一測多評法測定不同產(chǎn)地芫花中3種活性成分的含量*

馬瑞瑞，吳文平，羅宇琴，邱韻靜，李國衛(wèi)，魏 梅，孫冬梅，陳向東

（廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 528244）

[關(guān)鍵字]芫花；一測多評法；校正因子；芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷；芹菜素；芫花素；含量測定

芫花為瑞香科植物芫花Daphen genkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，春季花未開放時(shí)采收，除去雜質(zhì)，干燥[1]。主要分布于華東及河北、陜西、河南、湖北、湖南、四川、貴州等地。芫花的化學(xué)成分主要包括黃酮類、二萜原酸酯類、綠原酸類、木脂素類等，其中黃酮類成分包括芫花素、羥基芫花素、木犀草素、椴樹苷、芹菜素、槲皮苷、芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷等，此外還包括二萜原酸酯類如芫花酯甲、芫花酯乙等。芫花性溫，味苦、辛，具有泄水逐飲的功能，外用殺蟲療瘡[1-4]。臨床主要用于水腫脹滿、胸腹積水、痰飲積聚、氣逆咳喘、二便不利；外治疥廯禿瘡，癰腫，凍瘡。目前對芫花的含量測定研究多集中于對芫花素的含量測定，而芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸、芹菜素等相關(guān)的文獻(xiàn)研究較少。中藥的整體性主要體現(xiàn)在其有效成分群發(fā)揮藥理藥效作用，因此，采用一測多評法（QAMS）對中藥有效成分群進(jìn)行檢測更能反映中藥材內(nèi)在質(zhì)量。

目前一測多評法在中藥質(zhì)量控制中已廣泛應(yīng)用[5-10]，該方法快速、簡便并且能實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測多個(gè)成分，是一種符合中藥多成分特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)模式。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法同時(shí)測定了芫花中芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、芫花素的含量，并通過選用芫花素為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)計(jì)算不同成分的校正因子（f）建立一測多評方法，計(jì)算各化學(xué)成分的含量，為中藥材芫花多成分含量的測定與質(zhì)量控制提供了全新的分析模式。

1 材料與儀器

1.1 材料 芹菜素對照品（批號：111901-201603，含量：99.2%），芫花素對照品（批號：111899-201202，含量：94.9%）及芫花對照藥材（批號：121062-201403）均購于中國食品藥品檢定研究院；芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷（批號：ST0892012MG，含量：99.6%）購于上海詩丹德生物科技有限公司；水為超純水；甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑為分析純。本實(shí)驗(yàn)所用的芫花藥材，經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為芫花Daphen genkwa Sieb.et Zucc.的干燥花蕾，樣品采集信息見表1。

表1 樣品信息表

1.2 儀器Waters e2695型高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；Waters HSS T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm)；Agilent TC C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5.0μm）；KQ-500型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ME-204E型萬分之一天平、XP-26型百萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)（美國默克股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Waters HSS T3色譜柱（4.6mm×250mm，5.0μm)；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，按梯度洗脫（0～3 min，20%→43%A；3～25 min，43%→45%A；25～35 min，45%→60%A；35～50 min，60%→90%A）；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量為10μL；柱溫為35℃；檢測波長為350 nm。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素、芫花素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷605.4μg、芹菜素565.6μg、芫花素229.3μg的混合對照品貯備液；取上述貯備液加甲醇制成每1mL含芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷60.54μg、芹菜素56.56μg、芫花素22.93μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取芫花飲片粉末（過三號篩）約0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，用70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液與“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件。各色譜峰分離度良好，表明各方法專屬性較好。（見圖1）

圖1 混合對照品及供試品HPLC色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 分別精密取混合對照品貯備液5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到不同濃度的對照品溶液，并按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以進(jìn)樣濃度x（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 3種成分回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，計(jì)算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素及芫花素峰面積的RSD分別為0.26%、0.28%和0.23%，儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，計(jì)算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素及芫花素峰面積的RSD分別為1.53%、0.90%和0.71%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一芫花樣品（過三號篩）約0.2 g，平行6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，測得芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素和芫花素的含量RSD分別為1.35%、0.68%和0.44%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一已知含量的樣品約0.1 g，平行9份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按樣品含量∶對照品加入量為1∶0.5、1∶1、1∶1.5加入對照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素和芫花素的平均加樣回收率分別為94.22%、95.48%和97.56%，其RSD（n=9）分別為1.47%、1.69%和3.18%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率考察結(jié)果

2.5 校正因子考察

2.5.1 校正因子計(jì)算 分別精密吸取“2.4.2”項(xiàng)下的對照品溶液”，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件”進(jìn)樣，采用多點(diǎn)校正法計(jì)算相對校正因子，以芫花素為內(nèi)標(biāo)，按公式f=As×Ci/（Ai×Cs）（式中Ci為芫花素濃度，Ai為芫花素峰面積，Cs為待測組分濃度，As為待測組分峰面積）計(jì)算芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的相對校正因子分別為f芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷/芫花素=1.62、f芹菜素/芫花素=0.98。

2.5.2 待測成分的色譜峰定位 采用待測成分與芫花素保留時(shí)間的相對值作為定位標(biāo)準(zhǔn)，考察在不同柱溫、流速、色譜柱及色譜儀下對芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素相對保留時(shí)間的影響，結(jié)果各待測組分相對保留時(shí)間RSD均小于5%，表明方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表4。

2.5.3 校正因子重現(xiàn)性考察 考察校正因子在不同實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下的重現(xiàn)性，取同一份樣品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于不同實(shí)驗(yàn)日期，在不同柱溫、流速、色譜柱及色譜儀下對校正因子進(jìn)行考察，不同條件下芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的校正因子波動3%以下，表明方法重現(xiàn)性良好，結(jié)果見表4。

表4 3種成分重現(xiàn)性考察結(jié)果

2.6 樣品測定結(jié)果 取芫花藥材15批，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分析，分別采用外標(biāo)法（ESM）及一測多評（QAMS）法對芫花素、芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷、芹菜素的含量進(jìn)行計(jì)算，并計(jì)算兩種方法的相對平均偏差（RE%）。結(jié)果顯示兩種方法測得的數(shù)據(jù)無明顯差異，相對平均偏差小于3%，結(jié)果見表5。

表5 樣品ESM及QAMS測定結(jié)果

2.7 不同產(chǎn)地芫花藥材的聚類分析 對上述15批不同產(chǎn)地的芫花藥材的內(nèi)標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行分析，通過SPSS 20.0版軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類，得到聚類分析結(jié)果見圖2。從圖2可知，歐氏距離等于5時(shí)，可將15批芫花藥材分為5類，其中來自河北省的3批S3、S11、S12為第一類，其中來自廣西省玉林市和廣東省廣州市的5批S1、S2、S4、S5、S6為第二類，來自江西的3批S8、S9、S10為第三類，來自四川省成都市的3批S13、S14、S15為第四類，來自廣西省玉林市的1批S7，單獨(dú)成一類，將其作為離群數(shù)據(jù)處理。上述結(jié)果說明不同樣品之間存在明顯的產(chǎn)地差異性。

圖2 芫花藥材聚類分析結(jié)果

2.8 不同產(chǎn)地芫花藥材的主成分分析 用SPSS 20.0軟件對15批樣品內(nèi)標(biāo)法含量測定所得結(jié)果進(jìn)行主成分分析，得出相關(guān)矩陣的特征值及方差分析，結(jié)果見表6。主成分1與主成分2的特征值分別為2.089和0.706，對于總方差的累積貢獻(xiàn)率達(dá)93.164%，基本保留了原樣本信息，所以確定提取的主成分?jǐn)?shù)為2個(gè)。根據(jù)主成分載荷矩陣表7可知，芹菜素和芫花素對主成分1的影響最大，芹菜素-7-O-β葡萄糖醛酸苷對主成分2的影響較大。以2個(gè)主成分（見表8）分別作為X、Y軸得15個(gè)樣品的主成分得分圖，可以將15批樣品分為5類，其中來自河北省的3批S3、S11、S12為第一類，來自廣西省玉林市和廣東省廣州市的5批S1、S2、S4、S5、S6為第二類，來自江西的3批S8、S9、S10為第三類，來自四川省成都市的3批S13、S14、S15為第四類，來自廣西省玉林市的1批S7，單獨(dú)成一類，將其作為離群數(shù)據(jù)處理，與聚類分析結(jié)果一致（見圖3）。計(jì)算各樣品綜合得分并排序，結(jié)果表明，來自于廣西省玉林市、廣東省廣州市和四川省成都市的芫花藥材質(zhì)量排名均優(yōu)于河北省安國市、江西省宜春市。（見表9）

圖3 主成分得分圖

表6 特征值及方差分析

表7 主成分載荷矩陣

表8 主成分得分、綜合得分及排名

表9 5個(gè)產(chǎn)地芫花主成分得分均值、綜合主成分得分均值及排名

綜上，進(jìn)一步分析各類之間的含量配比，以芹菜素-7-Oβ-葡萄糖醛酸苷∶芹菜素∶芫花素三者含量比例關(guān)系來看，第一類約為5∶1∶1，第二類約為2∶2∶1，第三類約為3∶1∶1，第四類約為3∶2∶1，第二類和第四類樣品的芹菜素含量占比均較高，該兩類樣品分別來源于廣東、廣西、四川；在主成分分析結(jié)果中，芹菜素的特征值為0.913，為影響芫花藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素；從地理位置來看，四川、廣西和廣東的海拔均高于河北和江西，且四川、廣西和廣東均屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，適宜芫花的生長。上述3個(gè)產(chǎn)地的樣品均排名前三，質(zhì)量較好，含量結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，提示藥材化學(xué)成分的比例可能與其生長環(huán)境有一定的關(guān)聯(lián)。

3 討 論

3.1 分析方法的確定2015年版《中華人民共和國藥典》芫花項(xiàng)下含量測定以芫花素為指標(biāo)，文獻(xiàn)研究指出芫花素在芫花的不同部位均有分布，且芫花素是芫花泄水逐飲，鎮(zhèn)咳祛痰的主要成分[11]，因此，選擇芫花素作為內(nèi)標(biāo)，建立一測多評法測定3種黃酮類成分的含量。本實(shí)驗(yàn)考察了前處理方法中不同條件對3種成分含量的影響，最終確定最優(yōu)的條件為：料液比為0.2∶25 g/mL，以70%乙醇作為提取溶劑，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）30 min，重復(fù)提取2次。

3.2 一測多評法 本研究通過建立一測多評的方法，測定15批芫花的芹菜素-7-O-β-葡萄糖醛酸苷含量范圍在6.314～12.633 mg/g、芹菜素含量范圍在2.416～6.565 mg/g、芫花素含量范圍在2.018～3.659 mg/g，并對不同成分之間的含量比例關(guān)系與主成分分析結(jié)合進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，四川、廣西和廣東產(chǎn)地的芫花質(zhì)量優(yōu)于河北和江西，表現(xiàn)為整體質(zhì)量優(yōu)、品質(zhì)佳，可作為芫花基地規(guī)范化種植及優(yōu)良種質(zhì)篩選的優(yōu)選區(qū)域。

3.3 聚類分析和主成分分析 聚類分析將15批樣品分為五類，利用主成分分析法，將3個(gè)峰變量降維為2個(gè)主成分變量，用主成分1和主成分2分別作為X、Y軸得15個(gè)樣品的主成分得分圖，結(jié)果與聚類分析一致。計(jì)算各樣品綜合得分并排序，結(jié)果表明，來自廣西省玉林市、廣東省廣州市和四川省成都市的芫花藥材質(zhì)量優(yōu)于河北省安國市和江西省宜春市藥材質(zhì)量。經(jīng)分析，芫花的質(zhì)量可能與海拔、生長年限及采收加工有關(guān)，為芫花原藥材的產(chǎn)地優(yōu)選提供參考。

本研究建立的一測多評法同時(shí)測定芫花中3種活性成分的含量，為更好評價(jià)芫花藥材質(zhì)量提供了參考，并為優(yōu)選芫花產(chǎn)地提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。