MicroRNA是具有高度保守性的含有22個核苷酸的內源非編碼蛋白質的小RNAs，其能夠與mRNA的3’UTR端相結合進而發(fā)揮其調控作用[15]。近年來，有研究指出miR-301a是一種參與調節(jié)胃癌進展的致癌基因，但其潛在機制尚不清楚。有研究表明，miRNA-301a-3p表達在胃癌組織和胃癌細胞系中均上調，且miR-301a-3p的高表達與胃癌的不良預后有關；抑制miR-301a-3p的表達可抑制胃癌細胞AGS和MKN-45增殖、遷移和侵襲能力[16]。DOU J等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-301a模擬物可提高胃癌細胞活力，促進細胞遷移和侵襲。此外，已有研究證實虎杖苷可通過調控miRNA的表達水平在癌癥中發(fā)揮抗腫瘤的作用[18]。本研究結果表明，與人正常胃上皮細胞相比，miR-301a在胃癌SGC-7901細胞中高表達；虎杖苷處理后SGC-7901細胞中miR-301a降低。當過表達miR-301a及虎杖苷處理后，能夠引起細胞增殖，抑制細胞凋亡，且促凋亡蛋白含量降低，抑凋亡蛋白增加。提示miR-301a表達能夠逆轉虎杖苷對胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制作用并抑制細胞凋亡。

綜上所述，虎杖苷能夠抑制胃癌SGC-7901細胞增殖，促進細胞凋亡，其具體機制可能為虎杖苷通過抑制miR-301a表達進而抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖能力，促進細胞凋亡的發(fā)生，為進一步開發(fā)新的藥物靶點提供科學的理論基礎。