免疫法在食品黃曲霉毒素檢測中的應(yīng)用

戴 煌，黃周梅，李占明，王加華，肖安紅，舒在習(xí)

（1 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 武漢 430023 2 大宗糧油精深加工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430023 3 湖北省農(nóng)產(chǎn)品加工與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 武漢 430023 4 江蘇科技大學(xué)糧食學(xué)院 江蘇鎮(zhèn)江 212004）

黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFs）主要是黃曲霉菌、寄生曲霉菌和集蜂曲霉產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)相似的次生代謝產(chǎn)物，對人類和動(dòng)物具有極強(qiáng)的毒性和致癌性，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的IA 致癌物，廣泛存在于霉變的農(nóng)產(chǎn)品、食品及飼料中[1-4]，嚴(yán)重危害人類健康。黃曲霉毒素對光、熱和酸穩(wěn)定，耐高溫，常規(guī)加熱處理對其破壞小，容易通過水和土壤環(huán)境富集。目前發(fā)現(xiàn)的黃曲霉毒素有20 多種，常見的有B1、B2、G1、G2、M1和M2，其中黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最強(qiáng)[5]，多見于花生、玉米、大豆、小麥等糧食及其制品中。黃曲霉毒素M1和M2主要存在于奶制品中，其毒性和致病性較弱。AFs 可在糧食的生長、收獲、儲運(yùn)、加工、流通等環(huán)節(jié)發(fā)生污染，對食品安全及人體健康構(gòu)成巨大威脅。

《中華人民共和國食品安全法》自2015年10月1日實(shí)施以來，保障食品品質(zhì)安全成為國家的重要任務(wù)之一。為保障食品安全、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，準(zhǔn)確檢測食品中AFs 含量，確定AFs 污染程度至關(guān)重要。各國政府、企業(yè)、消費(fèi)者以及相關(guān)專家迫切需要使用經(jīng)濟(jì)、有效的手段來提高食品中AFs 的可檢測性。AFs 的傳統(tǒng)檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜（LCMS）聯(lián)用法等。色譜法是國標(biāo)中檢測AFs 的金標(biāo)法[6]，具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，然而，存在樣品前期處理復(fù)雜、設(shè)備昂貴、檢測程序復(fù)雜、需要專業(yè)的檢測人員等缺陷，不適合大批量樣品的檢測，難以滿足基層監(jiān)管過程中快速檢測的需求，不便推廣應(yīng)用。為了有效降低AFs 污染，保障食品安全，需開發(fā)準(zhǔn)確、快速的現(xiàn)場檢測技術(shù)來監(jiān)控食品在種植、生產(chǎn)加工、流通等環(huán)節(jié)中的AFs 污染水平。隨著免疫學(xué)、分子生物學(xué)、生物化學(xué)的不斷發(fā)展，快速、準(zhǔn)確、簡便的AFs 檢測方法，如免疫法[7]、近紅外光譜[8]、圖像法[9]和生物傳感器法[10]等被開發(fā)出來。免疫分析法是以抗原-抗體的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)的分析技術(shù)，與其它方法相比，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、分析容量大、安全可靠等優(yōu)點(diǎn)，已成為極具競爭力的分析檢測技術(shù)之一。以免疫法為基礎(chǔ)，結(jié)合其它分析檢測技術(shù)開發(fā)的新型檢測方法已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、食品檢測、環(huán)境污染監(jiān)測等領(lǐng)域[7，11]。本文對基于免疫技術(shù)發(fā)展而來的AFs 檢測方法進(jìn)行綜述，以期為AFs 免疫檢測技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用提供理論支持。

1 黃曲霉毒素免疫快速檢測技術(shù)

免疫分析法是基于特異性抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)開發(fā)而來的檢測方法，為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性、特異性和靈敏性，免疫法一般包含3 個(gè)基本元素：目標(biāo)物、識別分子和信號標(biāo)記分子。在AFs的免疫檢測法中，主要利用抗體（Antibody，Ab）作為識別分子，AFs 作為抗原與抗AFs 的抗體特異性結(jié)合，抗體與目標(biāo)物的親和能力直接影響免疫法的檢測性能。所有的AFs 都是半抗原，為了得到特異性好的抗體，需要將AFs 與蛋白質(zhì)連接形成AFs-蛋白復(fù)合物來制備抗體。根據(jù)抗體產(chǎn)生的模式，AFs 抗體分為單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體[7，12]。單克隆抗體敏感性強(qiáng)，然而只對抗原特定分子形態(tài)具有敏感性，抗干擾性差，較難獲得。通過免疫反應(yīng)在兔子、山羊或者馬的血液中制備的多克隆抗體因制作簡便、成本低、抗干擾性強(qiáng)，應(yīng)用最廣泛。適配體（Aptamer，Apt）是一段特異的單鏈DNA 或RNA 片段，能與特定配體結(jié)合形成特殊三維結(jié)構(gòu)，具有良好的選擇性、親和性、特異性，有類似抗體的作用和功能，被用于識別和檢測目標(biāo)分子[13]。與抗體相比，適配體具有親和力高、穩(wěn)定性好、成本低、生產(chǎn)簡單、易于標(biāo)記和修飾的優(yōu)點(diǎn)[14]。幾乎所有的免疫反應(yīng)都需要信號標(biāo)記物來產(chǎn)生檢測信號，例如：酶、熒光物質(zhì)、納米金、磁性納米粒子、放射性物質(zhì)、脂質(zhì)體等[15]。在抗體濃度固定時(shí)，免疫法有非競爭、直接競爭和間接競爭3 種模式[7]，如圖1所示。

非競爭法中將AFs 的特異性抗體固定，直接捕獲樣品中AFs 進(jìn)行檢測，如圖1a 所示。直接競爭法主要有2 種形式：將載體蛋白結(jié)合的AFs 固定在基底表面，樣品中的AFs 和固定在界面上的AFs 與標(biāo)記有信號分子的抗體競爭性結(jié)合，如圖1b 所示；當(dāng)將抗AFs 抗體固定在界面時(shí)，樣品中的AFs 和標(biāo)記有信號分子的AFs 與固定的抗體競爭性結(jié)合，如圖1c 所示。AFs 很難直接固定在界面，需要將AFs 與蛋白質(zhì)連接成復(fù)合物再進(jìn)行固定，常用的載體蛋白有牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA）和卵清蛋白等[7]。間接競爭法中，將AFs-載體蛋白復(fù)合物固定在平板界面，加入固定濃度的抗體，樣品中AFs 與平板上固定的AFs 競爭結(jié)合抗體，清洗移除未結(jié)合的抗體后，加入信號分子標(biāo)記的第二抗體IgG，通過測定結(jié)合在平板上信號分子的量來確定AFs 濃度，檢測信號與樣品中AFs 濃度呈負(fù)相關(guān)，如圖1d 所示。AFs 作為小分子污染物，與抗體結(jié)合后引起信號變化小，較少利用非競爭法進(jìn)行直接檢測。同時(shí)，AFs 作為半抗原物質(zhì)，抗原決定簇少，很難同時(shí)與兩種或兩種以上抗體結(jié)合形成“三明治”夾心結(jié)構(gòu)，因此通常采用競爭性抑制法建立檢測方法。

圖1 主要免疫測定模式Fig.1 Main immunoassay models

根據(jù)信號產(chǎn)生方式和信號轉(zhuǎn)換類型，基于免疫技術(shù)AFs 檢測方法主要有比色法、熒光法、免疫層析法、電化學(xué)法、石英晶體微天平法、表面等離子共振法和微懸臂梁法。本文對近年來上述用于AFs 檢測的方法進(jìn)行綜述，介紹基本原理，比較各方法之間的檢測性能、應(yīng)用領(lǐng)域和存在的問題，為AFs 檢測方法的發(fā)展提供策略和方向。

1.1 比色法

比色法是通過顏色變化產(chǎn)生相應(yīng)信號的檢測方法，具有快速、簡便的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果可用肉眼直接觀察，實(shí)際應(yīng)用潛力大，是分析中常用的方法之一，其中用酶催化產(chǎn)生顏色變化的免疫比色法稱為酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）。ELISA 作為多相方法，一般吸附在96 孔或394 孔板表面進(jìn)行，常采用競爭免疫模式構(gòu)建ELISA 檢測AFs。AFs 與酶標(biāo)記的AFs 競爭結(jié)合板上的固定化抗體，孵育后洗去未結(jié)合的AFs，加入底物，被固定在基板上的含酶免疫復(fù)合物催化底物反應(yīng)顯色，測試結(jié)果與AFs 的濃度成反比。常用于標(biāo)記的酶為堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）和辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP）[16]，對應(yīng)的催化底物為磷酸對硝基苯酯、磷酸抗壞血酸酯、1-萘基磷酸鈉（a-Naphthyl phosphate，α-NP），3，3’5，5’-四甲基聯(lián)苯胺（3，3’5，5’-Tetramethylbenzidine，TMB）[17]、鄰苯二胺（o-Phenylenediamine，o-PD）、2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸【2，2’-Azinobis（3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid），ABTS】等[18]。近年來，大量研究從免疫結(jié)構(gòu)、識別原件、酶、底物、納米材料等方面探索新ELISA 方法用于AFB1檢測。

Xie 等[19]利用適配體ssDNA1作為探針固定在基板上，親和素標(biāo)記部分互補(bǔ)ssDNA2與探針ssDNA1結(jié)合。無AFB1時(shí)，鏈霉親和素標(biāo)記的HRP通過鏈霉親和素-生物素相互作用結(jié)合被固定在基板上，利用HRP 催化TMB 顯色構(gòu)建直接競爭比色法檢測AFB1，該方法的線性范圍為1～80 ng/mL，檢測限（Limit of detection，LOD）為0.36 ng/mL，用于花生中AFB1的檢測，回收率為82.60%～94.43%。有研究采用具有類過氧化物酶催化性能的材料替代常用的HRP 建立ELISA 法用于AFB1檢測[20]。例如，特定序列的DNA 適配體與血紅素和K+共存時(shí)形成G-四連體結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有類過氧化物酶的活性，被稱為DNA 模擬酶[21]，該模擬酶可以催化H2O2氧化ABTS[22]、TMB[23-24]、o-PD[25]顯色。Seok 等[22]以AFB1特異性DNA 適配體作為探針，兩等分DNA 酶片段，構(gòu)建直接競爭免疫模式的比色法檢測AFB1。沒有AFB1時(shí)，三段DNA 片段在血紅素和K+共存形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體DNA 模擬酶，催化H2O2氧化ABTS 顯色；AFB1存在時(shí)，G-四聯(lián)體DNA 模擬酶結(jié)構(gòu)被破壞，無法催化顯色。該方法的線性范圍為0.1～1.0×104ng/mL，LOD 為0.1 ng/mL，用于玉米樣品中AFB1的檢測，加標(biāo)回收率為93.96%～104.95%。酸堿指示劑在不同pH 值下顯示顏色變化，研究者利用此原理開發(fā)簡易的比色法檢測AFB1[26-27]。Xiong 等[27]將葡萄糖氧化酶標(biāo)記到AFB1上，采用直接競爭法構(gòu)建ELISA 比色法。沒有AFB1時(shí)，AFB1-葡萄糖氧化酶復(fù)合物被固定在基底上的抗體捕獲，加入葡萄糖和溴甲酚紅紫酸混合物后，催化產(chǎn)生葡萄糖酸，引起溶液pH 值下降，導(dǎo)致溴甲酚紅紫酸由紫變黃，可對溶液吸光度進(jìn)行定量。該方法的線性范圍為25～200 pg/mL，LOD 為100 pg/mL，用于玉米樣品中AFB1的檢測，加標(biāo)回收率為80.56%～108.53%，與標(biāo)準(zhǔn)LC-MS/MS 檢測相一致。

相比于傳統(tǒng)檢測方法，ELISA 在靈敏度、成本、操作技術(shù)等方面具優(yōu)勢。目前，市場上已有許多商業(yè)化的ELISA 試劑盒[28-29]，其準(zhǔn)確性、檢測范圍等方面都已較為成熟，可為現(xiàn)場快速檢測提供支持，特別是對滿足發(fā)展中國家和不發(fā)達(dá)國家的檢測需求具有重要意義。雖然ELISA 具有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是操作過程中酶活性很容易受到食品基質(zhì)和反應(yīng)條件的影響，例如，在高鹽樣品（如葡萄酒、醬油等）和高脂肪樣品（食用油、花生等）中，如果前處理不當(dāng)，樣品中鹽離子濃度、金屬、pH 值等條件都會嚴(yán)重影響ELISA 結(jié)果。在樣本提取過程中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象容易導(dǎo)致假陽性結(jié)果。此外，ELISA 法存在線性范圍窄，試劑保質(zhì)期短，需要低溫保存的缺點(diǎn)[30]。隨著新材料的發(fā)展，ELISA 新方法的研究層出不窮，如何研制出穩(wěn)定、可靠、低成本檢測的ELISA 試劑盒是急需解決的問題。

納米顆粒（納米金、納米銀等）具有非常高的消光系數(shù)和強(qiáng)吸附性，在分散狀態(tài)下呈紅色，溶液環(huán)境改變使得納米顆粒聚集后變?yōu)樗{(lán)色，基于此開發(fā)比色法[31]?；谶m配體的納米顆粒比色法可提供穩(wěn)定的、視覺上可觀察到的試驗(yàn)結(jié)果，操作簡單、快捷，適于現(xiàn)場快速檢測，如圖2所示。Luan等[32]建立了一種基于適配體技術(shù)檢測AFB1的納米金（Gold nanoparticals，AuNPs）比色法。單鏈AFB1適配體探針通過靜電作用吸附在AuNPs 顆粒表面，保護(hù)AuNPs 在高濃度鹽溶液下不會發(fā)生聚集現(xiàn)象。加入AFB1時(shí)，AFB1與適配體會出現(xiàn)競爭性結(jié)合，迫使適配體離開AuNPs 表面。加入高濃度NaCl 溶液后，AuNPs 顆粒在沒有適配體保護(hù)下會發(fā)生聚集，導(dǎo)致溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)色，可以直接通過肉眼觀察最終溶液的顏色變化進(jìn)行定性判別，也可以通過檢測吸光度來確定AFB1的含量。該方法的線性范圍為0.025～100 ng/mL，LOD 為0.025 ng/mL，半小時(shí)內(nèi)即可完成檢測。該團(tuán)隊(duì)采用類似原理檢測AFB2，其線性范圍為0.025～10 ng/mL，LOD 為0.025 ng/mL[33]。

圖2 納米金比色法檢測AFB1 的原理圖Fig.2 Schematic diagram of AuNPs colorimetric method for detecting of AFB1

1.2 熒光法

AFs 在紫外光照射下會發(fā)生熒光，可利用自身熒光直接檢測。在波長365 nm 的紫外光照射下AFB1和AFB2產(chǎn)生紫色熒光，AFG1和AFG2產(chǎn)生綠色熒光。通過對比樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在紫外光下的熒光點(diǎn)強(qiáng)度，來確定樣品中AFs 含量[34]。直接檢測AFs 熒光方法的缺點(diǎn)在于樣品前處理復(fù)雜、操作繁瑣、測定時(shí)受周圍環(huán)境影響，所得結(jié)果的準(zhǔn)確性差、誤差較大，該方法的最低檢出限遠(yuǎn)高于國際規(guī)定的毒性安全限量，且所用試劑會引起環(huán)境污染[35]，已停止使用。熒光法是將具有熒光的物質(zhì)制成熒光標(biāo)記物作為探針來檢測目標(biāo)物。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍廣、分析速度快、標(biāo)記物易于制備、使用時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)。熒光法有效克服了比色法靈敏度相對較低的缺點(diǎn)，通常與免疫層析法結(jié)合使用。目前，使用最廣泛的熒光標(biāo)記物包括量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs）[36-37]、熒光微球[38]、熒光有機(jī)染料[39-40]等。熒光法的原理主要包括熒光標(biāo)記法[41]和熒光共振能量轉(zhuǎn)移[42]。熒光標(biāo)記法檢測原理與ELISA 原理類似，區(qū)別在于采用熒光標(biāo)記物代替酶來產(chǎn)生熒光信號。Huang 等[43]將AFB1-HRP 復(fù)合物固定在基板上，樣品中AFB1和AFB1-HRP 復(fù)合物與抗體競爭性結(jié)合，清洗后加入Eu3+標(biāo)記的IgG 抗體，Eu3+-IgG 與固定在界面的AFB1抗體結(jié)合，采用間接競爭免疫模式構(gòu)建熒光法檢測AFB1，該方法的線性范圍為0.02～100 μg/L，LOD 為0.025 μg/L，加標(biāo)回收率為76%～95%。

采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）構(gòu)建的熒光法是目前的研究熱點(diǎn)。基本原理是供體（Donor）熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜與受體（Acceptor）熒光基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離小于10 nm 時(shí)，可觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。通過測量分別標(biāo)記供體/受體熒光團(tuán)的兩個(gè)分子之間相互作用的熒光強(qiáng)度來構(gòu)建檢測法[44-45]，如圖3所示。供體為發(fā)射熒光的標(biāo)記物，受體一般為較強(qiáng)熒光猝滅的材料，如氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）[46]、AuNPs[45，47]和磁性納米粒子（Magnetic nanoparticles，MNPs）[48]等納米材料。Lu 等[46]在碲化鎘量子點(diǎn)（CdTe QDs）表面修飾AFB1特異性DNA 作為熒光探針，CdTe QDs-DNA通過π-π 堆疊作用吸附在GO 納米片上，CdTe QDs 的熒光被GO 淬滅。加入AFB1后，DNA 適配體與AFB1特異性結(jié)合，CdTe QDs-DNA 復(fù)合物從GO 納米片上脫落，熒光恢復(fù)，基于FRET 原理構(gòu)建熒光法檢測。該方法的線性范圍為3.2 nmol/L～320 μmol/L，LOD 為1.0 nmol/L。目前，基于熒光法的AFs 檢測已逐步發(fā)展起來，表1列出熒光法在AFs 檢測中的部分應(yīng)用。

圖3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of fluorescence resonance energy transfer

表1 熒光法在食品中AFs 檢測的應(yīng)用Table 1 Application of fluorescence method for the detection of AFs in food

由于具有較高的靈敏度，熒光檢測法在AFs檢測中顯示出巨大的潛力。然而，在熒光檢測過程中，工作液與各種物質(zhì)（例如：納米材料和靶標(biāo)物）混合時(shí)，納米材本身會增加背景噪聲水平，最終影響檢測靈敏度。大多數(shù)熒光納米材料的激發(fā)區(qū)在高能的紫外區(qū)，長期輻照容易破壞檢測樣本。其次，生物系統(tǒng)中的核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)分子容易被激發(fā)出強(qiáng)烈的背景熒光，增加背景干擾。QDs 存在光漂白、自發(fā)熒光和熒光現(xiàn)象，很容易受到環(huán)境的影響，其靈敏度受到限制。為了盡量消除背景干擾，新型熒光標(biāo)記物被開發(fā)出來，例如，UCNPs 在低能紅外區(qū)激發(fā)產(chǎn)生熒光，可以很好避免背景噪聲[49，61]；MOFs 性質(zhì)穩(wěn)定、大小和形狀可控，具有良好的熒光特性和表面修飾能力[52]，能提高檢測性能。

1.3 側(cè)流免疫層析法

側(cè)流免疫層析法（Lateral flow immunoassay strips，LFIAs）是20世紀(jì)80年代早期開始發(fā)展起來的，是一種集中固態(tài)單克隆抗體技術(shù)、ELISA、免疫技術(shù)和新材料技術(shù)為一體的檢測方法，根據(jù)此方法開發(fā)而來的各類免疫試紙條很快進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用[62]。其基本原理是在硝酸纖維素膜上特定的區(qū)域（檢測線）固定目標(biāo)物，在樣品墊上滴加測試樣品和抗體-標(biāo)記物探針混合溶液，混合溶液在膜上層析流動(dòng)。樣品中目標(biāo)物和固定在檢測線上的目標(biāo)物與抗體-標(biāo)記物探針競爭性結(jié)合，抗體-標(biāo)記物聚集在檢測線產(chǎn)生信號帶[63-64]。信號帶可用肉眼定性和半定量估計(jì)，也可使用信號讀取裝置進(jìn)行量化讀取。為保證抗體活性和有效性，在對照線上固定IgG 來捕獲抗體-標(biāo)記物，產(chǎn)生對照線信號帶[65]，如圖4所示。信號標(biāo)記物的性質(zhì)很大程度上決定著LFIAs 的檢測靈敏度，常用的信號標(biāo)記物有AuNPs[66-67]、碳納米材料[68]、QDs[69-70]、UCNPs[71-72]、染料摻雜納米粒子[73]、MNPs[74-75]。其中，基于AuNPs 的LFIAs 具有迅速、便捷、安全等優(yōu)勢，具有現(xiàn)場檢測的可能性，現(xiàn)已廣泛用于農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測[65，76-82]。

圖4 免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)和檢測模式[65]Fig.4 The structure and detection mode of the immunochromatographic test strip[65]

Masinde 等[82]利用直接競爭ELISA 原理建立基于AuNPs 的靈敏LFIAs，以AFB1-BSA 作為檢測線，羊抗兔IgG 作為對照線，抗體-AuNPs 作為探針。當(dāng)結(jié)果顯示兩條紅線時(shí)（檢測線和對照線）為陰性，樣品中沒有AFB1；一條紅線時(shí)（對照線）為陽性，含有AFB1。該方法的可視LOD 為0.1 ng/mL，檢測大米和玉米樣品中的AFB1陽性率，結(jié)果與HPLC 法檢測結(jié)果一致。Yu 等[68]使用GO 和羧基化的GO 作為側(cè)向流免疫測定的標(biāo)記物，所建立LFIAs 的LOD 為0.3 ng/mL。在一條LFIAs 試紙條上設(shè)計(jì)多條檢測線可以實(shí)現(xiàn)對多目標(biāo)物的同時(shí)檢測[83]，Shao 等[84]將疏水十八胺修飾的CdSe/ZnS QDs 標(biāo)記在抗體上作為熒光探針，開發(fā)了多條測試線同時(shí)定量檢測AFB1和ZEN，該方法對AFB1和ZEN 的LOD 分別為1.65 pg/mL 和59.15 pg/mL。Han 等[85]針對喹諾酮、四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺、磺酰胺、氯霉素、鏈霉素、AFM1、三聚氰胺這8 種有害物質(zhì)，開發(fā)了LFIAs 法檢測其在牛奶中的污染程度，將對應(yīng)抗體結(jié)合到AuNPs 上形成8 種抗體-AuNPs 復(fù)合物作為顯色探針，其對應(yīng)的LOD 分別為12～80，16～32，2～80，4～80，1.2，50，0.5 ng/mL 和200 ng/mL，均低于國家標(biāo)準(zhǔn)。

LFIAs 具有簡單、快速（可在10 min 內(nèi)檢測）、成本低的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用廣泛。LFIAs 的早期設(shè)計(jì)用于初步篩選，僅提供定性或半定量結(jié)果，沒有定量信息。利用條紋閱讀器將試紙條上的顏色密度的轉(zhuǎn)換成測試線或控制線的光密度可以準(zhǔn)確定量信號強(qiáng)度，然而測試線或控制線的光密度譜線不僅取決于分析物的濃度，還取決于免疫反應(yīng)時(shí)間、操作溫度、條帶間的信號變化以及樣本基質(zhì)的影響，導(dǎo)致檢測線的光強(qiáng)度無法準(zhǔn)確檢測[86]。此外，條紋閱讀器一般只能檢測距離膜表面約10 μm 厚度線條的光密度[87]，無法對檢測線全部光密度進(jìn)行檢測，導(dǎo)致信號強(qiáng)度低，靈敏度較差。有研究嘗試?yán)脺y試線和對照線光密度的比率減少檢測誤差[88]。隨著材料的發(fā)展，納米粒子由于其獨(dú)特的性質(zhì)，例如光吸收、熒光光譜和磁性，可用作替代標(biāo)記物來提高LFIAs 的分析靈敏度。

1.4 電化學(xué)法

電化學(xué)分析方法是將生物活性材料或化學(xué)復(fù)合物附著到電極表面，AFs 被固定在電極表面的抗體捕獲，引起電活性分析物在電極表面發(fā)生的氧化還原反應(yīng)信號變化，如電位、電流、電導(dǎo)率或電量等。根據(jù)識別電信號前、后的變化對AFs 進(jìn)行定性或定量分析。電化學(xué)分析法一般采用三電極系統(tǒng)，包含工作電極、對電極和參比電極，如圖5所示。工作電極上通常修飾導(dǎo)電和生物敏感材料，用于特異性識別目標(biāo)物，常用的有金電極（Gold electrode，BGE）、絲網(wǎng)印刷電極（Screen-printed carbon electrodes，SPCE）和玻碳電極（Glassy carbon electrode，GCE） 等。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，電化學(xué)法以其成本低、操作簡單、檢測迅速、不受樣品顏色和濁度的影響、靈敏度高等優(yōu)勢在AFs 快速檢測中脫穎而出，受到越來越多的關(guān)注。

圖5 電化學(xué)分析法檢測示意圖Fig.5 Schematic diagram of electrochemical detection

為了提高檢測性能，一般在工作電極表面修飾功能材料，如GO、AuNPs、單壁碳納米管（Single-walled carbon nanotubes，SWCNTs）、多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）、殼聚糖（Chitosan，CS）和MNPs[89]等。這些功能材料的修飾，不僅提升了工作電極的電子傳導(dǎo)效率，還能提高抗原、抗體或適配體在界面的負(fù)載量，進(jìn)而提高檢測靈敏度[90-95]。Sharma 等[96]用聚乙烯二氧噻吩修飾氧化銦錫（Indium tin oxide，ITO）電極，沉積AuNPs 后修飾AFB1抗體，以[Fe（CN）6]3-/4-作為電化學(xué)信號探針，利用非競爭免疫模式直接捕獲AFB1，并采用循環(huán)伏安法檢測加入前、后的電流信號建立電化學(xué)法，該方法的線性范圍為1～25 ng/mL，LOD 為0.0045 ng/mL，在玉米樣品中添加30 ng/mL AFB1的重現(xiàn)性為96.31%。為了提高電流信號強(qiáng)度，將電化學(xué)探針如亞甲基藍(lán)（Methylene blue，MB）[97]、二茂鐵（Ferrocene，F(xiàn)c）[98]和酶[99-100]等標(biāo)記在AFB1對應(yīng)抗體或適配體上建立電化學(xué)檢測法。分子印跡聚合物（Molecular imprinting polymers，MIPs） 能模擬抗體-抗原之間的相互作用。成型后的MIPs 具有類似抗體的作用，可對目標(biāo)物（也稱印跡分子）進(jìn)行專一識別，結(jié)合電化學(xué)分析方法建立AFB1檢測法[101]。目標(biāo)物被捕獲在電極界面會引起電子穿過電極-電解液界面轉(zhuǎn)換阻力變化，基于此可構(gòu)建阻抗型電化學(xué)法檢測AFB1。例如，Goud 等[102]在4-對氨基苯甲酸修飾的SPCE 表面固定AFB1對應(yīng)適配體，采用非競爭免疫模式構(gòu)建免標(biāo)記電化學(xué)阻抗適配體傳感器，其動(dòng)態(tài)檢測范圍為0.125～16 ng/mL，LOD 為0.12 ng/mL。該方法在啤酒和白酒樣品中應(yīng)用良好，回收率為92%～102%。近年來基于電化學(xué)法開發(fā)的AFs 檢測方法如表2所示。

表2 電化學(xué)法在食品中AFs 的檢測應(yīng)用Table 2 Application of electrochemical method for the detection of AFs in food

與傳統(tǒng)方法相比，電化學(xué)免疫傳感器作為潛在的分析工具已被廣泛研究，在低成本、簡便性、便攜性、快速響應(yīng)、靈敏度和特異性等方面有優(yōu)勢。隨著材料和加工技術(shù)的發(fā)展，可拋棄、便攜式商業(yè)化電極，如絲網(wǎng)印刷電極[112]、叉指微電極[113]等已經(jīng)逐步在實(shí)際應(yīng)用中顯現(xiàn)出應(yīng)用潛力，降低了檢測成本。在給定的食物基質(zhì)中，幾種污染物及相關(guān)衍生物可能同時(shí)存在，單一目標(biāo)物檢測方案限制了電化學(xué)法應(yīng)用，需要開發(fā)多分析物傳感器和陣列對污染物進(jìn)行快速篩查。一般食品樣中AFs含量低，且樣品前處理會造成AFs 損失。大部分電化學(xué)法的靈敏度不足以滿足應(yīng)用需求，因此需要開發(fā)靈敏度更高的電化學(xué)法。納米材料具有表面積大、穩(wěn)定性好、生物相容性好、易功能化、獨(dú)特的尺寸和形狀、制備簡單快速等特點(diǎn)[114]，采用納米材料修飾電極提高檢測性能是研究熱點(diǎn)。目前存在的主要挑戰(zhàn)是納米材料的性能依賴于成分的物理和化學(xué)性質(zhì)，需要針對不同檢測策略和使用環(huán)境進(jìn)行合理優(yōu)化。樣品制備仍然是瓶頸，尤其是在霉菌毒素方面，樣品處理周期長、食品基質(zhì)干擾、純化不徹底等問題嚴(yán)重降低電化學(xué)法的檢測效率、準(zhǔn)確性和靈敏性。結(jié)合微流控技術(shù)，將清洗、富集、孵育、檢測等操作步驟集成在一個(gè)平臺上能有效提高檢測效率，降低成本[115]。為了驗(yàn)證電化學(xué)檢測方法的可靠性，應(yīng)對開發(fā)電化學(xué)法與金標(biāo)法進(jìn)行更多的比較研究，充分探索電化學(xué)法性能、使用范圍和條件。

1.5 石英晶體微天平法

石英晶體微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）作為一種功能強(qiáng)大的在線監(jiān)測非侵入性工具，已廣泛用于探索固體表面的分子相互作用，基于此已開發(fā)出相應(yīng)的檢測方法[116-118]。其基本原理是有抗體修飾的壓電傳感器與目標(biāo)物相互作用會導(dǎo)致晶體質(zhì)量增加，引起QCM 的共振頻率偏移，可用電學(xué)方法測量偏移信號以確定晶體表面的質(zhì)量變化。石英成本低，對熱、化學(xué)和機(jī)械應(yīng)力具有穩(wěn)定性，是最常用的壓電材料。QCM 傳感技術(shù)可實(shí)現(xiàn)AFB1的無標(biāo)記和實(shí)時(shí)檢測[119-120]。

Gu 等[121]建立了以AuNPs 摻雜分子印跡和共價(jià)有機(jī)骨架復(fù)合材料作為識別元件的QCM 傳感器檢測AFB1。該復(fù)合材料為交聯(lián)提供了較大的表面積和更多的識別位點(diǎn)。在最優(yōu)條件下，該傳感器的線性范圍為0.05～75 ng/mL，LOD 為2.8 pg/mL，在實(shí)際樣品檢測中，回收率為87%～107%。利用QCM 原理，研究者采用新策略來增大單位AFB1引起的質(zhì)量變化提高檢測靈敏度[122]。Chauhan 等[123]在鍍金的石英晶體電極表面修飾4-氨基硫酚單分子膜，然后共價(jià)固定抗體，加入AFB1后利用二抗IgG 標(biāo)記與金包氧化鐵核殼納米顆粒形成三明治系統(tǒng)。在最優(yōu)條件下，該方法的線性范圍為0.05～5 ng/mL，LOD 為0.07 ng/mL。Jin 等[124]將AFB1-BSA 偶聯(lián)物固定在3-巰基丙酸修飾的QCM 傳感器表面，利用HRP 標(biāo)記二抗IgG，采用間接競爭法構(gòu)建QCM 法檢測AFB1。當(dāng)溶液中游離的AFB1抗體被固定在界面上時(shí)，加入HRPIgG 后將HRP 固定在電極表面。加入底物4-氯萘酚和H2O2，HRP 催化H2O2氧化4-氯-1-萘酚，在QCM 界面生成不溶性苯并-4-氯己二烯酮，導(dǎo)致質(zhì)量增加，引起QCM 共振頻率降低。該傳感器的線性檢測范圍為0.01～10 ng/mL，LOD 為0.01 ng/mL。

QCM 具有簡單、快速、成本低和免標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生化分析領(lǐng)域[125-127]。目前QCM的設(shè)計(jì)和開發(fā)通常是利用試驗(yàn)完成的，在實(shí)際應(yīng)用方面有明顯局限性。實(shí)際樣品中食品基質(zhì)引起的噪聲會導(dǎo)致低濃度的AFB1信號難以檢測，QCM界面的非特異性吸附使得試驗(yàn)結(jié)果與QCM 的真實(shí)物理現(xiàn)象之間的誤差很難避免，操作錯(cuò)誤和使用不當(dāng)可能導(dǎo)致QCM 開發(fā)失敗。從已有的研究來看，QCM 方法在實(shí)際應(yīng)用中存在許多限制。理論研究上可采用有限元模擬仿真法，利用模型以替代實(shí)際試驗(yàn)，節(jié)省設(shè)計(jì)和開發(fā)成本。

1.6 表面等離子共振法

當(dāng)入射光以一定的入射角照射到金表面時(shí)，一部分光能穿過金層與金表面層中的電子耦合，電子由于激發(fā)在平行于金屬表面方向上移動(dòng)，發(fā)生表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR），物質(zhì)附著在金屬表面時(shí)會導(dǎo)致SPR 頻率變化，即SPR 共振角變化[128-129]，如圖6a 所示。當(dāng)AFB1與SPR 傳感器芯片上抗體或者適配體結(jié)合時(shí)，會引起金屬表面質(zhì)量濃度的變化，產(chǎn)生明顯的SPR 信號響應(yīng)，以此實(shí)現(xiàn)AFB1檢測[130-131]，如圖6b所示。

圖6 SPR 原理圖（a）和適體修飾SPR 芯片直接檢測AFB1 的傳感圖（b）[130]Fig.6 The schematic diagram（a） and senorgram for the direct SPR detection of AFB1 using aptamer coated chip（b）[130]

Park 等[132]通過基因工程技術(shù)得到融合蛋白作為雙功能交聯(lián)劑，無需任何化學(xué)處理即可將抗體快速固定在金表面，開發(fā)的SPR 生物傳感器可快速檢測玉米中AFB1，LOD 為1 μg/mL。Moon 等[133]將Cys-蛋白G、AFB1抗體和BSA 依次修飾在SPR 的Au 芯片表面。樣品中AFB1和AFB1-BSA與固定在芯片上的抗體競爭結(jié)合。缺少AFB1時(shí)，AFB1-BSA 與抗體結(jié)合，導(dǎo)致SPR 響應(yīng)信號大大提高。建立的便攜式SPR 免疫分析傳感器對谷物中的AFB1的檢測范圍為16～200 μg/L，LOD 為2.51 μg/L。Sun 等[130]將適配體固定在商用傳感器芯片的表面上直接測定AFB1，AFB1與適配體結(jié)合時(shí)SPR 信號增加。傳感器芯片可通過流注緩沖劑將綁定的AFB1從適體上解離實(shí)現(xiàn)再生。該方法的檢測范圍為0.4～200 nmol/L，LOD 為0.4 nmol/L。該方法靈敏度高、穩(wěn)定，芯片可再生，克服了基于抗體競爭性SPR 分析法的限制。SPR 還可以對多種霉菌毒素進(jìn)行同時(shí)檢測[134-135]。例如，Wei 等[135]分別將AFB1、ZEN、赭曲霉毒素A（OTA）和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）固定芯片上，利用直接競爭免疫模式構(gòu)建SPR 傳感方法同時(shí)檢測AFB1、ZEN、OTA、DON，其LOD 分別為0.59，7.07，1.27 ng/mL和3.26 ng/mL。4 種霉菌毒素的交叉反應(yīng)性均較低，與HPLC-MS/MS 分析結(jié)果具有很好的一致性。SPR 重要的用途之一是計(jì)算抗體親和力和反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，Puiu 等[136]利用SPR 研究乙酰膽堿酯 酶（Acetylcholinesterase，AChE）與AFB1、AFB1-HRP 之間的結(jié)合動(dòng)力學(xué)，發(fā)現(xiàn)AChE/AFB1-HRP相互作用的離解速率常數(shù)Kd為0.4 μmol/L。將AchE 固定在芯片上，AFB1和AFB1-HRP 競爭性結(jié)合AchE 構(gòu)建SPR 檢測法，其線性范圍為0.94～3.75 ng/mL，LOD 為0.94 ng/mL。SPR 生物傳感器對AFs 的檢測具有實(shí)時(shí)、免標(biāo)記、試劑消耗少的優(yōu)勢，然而SPR 法存在設(shè)備體積大、價(jià)格昂貴、消費(fèi)者較難承受等問題限制了該方法的實(shí)際應(yīng)用。

1.7 微懸臂梁檢測法

微懸臂梁（Micro cantilevers，MCs）檢測法是在原子力顯微鏡法和微機(jī)電系統(tǒng)下發(fā)展起來的。其基本原理是微懸臂梁傳感器在壓力模式下，目標(biāo)分子與受體結(jié)合后轉(zhuǎn)換成表面壓力，在微米級懸空的臂梁一端產(chǎn)生表面壓力使懸臂彎曲，通過檢測懸臂的偏轉(zhuǎn)來得到信號[137]。MCs 有靜態(tài)和動(dòng)態(tài)兩種工作模式。靜態(tài)模式下，目標(biāo)分子與MC 表面上受體結(jié)合引起的應(yīng)力導(dǎo)致懸臂偏轉(zhuǎn)，通過檢測表面應(yīng)力傳感器光束偏轉(zhuǎn)來測定。動(dòng)態(tài)模式下，懸臂表面物質(zhì)的吸附或釋放改變了微懸臂梁的共振頻率，通過檢測傳感器的頻率變化得到信號[138]。MCs 具有靈敏度高、免標(biāo)記、制造成本低、試劑/樣品消耗低等優(yōu)點(diǎn)[139-141]，已被開發(fā)用于檢測AFB1[142]，如圖7所示。

圖7 采用ELISA 在微懸臂陣列上進(jìn)行免疫反應(yīng)的示意圖[143]Fig.7 Schematic diagram of the immunological reactions on the microcantilever arrays using ELISA[143]

Zhou 等[143]將AFB1巰基化后固定在懸梁陣列的金表面，靜態(tài)模式下的微梁傳感器能夠?qū)ㄉ蠥FB1進(jìn)行定量檢測，LOD 為0.03 ng/mL。Ferrante 等[144]提出了一種快速、高通量的MCs 檢測平臺。該平臺能夠使用簡單易用的對齊機(jī)制工作，傳感器芯片由9 個(gè)樣品架位置點(diǎn)組成，每個(gè)位置點(diǎn)中含有11 個(gè)微懸臂梁，對芯片可以進(jìn)行順序讀出，不會受幾何形狀和大小的限制。該方法能夠檢測天然污染堅(jiān)果中AFB1的含量，LOD 為40 pg/mL。Ricciardi 等[145]使用了一種基于抗體固定化微懸臂梁技術(shù)的真菌毒素檢測的新型免疫傳感方法，證明了使用微懸臂梁共振器陣列在低濃度（分別為3 ng/mL 和小于6 ng/mL）下有效地鑒別總黃曲霉毒素和軟骨毒素A 的可行性，對不同的真菌毒素具有有限的交叉反應(yīng)性。MCs 芯片表面的鈍化處理、反射、抗體的固定容易影響檢測的靈敏度和重復(fù)性，需要進(jìn)一步研究。

2 結(jié)論與展望

AFs 毒性極強(qiáng)，容易污染食品，對健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。傳統(tǒng)的色譜、質(zhì)譜等儀器檢測方法結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，但設(shè)備昂貴、檢測程序復(fù)雜，不適合大批量樣品的檢測，難以滿足基層監(jiān)管過程中快速出檢測結(jié)果的需求，不便推廣應(yīng)用。因此，開發(fā)快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏的檢測技術(shù)已成為AFs 研究的緊迫任務(wù)。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)場快速定量測定AFs 已成為研究熱點(diǎn)，其中基于免疫學(xué)的快速檢測方法已成為最具競爭力的分析檢測技術(shù)之一，應(yīng)用潛力巨大。免疫學(xué)方法具有高靈敏度和特異性，不需要笨重且昂貴的設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)，可在不進(jìn)行繁瑣預(yù)處理下分析復(fù)雜的食品基質(zhì)?；诿庖呒夹g(shù)開發(fā)而來的比色法、熒光法、免疫層析法、電化學(xué)法、QCM 法、SPR 法和MCs 法等AFs 檢測方法具有廣闊的應(yīng)用前景。比色法快速、簡便，結(jié)果可以通過肉眼直接觀察，具有現(xiàn)場應(yīng)用潛力。然而，常規(guī)的ELISA 中孵育和洗滌耗時(shí)長，標(biāo)記的酶在儲存、使用過程存在變性和降解的問題。與比色法相比，熒光法具有高度特異性和靈敏性，然而QDs存在光漂白。食品基質(zhì)中的部分有機(jī)物存在熒光效應(yīng)，導(dǎo)致熒光法應(yīng)用范圍受到限制。免疫層析法制作簡單、成本低，適用于現(xiàn)場檢測，是快速篩選食品和原材料的有力工具，因其信號強(qiáng)低度、靈敏度不高，常用于AFs 的定性或半定量快速檢測。電化學(xué)法具有靈敏度高、微型化、可再生的優(yōu)點(diǎn)，商業(yè)化程度較高，已被證明是具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的檢測方法，然而需要解決復(fù)雜的電極修飾和對環(huán)境敏感的問題。QCM 法、SPR 法和MCs 法均可進(jìn)行無標(biāo)記的實(shí)時(shí)檢測，具有響應(yīng)快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，然而其實(shí)際應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。以上介紹的基于免疫法開發(fā)的AFs 檢測方法各自有優(yōu)勢，也存在共性問題。未來主要發(fā)展方向有：1）新的生物識別單元（如納米抗體、重組抗體、肽、適體、MIP/nanoMIP 等）的合成和開發(fā)。識別單元的親和力和特異性在很大程度上決定了方法的靈敏度和選擇性。特別是在開發(fā)快速檢測方法時(shí)，采用簡化處理樣本、縮短檢測時(shí)間的策略保證檢測效果時(shí)，則需要額外增強(qiáng)特異性和靈敏度?？贵w雖然特異性強(qiáng)，但制作繁瑣、成本昂貴、穩(wěn)定性差，導(dǎo)致使用成本高。需要發(fā)展或合成具有高親力的親和新配體，特別是需要開發(fā)特異性強(qiáng)、穩(wěn)定好、成本低的親和配體，如適配體、重組抗體通過新突破來克服生物識別單元中特異性的限制，著眼于開發(fā)更靈敏的抗體/人工抗體、更廉價(jià)的抗體制備方法、合成特異性更強(qiáng)、穩(wěn)定性更好的納米材料代替抗體是發(fā)展方向。2）新型檢測策略的開發(fā)。納米材料在信號載體和信號放大方面具有增強(qiáng)檢測性能的作用，合成新型多功能納米材料用于開發(fā)新策略檢測AFs。同時(shí)針對不同檢測策略和使用環(huán)境優(yōu)化納米材料性能。3）高效的樣品前處理技術(shù)的研究。目前的快速檢測基本上能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成，然而樣品前處理時(shí)間較長，需要開發(fā)高效分離和富集技術(shù)，縮短樣品處理時(shí)間，同時(shí)避免基質(zhì)效應(yīng)和非特異性吸附等問題。其中功能性的MNPs 潛力巨大，需要進(jìn)一步探索。4）多目標(biāo)物傳感器和陣列的開發(fā)。實(shí)際食品樣品中可能同時(shí)出現(xiàn)多種污染物及相應(yīng)的衍生物，使用多目標(biāo)物傳感器和陣列同時(shí)分析有利于對污染物的快速篩查。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，將清洗、富集、孵育、檢測等操作步驟集成，設(shè)計(jì)多通道可以對多目標(biāo)物同時(shí)進(jìn)行檢測，能有效提高檢測效率，進(jìn)一步降低使用成本。2017年國家食品藥品監(jiān)管總局組織制定了《食品快速檢測方法評價(jià)技術(shù)規(guī)范》，為開發(fā)AFs 快速檢測方法提供了標(biāo)準(zhǔn)和依據(jù)，免疫檢測技術(shù)將在未來會得到更多的發(fā)展，逐步滿足靈敏度、簡便性、智能性和便攜性的需求。