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    Ⅱ類細菌素的生物合成及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用

    2021-11-22 06:35:02龍春昊趙星宇張曉雯伊揚磊
    中國食品學報 2021年10期
    關(guān)鍵詞:前導(dǎo)細胞膜多肽

    李 萍,龍春昊,趙 軒,趙星宇,張曉雯,呂 欣,伊揚磊*

    (1 西安交通大學生命科學與技術(shù)學院 西安 710049 2 南方科技大學醫(yī)學院 廣東深圳 518055 3 西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院 陜西楊凌 712100)

    近年來,食源性致病菌和腐敗菌引起的中毒事件使人們認識到食品微生物污染的嚴重性,常見的化學防腐劑不規(guī)范使用容易在人體內(nèi)殘留,進而對人類健康產(chǎn)生危害。具有安全、高效等天然優(yōu)勢的新型抗菌物質(zhì)——乳酸菌細菌素,逐漸進入食品安全領(lǐng)域。

    乳酸菌細菌素是乳酸菌合成的具有抑菌或殺菌活性的多肽或者蛋白質(zhì),具有較好的耐酸堿性和穩(wěn)定性。乳酸菌細菌素廣泛存在于自然界中,種類多樣,根據(jù)其生物合成過程和結(jié)構(gòu)特點可分為兩大類:I 類細菌素和II 類細菌素[1-2]。I 類細菌素是需要經(jīng)過翻譯后修飾的細菌素,分子內(nèi)部分氨基酸殘基(絲氨酸和蘇氨酸)在相關(guān)酶的作用下脫水,并與半胱氨酸殘基通過硫醚鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),此類細菌素含有不飽和氨基酸、羊毛硫氨酸或3-甲基羊毛硫氨酸等氨基酸,具有較高的熱穩(wěn)定性。Ⅱ類細菌素為不含羊毛硫氨酸殘基,且不經(jīng)過翻譯后修飾的膜活性多肽。I 類細菌素的乳酸鏈球菌素(Nisin)已被商品化應(yīng)用,且效果得到公認,然而,由于主要作用靶點是細菌細胞壁前體lipidII,因此只能抑制革蘭氏陽性菌,限制了其應(yīng)用范圍。相對于I 類細菌素,II 類細菌素具有更寬的抑菌譜,而且某些亞類能有效抑制某些耐藥性的革蘭氏陰性菌。由于II 類細菌素在自然條件下產(chǎn)量較低且不穩(wěn)定,因此還沒有實現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。

    為進一步拓展II 類細菌素在食品防腐領(lǐng)域的優(yōu)勢,進而使更多種類的細菌素應(yīng)用于食品安全領(lǐng)域,本文綜述了II 類細菌素的編碼基因結(jié)構(gòu)、合成調(diào)節(jié)機理、多肽結(jié)構(gòu),以及殺菌和自身免疫機理,展望了II 類細菌素在食品領(lǐng)域的應(yīng)用前景。

    1 乳酸菌細菌素的分類

    乳酸菌細菌素是乳酸菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌或者殺菌效應(yīng)的多肽或者蛋白質(zhì),主要表現(xiàn)為對同種或者近緣菌種有特異性的抑制作用[3-4]。乳酸菌細菌素是典型的革蘭氏陽性菌細菌素,主要靶標菌為枯草芽孢桿菌、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌,也有研究發(fā)現(xiàn)少數(shù)乳酸菌細菌素能夠殺滅沙門氏菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌[5]。不同的乳酸菌細菌素在編碼基因結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、蛋白結(jié)構(gòu)、功能及調(diào)控等方面都存在較大的差異。為更好地研究乳酸菌細菌素,研究者按照其分子結(jié)構(gòu)特征將其分為以下4 類[2,6]:

    I 類:核糖體肽類的天然產(chǎn)物(RiPPs),分子質(zhì)量小于10 ku,經(jīng)大范圍翻譯后修飾而成的核糖體小肽,其含有羊毛硫氨酸,β-甲基羊毛硫氨酸等對分子的性質(zhì)有一定影響的結(jié)構(gòu)。

    II 類:分子質(zhì)量小于10 ku,是翻譯后未經(jīng)修飾的多肽,具有一定的熱穩(wěn)定性、膜活性。

    III 類:分子質(zhì)量大于10 ku,是未經(jīng)修飾、熱敏感的大分子蛋白類細菌素。

    Ⅳ類:蛋白質(zhì)復(fù)合物,其結(jié)構(gòu)除包含蛋白部分,還有其它化學成分,如類脂、碳水化合物等。有學者提出應(yīng)將IV 類細菌素命名為由Interleukin S和Lactacin 27 組成的溶菌素。

    在上述乳酸菌細菌素中,I 類和II 類細菌素分子質(zhì)量較小,種類數(shù)量較多,且抑菌活性好,熱穩(wěn)定性高,可以保護食品免受特定致病菌的污染,在發(fā)酵食品中賦予了食品類似于先天免疫的抗菌能力,具有很大的應(yīng)用價值[7]。乳酸菌細菌素大部分由食品級乳酸菌(Lactic Acid Bacteria,LAB)產(chǎn)生,本質(zhì)為蛋白質(zhì)或者多肽,易被人體降解,這也提供了一種人工調(diào)控食品微生物的可能。這些年來,隨著越來越多的細菌素被發(fā)現(xiàn),I 類細菌素的分類、轉(zhuǎn)運機制、調(diào)節(jié)機制等已十分清晰,且也已經(jīng)有相關(guān)綜述完成了這方面的總結(jié)[6],然而,對于II 類細菌素的研究深度還不夠。

    為深入研究II 類細菌素,有許多研究者對此類細菌素進行了分類。2005年Cotter 等[8]將Ⅱ類細菌素進一步分類為4 個亞類,分別為:片球菌素類細菌素、雙肽類細菌素、環(huán)狀細菌素、非片球細菌素單一線性肽。2016年,Alvarez-Sieiro[6]對乳酸菌細菌素的分類方式進行整理,將其分為3 類:I 類、II 類和III 類,并將IIc 類細菌素定義為無前導(dǎo)序列細菌素。也有學者將乳酸菌細菌素分為3 類:I類、II 類和III 類[2],不同的是,其IIc 類細菌素為環(huán)狀細菌素,而將無前導(dǎo)肽細菌素歸為IId 類細菌素。作者以上述最后一種分類方式為依據(jù)(表1),分類闡釋Ⅱ類細菌素中4 種亞類細菌素的生物學特性。

    表1 II 類細菌素的分類方式Table 1 Classification of class II bacteriocins

    2 Ⅱa 細菌素

    Ⅱa 類細菌素分子質(zhì)量小(<10 ku),有37~48個氨基酸殘基,熱穩(wěn)定性好,帶凈正電荷,pI 值于8~10 之間,具有兩親性或疏水性[19]。IIa 類細菌素以片球菌素(Pediocin PA-1)為代表,故也稱片球菌素類,其最顯著特點是可以高效抑制食源性病原菌單增李斯特氏菌的生長,并且對某些腐敗乳酸菌、索絲菌、梭狀桿菌、芽孢桿菌、葡萄球菌等都有明顯的抑制作用,在食品腐敗菌及病原菌的控制方面具有潛在應(yīng)用價值[20]。

    2.1 編碼基因的結(jié)構(gòu)

    Ⅱa 類細菌素的產(chǎn)生都與質(zhì)粒有關(guān),通常由1~3 個操縱子組成,這些操縱子與細菌素的跨膜定位、產(chǎn)生菌的自身免疫以及細菌素生物合成的調(diào)控密切相關(guān)。多數(shù)情況下,控制細菌素結(jié)構(gòu)和功能的基因分布在不同的操縱子中,有的操縱子攜帶結(jié)構(gòu)和免疫基因,有的攜帶分泌基因,還有的攜帶與細菌素調(diào)控有關(guān)的基因。也有一些IIa 類細菌素的結(jié)構(gòu)和免疫基因與細菌素分泌基因是在同一個操縱子上,如Leucocin A、Mesentericin 52A(圖1),這種結(jié)構(gòu)特點使細菌本身能夠最大限度地免受自身細菌素的殺傷作用。另外,還有一些IIa 類細菌素的合成相關(guān)的4 個基因在一個操縱子上轉(zhuǎn)錄,如Pediocin PA-1、Enterocin A、Carnobacteriocin B2、Piscicolin 126 等(圖1)。故而IIa 類細菌素生物合成過程中所需的編碼基因存在方式和位置是多樣的。

    圖1 IIa 類細菌素的合成基因簇結(jié)構(gòu)Fig.1 Synthetic gene cluster structure of class IIa bacteriocin

    2.2 多肽結(jié)構(gòu)特點

    IIa 類細菌素的N 端具有親水性,且含有大量陽離子,其保守序列為YGNGVxCxCxVx(Y 為酪氨酸;G 為甘氨酸;N 為天冬酰胺;V 為纈氨酸;C 為半胱氨酸;K 為賴氨酸;x 為任意氨基酸),此序列也被稱為“片球菌素序列框”(圖2),此外N 端還有一個包含二硫鍵的穩(wěn)定β 折疊[21],N 端在前導(dǎo)序列的分裂和成熟分子的跨膜運輸中作為識別信號發(fā)揮作用,且發(fā)揮作用后被切除。

    IIa 類細菌素的C 端為兩親性的α 螺旋結(jié)構(gòu),可使細菌素與靶標菌特異性結(jié)合,介導(dǎo)膜穿孔和胞質(zhì)泄露[22]。C 端序列相似性較低(通常只有34%~80.5%)[23],故隨著新成員的出現(xiàn),亞群的定義可能基于細菌素C 端的相似度。有少數(shù)Ⅱa 類細菌素的C 端也存在二硫鍵(圖2),如Pediocin PA-1[20],Enterocin A 和Sakacin G[24],此二硫鍵極大地穩(wěn)定了α 螺旋的結(jié)構(gòu),賦予細菌素更好的耐熱性。

    圖2 Ⅱa 類細菌素的多肽序列對比(C-C 為二硫鍵)Fig.2 Comparison of peptide sequences of class Ⅱa bacteriocin(C-C represent disulfide bond)

    2.3 轉(zhuǎn)運機制

    剛翻譯的Ⅱa 類細菌素前體在細胞內(nèi)不具有殺菌活性,其N 端有前導(dǎo)序列。前導(dǎo)序列具有兩方面的生物學功能:第一,使得細菌素前體在宿主細胞內(nèi)保持無活性狀態(tài),防止細菌素對自身造成殺傷;第二,前導(dǎo)序列作為被識別信號,與相應(yīng)的轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)生相互作用,促進細菌素的轉(zhuǎn)運。Ⅱa 類細菌素有2 種轉(zhuǎn)運體系,多數(shù)為雙甘氨酸系統(tǒng)(ABC 轉(zhuǎn)運型),也有少數(shù)為信號肽依賴系統(tǒng)(sec-分泌系統(tǒng))。

    雙甘氨酸系統(tǒng)主要包括ABC 轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABCT)和輔助蛋白。ABC 轉(zhuǎn)運蛋白定位于細胞膜上,包含C 端和N 端兩個結(jié)構(gòu)域。其中,C 端為ATP 結(jié)合結(jié)構(gòu)域,通過水解ATP 供能,使細菌素轉(zhuǎn)運至細胞外;N 端為蛋白酶結(jié)構(gòu)域,其疏水區(qū)域與兩親性α 螺旋前體上的疏水殘基結(jié)合,從而在甘氨酸-甘氨酸結(jié)構(gòu)處切割細菌素前導(dǎo)序列并釋放成熟的細菌素??傮w來講,大多數(shù)Ⅱa 類細菌素的轉(zhuǎn)運過程如下:先由乳酸菌核糖體合成不具活性的前體細菌素,隨后在靜電相互作用下,前體細菌素帶正電的前導(dǎo)序列與帶負電的ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的水解結(jié)構(gòu)域結(jié)合,ATP 水解并引發(fā)ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象變化并切除前導(dǎo)序列的雙甘氨酸(GG),如Pediocin PA-1(MKKIEKLTEKEMANIIGG,下劃線標記部分為信號肽切割位點)、Leucocin A(MNMKPTESYEQLDNSALEQVVGG,下劃線標記部分為信號肽切割位點),同時將成熟分子運輸至胞外[25]。

    某些細菌素雖無雙甘氨酸前導(dǎo)序列合成酶,但是具有依靠Sec 移位酶的依賴性信號肽,細菌素的轉(zhuǎn)運主要依靠信號肽依賴系統(tǒng)[26],如Ente rocin P(信號肽為HRKKLFSLALIGIFGLVVTN FGTKVDA,下劃線標記部分為信號肽切割位點)、Bacteriocin 31(信號肽為HKKKLVICGIIGIGFTAL GTNVEA,下劃線標記部分為信號肽切割位點)[27]。

    2.4 殺菌及自身免疫機制

    Ⅱa 類細菌素的殺菌機制主要為細菌素N 端保守序列形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)與目標菌株細胞膜表面蛋白特異性識別,其中帶正電的β 折疊與帶負電的磷脂雙分子層通過靜電力結(jié)合在細胞膜上,然后疏水的C 端進入目標膜的疏水中心形成膜通道,從而引起細胞內(nèi)各種離子的滲透和能量物質(zhì)的消耗,造成膜內(nèi)、外離子和磷酸鹽失衡,質(zhì)子動力被耗散,氨基酸的攝?。ㄗ鳛榛钚赃\輸?shù)慕橘|(zhì))就會被阻斷,細胞的正常生理活動會因此受阻。目前,Ⅱa 類細菌素常見的靶細胞膜表面識別系統(tǒng)為甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Mannose phosphotransferase system,man-PTS)。借助甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶形成膜通道的方法主要有2 種(圖3):改變man-PTS 的構(gòu)象形成通道;以細菌素低聚物形成通道[9],第2 種殺菌方式會受細菌素濃度的影響,細菌素濃度越高,形成低聚物的可能性越強,細菌素的殺菌活性越好,Ⅱa 類細菌素殺死單增李斯特氏菌便通過第2 種方式(如Pediocin PA-1)[28]。特殊的是,當Pediocin PA-1 作用于大腸桿菌細胞膜時,借助的是富含磷脂雙分子層的脂囊泡受體而非特異性識別蛋白,其具體作用機理有待進一步探索[29]。

    圖3 Ⅱa 類細菌素殺菌機制Fig.3 The bactericidal mechanism of class IIa bacteriocin

    產(chǎn)細菌素的菌株一般都會有相應(yīng)的免疫機制保護自己免受自身所產(chǎn)細菌素的傷害,產(chǎn)Ⅱa 類細菌素的乳酸菌主要是靠88~114 個氨基酸組成的免疫蛋白保護自己,免疫蛋白結(jié)合于細胞膜內(nèi)側(cè),保護自身的方式主要有2 種:(1)借助細胞膜或者鑲嵌在細胞膜中的某些分子與細菌素間接結(jié)合,阻礙膜通道的形成;(2)通過改變細菌素在膜上的結(jié)合位點,從而干擾細菌素的結(jié)合以保護生產(chǎn)菌株,比如Lactococcin A[30]。免疫蛋白也存在交叉免疫現(xiàn)象,即某種細菌的免疫蛋白除了對自身生產(chǎn)的細菌素有完全免疫作用之外,對部分其它細菌素也存在免疫作用。這種交叉免疫現(xiàn)象似乎與2種細菌素的同源性關(guān)系不大,例如:Sakacin P 和Pediocin PA-1 的同源性只有28%,而它們的免疫蛋白均可對2 種細菌素產(chǎn)生免疫作用[31]。

    2.5 調(diào)控機制

    Ⅱa 類細菌素的調(diào)控機制中最常見的是群體感應(yīng)調(diào)節(jié)(Quorum sensing,QS)。QS 系統(tǒng)主要由自誘導(dǎo)肽(Autoinducing peptide,AIP)、跨膜組氨酸蛋白激酶(Histidine protein kinase,HPK)以及存在于細胞質(zhì)中的感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白(Response regulator protein,RR)組成,故也稱為三組分系統(tǒng)[32]。當然還有部分細菌素是由跨膜組氨酸蛋白激酶和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白組成的雙組分系統(tǒng)(Two component system,TCS)調(diào)節(jié),如發(fā)散肉桿菌V41(Carnobacterium divergensV41)產(chǎn)生的Divercin V41。除此之外,還有由兩種系統(tǒng)一同調(diào)控表達的細菌素,如Carnobacteriocins。

    三組分系統(tǒng)的調(diào)控主要分為4 步(圖4)[33]:(1)細菌的核糖體合成一些誘導(dǎo)肽的前體肽段,加工修飾并經(jīng)過ABC 轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運到細胞外,形成有成熟的AIPs;(2)成熟的誘導(dǎo)肽可作為信號分子感應(yīng)環(huán)境因子和菌群密度變化,且其濃度隨細胞濃度的增加而增加,當AIPs 達到臨界閾值時,被與膜結(jié)合的傳感酶探測到,從而激活受體酶與細胞膜上的HPK 相互作用;(3)結(jié)合后的肽配體通過磷酸化激酶啟動信號傳導(dǎo)級聯(lián),感應(yīng)蛋白檢測到信號后進行自身磷酸化;(4)磷酸化的感應(yīng)蛋白將C 端組氨酸上的磷酸基團轉(zhuǎn)移到與其同源的RR的天冬氨酸的殘基上,磷酸化的RR 作為一個轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合到啟動子上,增強目標基因的轉(zhuǎn)錄,得到多個前體肽(不具有生物活性);(5)三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)結(jié)合于ABC 轉(zhuǎn)運蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABCT)的蛋白水解區(qū)域,之后前體肽的引導(dǎo)序列與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合,三磷酸腺苷(ATP)水解放能,隨后轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變,導(dǎo)致前體肽引導(dǎo)序列被切除,并在輔助蛋白的協(xié)助下,將成熟的細菌素運送至胞外。

    圖4 Ⅱa 類細菌素群體效應(yīng)的調(diào)節(jié)Fig.4 Quorum-sensing regulatory mechanism of class IIa bacteriocin

    外界因素對乳酸菌細菌素的產(chǎn)生也具有調(diào)控作用,環(huán)境因素可能影響受體蛋白和HPK 的結(jié)合,或者RR 活化所需的磷酸化平衡等。除了細胞密度依賴調(diào)節(jié)外,Ⅱa 細菌素的生物合成也會受生長溫度、離子強度和pH 值等條件的影響。在某些條件下,細菌素產(chǎn)量可以達到最高,或者細菌素在不同環(huán)境條件下表現(xiàn)出相同或相似的抗菌活性,如Pediocin PA-1 由于其C 端二硫鍵的穩(wěn)定作用,在20 ℃和37 ℃時表現(xiàn)出相似的抗菌活性[34]。

    3 Ⅱb 類細菌素

    IIb 類細菌素也稱雙肽細菌素,由2 條物質(zhì)的量相等的多肽組成,2 條多肽相互作用,使細菌素具有較高的抑菌活性。

    3.1 基因的結(jié)構(gòu)

    IIb 類細菌素的產(chǎn)生需要多種不同的基因,它們排列在1 個或多個操縱子中,這些基因包含編碼細菌素前體的2 個結(jié)構(gòu)基因、編碼ABC 轉(zhuǎn)運蛋白的基因、編碼免疫蛋白的基因和編碼副蛋白的基因(其可能與細菌素的免疫和轉(zhuǎn)運有關(guān))[35]。Ⅱb類細菌素的2 個結(jié)構(gòu)基因總是在同一操縱子上,而且常伴隨1 個免疫基因(圖5)。有些細菌素調(diào)控系統(tǒng)的相關(guān)基因也與細菌素的結(jié)構(gòu)基因在同一個操縱子上,如Carnobacteriocin XY(圖5)。另外,植物乳桿菌C11(Lactobacillus plantaricinC11)能表達2 種Ⅱb 類細菌素Plantaricin EF、Plantaricin JK(圖5),plnGHSTUVW編碼ABC 轉(zhuǎn)運蛋白和相關(guān)副蛋白,plnABCD編碼QS 系統(tǒng)所需的相關(guān)調(diào)控基因,plnMNOP為與細菌素成熟相關(guān)基因,保持含有前導(dǎo)序列的細菌素在胞內(nèi)處于無活性的狀態(tài),brnQ1 和napA1 無特定功能,但存在于多數(shù)Plantaricin 類細菌素(如Plantaricin EF、JK、NC8)的序列框的起始位置,用于指示細菌素合成基因簇的范圍[36]。

    圖5 IIb 類細菌素的合成基因簇結(jié)構(gòu)Fig.5 Synthetic gene cluster structure of class IIb bacteriocin

    3.2 多肽的結(jié)構(gòu)

    Ⅱb 類細菌素一般由2 條物質(zhì)的量相等,平行(或反向平行)排列的多肽組成[37]。研究表明大多數(shù)此類細菌素的2 條多肽直接相連而發(fā)揮作用,比 如Lactococcin G[38]、Plantaricin EF[39]、Plantaricin JK[40]。Ⅱb 類細菌素每條多肽的N 端為兩親或疏水性,C 端為兩親或親水性,而且每條多肽的兩端都有α 螺旋,而N 端比C 端的短。α 螺旋內(nèi)部通常有GxxxG 或者類似的保守的氨基酸序列,如AxxxA、SxxxS 序列(表2),這種特殊序列可增強2 條多肽的相互作用,并形成跨膜螺旋-螺旋結(jié)構(gòu),在一定程度上增強細菌素的抑菌活性。

    表2 IIb 類細菌素氨基酸序列Table 2 Amino acid sequence of class IIb bacteriocin

    依據(jù)2 條多肽單獨存在時抑菌效果,將Ⅱb類細菌素可以分為E 型和S 型,E 型細菌素每一條多肽都有活性,而2 條多肽共同存在時抑菌活性更強,如Plantaricin EF[39]等;S 型細菌素的活性依賴于2 條多肽,任何一條多肽單獨存在都不具有生物活性,如Lactococcin G[38]等,Ⅱb 類細菌素多為前者。另外,Enterocin X 的2 條多肽的生物活性又會隨著指示菌株的功能而變化[45]。

    3.3 細菌素轉(zhuǎn)運機制

    Ⅱb 類細菌素的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)為雙甘氨酸系統(tǒng),與Ⅱa 類細菌素轉(zhuǎn)運所不同的是,Ⅱb 類細菌素需要同時轉(zhuǎn)運2 條多肽。新合成的細菌素的2 條前體肽均帶有雙甘氨酸型前導(dǎo)序列,這段前導(dǎo)序列使得細菌素在被運輸出細胞之前保持無活性狀態(tài),在一定程度上保護生產(chǎn)菌株不受自己所產(chǎn)細菌素的破壞。特異性轉(zhuǎn)運蛋白ABCT 切割2 條多肽的雙甘氨酸序列使其具有生物學活性,同時將2 條成熟多肽運出細胞發(fā)揮相應(yīng)的殺菌作用。

    3.4 殺菌及自身免疫機制

    Ⅱb 類細菌素的GxxxG 類保守序列使2 條多肽形成的膜透性螺旋-螺旋結(jié)構(gòu),之后螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)與靶細胞膜上的識別蛋白結(jié)合并使其發(fā)生構(gòu)象變化,形成復(fù)雜而有特異性的孔[38],改變對各種小分子的通透性,使膜內(nèi)外離子失衡,導(dǎo)致細胞死亡。不同的細菌素對細胞膜通透性的影響程度不同,如Lactococcin G 會增強靶細胞膜對各種單價陽離子的通透性[46],其在靶細胞膜上的定位如圖6所示;Plantaricin EF 和Plantaricin JK 均可以增強靶細胞膜對氫離子等單價離子的通透性[47]。

    圖6 Lactococcin G 的結(jié)構(gòu)及其在靶細胞膜上的位置Fig.6 The structure of Lactococcin G and its position on the target cell membrane

    不同細菌素的靶細胞識別蛋白不同,Lactococcin G 的靶細胞識別蛋白為高度保守的跨膜蛋白UppP 蛋白(Undecaprenyl pyrophosphate phosphatase),其在十一烷基焦磷酸去磷酸化成十一烷基磷酸的過程中起作用[48],另外與Lactococcin G具有高度相似的Lactococcin Q 和Enterocin 1071也可識別此蛋白[44]。Plantaricin EF 的靶細胞膜識別蛋白為CorC 蛋白,一種錳、鈷介導(dǎo)的膜蛋白(Membrane-bound,magnesium/cobalt efflux protein)[49];Plantaricin JK 的識別蛋白為APC 轉(zhuǎn)運蛋白(Amino acid-polyamine-organocation APC transporter protein)[50];Thermophilin 13、Brochocin C 等細菌素還未發(fā)現(xiàn)特定的靶蛋白,它們可能通過某些非特異性作用造成細胞內(nèi)外離子失衡[51-52]。

    產(chǎn)IIb 類細菌素的乳酸菌同樣可以借助免疫蛋白來防止被自己產(chǎn)生的細菌素殺死。到目前為止,已經(jīng)有多個Ⅱb 類細菌素的免疫蛋白被鑒定,然而其具體的免疫機理仍有待研究。Ⅱb 類細菌素的免疫蛋白大多為膜蛋白,且都包含跨膜結(jié)構(gòu)域(Transmembrane domains,TMDs)[35],然而不同細菌素的免疫蛋白在多肽的長度、TMD 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量、免疫蛋白在細胞膜上的定位等方面仍有不同[53]。有研究表明,有些免疫蛋白具有跨膜螺旋結(jié)構(gòu),比如Plantaricin S 的免疫蛋白包含2 個跨膜螺旋[54]、Plantaricin EF 包含4~5 個跨膜螺旋[47],故而猜測這些免疫蛋白可能通過影響細菌素雙螺旋結(jié)構(gòu)在靶細胞膜上的定位進而達到對細菌素的免疫效果。一些細菌素的免疫蛋白為Abi 蛋白(由Abi基因編碼),一種帶有3 個保守結(jié)構(gòu)域(ExxxR、FxxxH 和組氨酸)的膜金屬蛋白酶,此蛋白可抑制多個同源細菌素保護生產(chǎn)菌株,如Lactococcin MN、Lactococcin JK[55];一些免疫蛋白也可通過影響細菌素或者細菌素的識別蛋白發(fā)揮作用[53],如Lactococcin G 的免疫蛋白LagC、Lactococcin MN 的免疫蛋白LciM。

    3.5 調(diào)控機制

    絕大多數(shù)Ⅱb 類細菌素的產(chǎn)生是由三組分的QS 系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控,與Ⅱa 類細菌素的三組分調(diào)控系統(tǒng)不同的為Ⅱb 類細菌素系統(tǒng),可同時調(diào)控2條多肽的表達。

    4 Ⅱc 類細菌素

    IIc 類細菌素也稱環(huán)狀細菌素,細菌素前體只有以首尾肽鍵連接形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮作用,環(huán)化作用使IIc 類細菌素對蛋白酶、高溫和極端pH 條件的敏感性降低,賦予細菌素更高的穩(wěn)定性。

    4.1 編碼基因的結(jié)構(gòu)

    IIc 類細菌素的合成基因簇結(jié)構(gòu)包含細菌素編碼基因、轉(zhuǎn)運相關(guān)基因、免疫基因和一種特殊的保守基因[56](圖7),特殊的保守基因負責編碼DUF95 蛋白,屬于SpoIIM 蛋白家族,包含DUF95結(jié)構(gòu)域(Unknown function 95)。一般情況下,野生型菌株細胞內(nèi)部很難分離出成熟的Ⅱc 類細菌素,然而若將DUF95 蛋白移除,便可以從細菌內(nèi)部分離出環(huán)狀細菌素[57-58],這說明DUF95 蛋白可能與此類細菌素的轉(zhuǎn)運有關(guān)。另外,Enterocin AS-48(AS-48)的基因簇可編碼2 個ABC 轉(zhuǎn)運蛋白,一個為AS-48 C1D 蛋白,其主要作用于前體肽的前導(dǎo)序列的切割、成熟細菌素的轉(zhuǎn)運以及很低水平生產(chǎn)細菌的自我免疫,另一個為as-48EFGH基因編碼的ABC 轉(zhuǎn)運復(fù)合體,其可與前者相互作用,從而提高生產(chǎn)菌株的免疫能力[59]。

    圖7 部分IIc 類細菌素的合成基因簇結(jié)構(gòu)Fig.7 Structure of class IIc bacteriocin synthetic gene cluster

    成熟細菌素的產(chǎn)生及分泌需要多個基因的共同作用,如Circularin A(Cir A)的產(chǎn)生至少需要cirABCDE5 個基因[60],Carnocyclin A(Ccl A)的產(chǎn)生至少需要cclBITCDA6 個基因[61],而且有些細菌素的免疫基因單獨存在時也可表達出具有生物學活性的免疫蛋白,然而比整個基因簇的免疫效果差,如將Carnocyclin A 的免疫基因cclI置于強啟動子下即可賦予宿主免疫Carnocyclin A 的能力,然而比cclBITCDA整個基因簇的免疫保護效果低[62]。

    4.2 多肽結(jié)構(gòu)特點

    Ⅱc 類細菌素是一類N 端和C 端氨基酸殘基共價連接形成的穩(wěn)定的帶有螺旋結(jié)構(gòu)的環(huán)狀多肽,兩端的共價連接使其對于pH 值的變化、各種酶等外界壓力有更強抵抗能力,相比于其它Ⅱ類細菌素有更高的生物學活性。除此之外,絕大多數(shù)此類細菌素都可形成4 或5 個α 螺旋,螺旋相互折疊形成的疏水中心正是細菌素與靶細胞膜結(jié)合的關(guān)鍵部位[63],細菌素的三維結(jié)構(gòu)如圖8所示。Ⅱc 類與Ⅱa 類、Ⅱb 類細菌素一樣,均含有前導(dǎo)序列(2~48 個氨基酸),Ⅱc 類細菌素的前導(dǎo)序列似乎并不作為其加工過程的識別信號,而仍然是生物合成的關(guān)鍵控制點,能夠與相關(guān)的生物合成酶相互作用,促進細菌素的分泌[64]。

    圖8 Ⅱc 類、Ⅱd 類細菌素的三維結(jié)構(gòu)Fig.8 The three-dimensional structure of Ⅱc and Ⅱd bacteriocins

    以Ⅱc 類細菌素的生化特性為主要依據(jù),可分為以下2 類[65],Group Ⅰ:高度陽離子化,有較高等電點(pI>9),而相似性較低,目前鑒定出的絕大多數(shù)細菌素屬于此類,包括Garvicin ML(Gar ML)、Enterocin AS-48(AS-48)、Circularin A(Cir A)、Uberolysin(Ubl A)、Carnocyclin A(Ccl A)、Leucocyclicin Q(Lcy Q)、Amylocyclicin(Acn)、Enterocin NKR-5-3B(Ent 53B)和Pumilarin(Pmln)(圖9);GroupⅡ:有較強疏水性,包含較多的酸性氨基酸殘基,等電點(pI<7)低于第1 組,各個細菌素之間具有高度的序列同源性,目前此亞組只有Gassericin A(Gass A)、Butyrivibriocin AR10(BAR10)、Reutericin 6(Reut 6)、Acidocin B 和Plantaricyclin A(圖9)。

    圖9 Ⅱc 類細菌素的2 個亞群的序列對比Fig.9 Sequence comparisons of two subgroups of class Ⅱc bacteriocin

    4.3 轉(zhuǎn)運機制

    雖然Ⅱc 類細菌素的具體轉(zhuǎn)運機制目前還不清楚,但與Ⅱa、Ⅱb 類細菌素的轉(zhuǎn)運機制相比有以下2 點不同:(1)Ⅱc 類細菌素的前導(dǎo)序列不是雙甘氨酸型前導(dǎo)序列,因此Ⅱc 類細菌素不會借助雙甘氨酸引導(dǎo)序列轉(zhuǎn)運系統(tǒng)分泌,可能通過自己獨特的方式,比如借助此類細菌素獨有的DUF95 蛋白[57],此蛋白可能與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白(無跨膜結(jié)構(gòu))形成蛋白復(fù)合物,從而形成跨膜結(jié)構(gòu)以協(xié)助細菌素的轉(zhuǎn)運;(2)Ⅱa 類細菌素的前體肽通過靜電相互作用和細胞膜結(jié)合,加工成熟后被轉(zhuǎn)運蛋白運出細胞,而Ⅱc 類前體肽則可能通過疏水相互作用與細胞膜結(jié)合進而被運出細胞,如Enterocin NKR-5-3B[64]。

    由于不同Ⅱc 類細菌素的前導(dǎo)序列變化較大[64],比如Garvicin ML、Leucocyclicin Q 的前導(dǎo)序列較短而Enterocin NKR-5-3B 的前導(dǎo)序列較長[64],研究前導(dǎo)序列在細菌素成熟中的作用較為困難,這樣也加大了研究Ⅱc 類細菌素轉(zhuǎn)運的難度。表達完成后細菌素前導(dǎo)序列被切割,之后細菌素的N 端和C 端通過共價連接成環(huán),最后被轉(zhuǎn)運蛋白運出細胞,這一系列的過程是否是前后緊密相連的,目前尚不清楚[64],然而已有研究表明某些細菌素的環(huán)化和分泌是2 個獨立的過程,如Garvicin ML[66]和Leucocyclicin Q[57]。

    4.4 殺菌和自身免疫機制

    Ⅱc 類細菌素具有較多正電荷,可在強靜電作用下與帶負電荷靶細胞膜結(jié)合,形成特異性或非特異性的穿孔,破壞細胞內(nèi)外離子平衡,進而殺傷目標細菌,如Carnocyclin A 可使靶細胞膜形成陰離子特性穿孔[67]。Ⅱc 類細菌素的殺菌活性對靶細胞膜受體的要求較低,也有一些細菌素需要借助靶細胞膜上的識別蛋白才發(fā)揮其殺菌能力,如Garvicin ML 的識別蛋白為麥芽糖ABC 轉(zhuǎn)運蛋白(Maltose ABC transporter)[68]、Carnocyclin A 的 識別系統(tǒng)為甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)和纖維二糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Cellobiose phosphotransferase systems)[67]。

    另外,Enterocin AS-48 的殺菌能力依賴于Enterocin AS-48 二聚體,而此聚合物的形成主要依賴于pH 值。當pH 值低于3 時,細菌素以單體形式存在,抑菌活性較低;當pH 值在4.5~8.5 時,細菌素以二聚體形式存在,具有較強的生物活性。Enterocin AS-48 二聚體與細胞膜結(jié)合,聚合物構(gòu)象便從閉合轉(zhuǎn)化為開放,從而形成膜通道,殺滅目標細菌[69]。

    IIc 類細菌素生產(chǎn)菌株可借助雙ABC 系統(tǒng)實現(xiàn)高效自我免疫,其不僅可借助自身的免疫蛋白實現(xiàn)自我保護,還可利用ABC 轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合物增強免疫蛋白的免疫能力,例如:Enterocin NKR-5-3B 的生產(chǎn)菌株的自我免疫主要靠EnkB4 免疫蛋白,此蛋白對Enterocin NKR-5-3B 的同源細菌素Circularin A 和Uberolysin 也有一定的免疫能力[56],另 外,Enterocin NKR-5-3B 的enkB1和enkB3基因還可編碼一種ABC 轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合物,其中EnkB1 為膜結(jié)合轉(zhuǎn)運體,EnkB3 為ATP 結(jié)合的主要分子,此復(fù)合物的保護機制可能有以下2種[59]:(1)使胞外細菌素的濃度維持在不能造成細胞通道的濃度;(2)復(fù)合物將更多的ATP 水解放能并通過主動運輸將成熟的細菌素運到胞外。這種雙ABC 系統(tǒng)免疫機制在多種Ⅱc 類細菌素中均被發(fā)現(xiàn),比如Circularin A 由CirE 免疫蛋白和CirBD 復(fù)合物共同免疫[62],Enterocin AS-48 由AS-48C1D 免疫蛋白和AS-48EFGH 復(fù)合體共同免疫[59],Carnocyclin A 由CclI 免疫蛋白和CclEFGH 復(fù)合體共同免疫[61]。

    4.5 調(diào)控機制

    在某些Ⅱc 類細菌素(Butyrivibriocin AR10、Uberolysin、Enterocin NKR-5-3B)編碼基因附近,發(fā)現(xiàn)了一些常見的用于調(diào)控細菌素表達的基因,如組氨酸激酶編碼基因,故而猜測Ⅱc 類細菌素可能也通過群體感應(yīng)調(diào)節(jié)細菌素的表達[70]。另外,Enterocin AS-48 二聚體的抑菌活性會受到pH 值的調(diào)控[69],然而由于目前仍不確定是否所有的Ⅱc類細菌素在發(fā)揮生物學活性時都會借助二聚體,因此pH 值是否可以調(diào)控所有此類細菌素的生物活性也有待研究。

    5 Ⅱd 類細菌素

    IId 類細菌素是一類由不相關(guān)的單肽細菌素組成的異質(zhì)性類群,主要為無前導(dǎo)肽細菌素,其不含前導(dǎo)序列,經(jīng)翻譯就會具有生物學活性[71]。

    5.1 編碼基因結(jié)構(gòu)

    Ⅱd 類細菌素的生物合成一般涉及4 種以上不同的基因,主要有結(jié)構(gòu)基因、免疫基因、編碼ABC 轉(zhuǎn)運蛋白基因、調(diào)控基因,這些基因可能存在不同的操縱子中,然而總是彼此相鄰(圖10)[71]。絕大多數(shù)Ⅱd 類細菌素的膜轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因旁邊都發(fā)現(xiàn)了一些具體功能未知的基因,這些基因可能與細菌素的轉(zhuǎn)運和調(diào)控有關(guān)。有些Ⅱd 類細菌素的免疫基因主要編碼ABC 轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合體,參與細菌素的轉(zhuǎn)運和免疫,如Lacticin Q 的lnqEF[72]、Lacticin Z 的lnzEF[72]、Bacteriocin BHT-B 的orf3和abc2[73],由于此類細菌素不具有前導(dǎo)肽,經(jīng)翻譯便具有生物學活性,為避免細菌素在胞內(nèi)對生產(chǎn)菌株不利,將其快速運出細胞極為關(guān)鍵,因此相比于其它3 種Ⅱ類細菌素,Ⅱd 類細菌素的轉(zhuǎn)運和自我免疫的相關(guān)基因極為重要。

    圖10 部分IId 類細菌素的合成基因簇結(jié)構(gòu)Fig.10 Synthetic gene cluster structure of class IId bacteriocin

    5.2 多肽結(jié)構(gòu)特點

    無前導(dǎo)類細菌素由1 條或者多條多肽形成,內(nèi)含有多螺旋的保守序列(三維結(jié)構(gòu)如圖8所示),根據(jù)細菌素所含多肽數(shù)目不同,可將其分為3 個亞群:單肽類(如Lacticin Q[72])、雙肽類(如Enterocin DD14[74])、多肽類(如Garvicin KS[75])。許多Ⅱd 類細菌素亞群內(nèi)部或者亞群之前具有高度的序列同源性,如單肽類的Weissellicins Y 和Weissellicins M 具有較高的相似性,單肽類Weissellicins M 與雙肽類Enterocins L50AB 也有較高的同源性[76]。

    無前導(dǎo)肽細菌素與Ⅱc 類細菌素的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性,主要體現(xiàn)在[11]:(1)兩者多數(shù)都是高度陽離子肽;(2)兩者都具有由4、5 個兩親的α螺旋組成的結(jié)構(gòu)確定且排列緊湊的疏水核心,而Lsb B 只有1 個α 螺旋;(3)兩者均沒有用于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的二硫鍵。另外,多數(shù)Ⅱd 類細菌素N 端有甲?;鞍彼?,然而其對于細菌素的生物學活性似乎沒有直接的作用[77]。例如:去除Lacticin Q 和Aureocin A53 蛋氨酸的甲?;?,兩種細菌素的生物學活性沒有發(fā)生明顯變化。

    多數(shù)無前導(dǎo)肽細菌素的N 端有一段保守序列AKYGxKAV(圖11),此序列可能與細菌素的轉(zhuǎn)運相關(guān)。而且此類細菌素會形成與Ⅱc 類細菌素相似的多個α 螺旋結(jié)構(gòu),然而無前導(dǎo)肽細菌素的α螺旋較Ⅱc 類的更短,螺旋之間較為緊湊,并且螺旋表面富含較多陽離子,而中心卻是一個疏水結(jié)構(gòu),如Lsb 有1 個α 螺旋、Lacticin Q 和Aureocin A53 均有4 個α 螺旋[77](圖8)。

    圖11 Ⅱd 類細菌素的序列對比Fig.11 Sequence comparison of class IId bacteriocin

    5.3 轉(zhuǎn)運機制

    由于無前導(dǎo)肽細菌素缺少能夠與生產(chǎn)細菌的細胞膜相互作用進而轉(zhuǎn)運細菌素的前導(dǎo)序列,細菌素一經(jīng)翻譯便具有生物學活性,因此如何快速準確地將成熟細菌素轉(zhuǎn)運至胞外至關(guān)重要。如圖10所示,已經(jīng)鑒定成功的一些無前導(dǎo)肽細菌素的合成基因簇都有膜轉(zhuǎn)運相關(guān)基因,而且一些免疫基因表達的蛋白也參與細菌素的轉(zhuǎn)運,如Lacticin Q 的lnqEF。另外,Lsb B 細菌素lmrB基因編碼的LmrB 蛋白雖為膜轉(zhuǎn)運蛋白,但也與生產(chǎn)細菌的自我免疫相關(guān),從本質(zhì)上講LmrB 蛋白與ABC 轉(zhuǎn)運蛋白復(fù)合體的形成有一定關(guān)系。

    無前導(dǎo)肽細菌素無前導(dǎo)序列,不會通過多數(shù)Ⅱ類細菌素的雙甘氨酸系統(tǒng)進行轉(zhuǎn)運。例如:Lsb A 和Lsb B 的轉(zhuǎn)運特異性的依賴于耐藥性轉(zhuǎn)運蛋白(Multidrug resistance transporter protein,MDR)中的LmrB 和LmrA 蛋白[78],其可將疏水或者兩親的蛋白復(fù)合物運出細胞,由于Lsb A 和Lsb B 兩種細菌素均為疏水型,因此可被MDR 蛋白家族成員順利運出細胞而且還能防止分泌到細胞外的細菌素的傷害。

    5.4 殺菌及自身免疫機制

    Ⅱd 類細菌素功能的發(fā)揮主要靠2 種機制:(1)通過干擾細胞膜的形成從而抑制靶細胞的生長,細菌素能夠激活雙組分系統(tǒng)CesSR,而CesSR可以引發(fā)易感細胞對細胞膜產(chǎn)生反應(yīng),同時也會和Lipid Ⅱ形成復(fù)合物以抑制肽聚糖的合成,從而抑制細胞壁的合成并使細胞死亡,如Lactococcin 972[79];(2)通過特異性膜蛋白結(jié)合以使其構(gòu)象發(fā)生變化形成穿孔從而造成細胞死亡,如lactococcin A、Lactococcin B、Garvicin Q 可與甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)結(jié)合[80],Lsb B、Enterocin K1可與鋅依賴膜蛋白酶(Membrane-bound Zn-dependent protease)結(jié)合[81-82]。

    無前導(dǎo)肽細菌素生產(chǎn)菌株的自我免疫主要有以下2 種:(1)細胞外的免疫,生產(chǎn)細胞通過免疫蛋白保護自己,免疫蛋白通過與細胞膜上的細菌素特異性受體結(jié)合,防止細菌素發(fā)揮作用,而且有些細菌素免疫基因的過表達不僅可以增強生產(chǎn)菌株對細菌素的免疫能力,也可在一定程度上恢復(fù)細菌素對生產(chǎn)菌株的傷害,如Lacticin Q[83]。細菌素也可表達ABC 免疫蛋白復(fù)合物以促進細菌素的分泌并增強免疫,此種免疫方式與Ⅱc 類細菌素極為相似。另外,免疫蛋白LmrA 和LmrB 還可通過去除從外部進入細胞質(zhì)膜的細菌素Lsb A 和Lsb B 來介導(dǎo)細菌素抗性。(2)細胞內(nèi)的免疫,生產(chǎn)細胞將細菌素快速運至胞外,以減少細菌素對自己的傷害,由于此類細菌素多數(shù)含有由ATP 結(jié)合蛋白和1 個或多個副蛋白組成的ABC 轉(zhuǎn)運體復(fù)合物[83],因此猜測生產(chǎn)細菌可通過此復(fù)合物獲得更多的能量以將細菌素通過主動運輸?shù)确绞礁咝У剡\出細胞。

    5.5 調(diào)控機制

    雖Ⅱd 類細菌素的普遍調(diào)控方式尚不明確,但目前發(fā)現(xiàn)一些與此類細菌素的表達和免疫相關(guān)的調(diào)控因子,如Lacticin Q 和Lacticin Z 的lnqR基因(編碼LnqR 蛋白)[72]。Lacticin Q 和Lacticin Z的同源性較高,Lacticin Q 的合成基因簇lnqBCDEF和Lacticin Z 的合成基因簇lnzBCDEF有較高的相似性,在兩者的細菌素編碼基因簇旁邊都發(fā)現(xiàn)了一個與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的基因,分別編碼的LnqR 蛋白、LnzR 蛋白(均為TetR 家族),其可實現(xiàn)對兩種細菌素表達的正調(diào)控,而且兩種蛋白的表達和調(diào)控都是溫度依賴型的,在較高的溫度下lnqR、lnzR基因的表達會受到抑制。

    6 II 類細菌素在食品中的應(yīng)用

    乳酸菌是許多食品的天然成分,可通過產(chǎn)生多種抗菌代謝產(chǎn)物來提高食品品質(zhì),如有機酸、乙醇氧化物、細菌素等,細菌素為乳酸菌核糖體合成的具有較強抑菌和殺菌活性的多肽或者蛋白質(zhì),相比于其它幾種代謝產(chǎn)物,乳酸菌細菌素有更高的研究價值。乳酸菌Ⅱ類細菌素作為乳酸菌細菌素中的很重要的一個分支,其主要通過2 種方式作用于食品(表3),分別為:(1)直接利用純細菌素制劑,抑制致病微生物的同時提高食品的風味;(2)制備含細菌素制劑,將細菌素與抗生素或其它種類的細菌素混合,制備抑菌范圍更廣、抑菌活力更高的抗菌物質(zhì),對一些耐藥微生物有較強的抑制作用。

    表3 Ⅱ類細菌素的應(yīng)用Table 3 Application of class II bacteriocin

    乳酸菌Ⅱ類細菌素可有效抑制致病菌和腐敗菌,如Ⅱa 類細菌素可有效抑制單增李斯特氏菌的增殖,而多數(shù)Ⅱ類細菌素僅對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用,由于革蘭氏陰性菌外膜的保護,使得細菌素對其的作用較弱。然而,有些細菌素如Ⅱc 類細菌素Carnocyclin A 以及本課題組發(fā)現(xiàn)Ⅱd類細菌素BM1157、BM1122 等對常見的革蘭氏陰性菌大腸桿菌有較強的抑制作用(表3),Ⅱ類細菌素中各個細菌素抑菌活性的研究為這些細菌素在食品行業(yè)的深入應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

    目前,抗生素的濫用促使自然界中的耐藥菌甚至超級細菌大量出現(xiàn),傳統(tǒng)的抗生素已經(jīng)不足以抑制這些細菌的繁殖,因此尋找新型抗菌劑漸漸成為當今的研究熱點。再加上當前消費者對食品品質(zhì)的要求越來越高,除了營養(yǎng)美味,大家更加期待安全、健康的食品添加劑。由于乳酸菌細菌素具有較高的穩(wěn)定性和較低的毒性,而且其主要通過靜電相互作用和蛋白特異性識別,來殺滅或抑制靶標菌,而降解膜蛋白或者破壞細胞膜結(jié)構(gòu)需要消耗大量能量,因此較難產(chǎn)生耐細菌素的細菌。故而,乳酸菌細菌素在食品安全領(lǐng)域受到越來越高的重視。目前,只有乳酸球菌產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素(Nisin)被我國及其它多個國家作為食品添加劑進行商品化應(yīng)用,Nisin 主要通過與細胞壁前體LipidⅡ結(jié)合,以形成細胞膜穿孔而殺死靶標菌,然而由于革蘭氏陰性菌存在細胞外膜,因此在一定程度上限制了Nisin 的應(yīng)用范圍。

    從上述乳酸菌Ⅱ類細菌素各個亞群的分類闡釋中可見,相比于Nisin,乳酸菌Ⅱ類細菌素具更高的熱穩(wěn)定性,更好的生物活性,更廣的抑菌譜(尤其對于革蘭氏陰性菌),然而由于自然條件下合成調(diào)控機理未知,限制了其大規(guī)模生產(chǎn)。目前,雖已有借助大腸桿菌IPTG 系統(tǒng)異源表達Ⅱ類細菌素的研究,但仍有許多不足,如由于大腸桿菌系統(tǒng)不含Ⅱ類細菌素轉(zhuǎn)運體系,表達的細菌素易在細菌內(nèi)形成包涵體,難以分泌至胞外,使得細菌素后期的分離純化較為困難。而乳酸菌NICE 系統(tǒng)(Nisin controlled gene expression)則包含將細菌素轉(zhuǎn)運至胞外的NIST 蛋白,且已有許多研究表明乳酸菌Ⅱ類細菌素和其它細菌素存在較強的協(xié)同作用,因此若能將兩種或多種協(xié)同作用較強的細菌素融合,構(gòu)建新型分子,并借助NICE 系統(tǒng)異源表達,便可開發(fā)高效、廣譜抗菌肽雜交分子,緩解當前生物防腐劑應(yīng)用范圍窄的問題。

    7 結(jié)語

    隨著越來越多的乳酸菌細菌素被發(fā)現(xiàn),Ⅱ類細菌素的分類方式也不斷被完善,此類細菌素4個亞群的分類特征、編碼細菌素基因結(jié)構(gòu)、多肽序列、殺菌及免疫相關(guān)的蛋白已經(jīng)較為明確,而細菌素的某些具體作用機制仍有些模糊,如免疫蛋白具體如何保護生產(chǎn)菌株,某些細菌素的調(diào)節(jié)機理等。深入研究Ⅱ類細菌素活性以及Ⅱ類細菌素與其它抗菌物質(zhì)的協(xié)同作用,對于此類細菌素的應(yīng)用具有重要意義,隨著學者的不斷探索終會使Ⅱ類細菌素如Ⅰ類細菌素的乳酸鏈球菌素般得到商業(yè)化生產(chǎn)。

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