生物素-親和素增敏抑制型SPR等離子共振傳感器檢測牛奶中鏈霉素

王敏思，柳 雙，朱文博，宋 洋

（天津師范大學(xué) 天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300387）

鏈霉素（Streptomycin，STR）是一種氨基酸糖苷類抗生素藥物[1]，對結(jié)核桿菌和許多革蘭陰性桿菌有較強(qiáng)的抗菌作用[2]，是目前我國畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)常用的藥物之一[3]。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，鏈霉素被大量、頻繁地超劑量用于奶牛乳腺炎的治療，由此導(dǎo)致牛奶中高濃度的鏈霉素藥物滯留和蓄積[4]，并以食物鏈方式進(jìn)入人體，危害人體健康[5]。鏈霉素有嚴(yán)重的腎毒性和耳毒性，長期攝入有鏈霉素殘留的食物會(huì)造成腎臟及前庭功能和耳蝸神經(jīng)永久性損傷[6]。食物中殘留的鏈霉素可能會(huì)造成過敏反應(yīng)，甚至引起休克[7]。此外，鏈霉素還具有潛在的致畸作用[8]。臨床上，鏈霉素逐漸被其它類似藥物所取代，然而，在畜牧業(yè)和水產(chǎn)業(yè)仍在繼續(xù)使用[9]，因此建立準(zhǔn)確可靠、簡便的檢測方法很有必要。

目前，鏈霉素在我國及日本等多個(gè)國家（地區(qū)）均允許使用，鑒于其對人體的危害性，世界各國對其殘留限量均有規(guī)定，其中歐盟國家及日本肯定列表中均規(guī)定牛奶中鏈霉素的最高殘留限量為200 μg/kg[10-11]，加拿大為125 μg/kg[12]。國內(nèi)外定量鏈霉素殘留的檢測方法包括傳統(tǒng)的高效液相色譜法（HPLC）[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS）[14-17]等儀器檢測方法，以及酶聯(lián)免疫法（ELISA）[18]、適配體傳感器（Aptamer sensor，AS）[19]、試紙條（Test strip，TS）[20]等方法。HPLC-MS 可定性、定量分析，然而昂貴的儀器和專業(yè)的操作程序不利于大量樣品以及現(xiàn)場檢測。ELISA 是成熟的快速檢測手段，廣泛用于食源性危害物的快速檢測。AS 建立所需時(shí)間較長，保存時(shí)間短。TS 檢測時(shí)間短，準(zhǔn)確度低。表1為近年來牛奶中鏈霉素殘留的主要檢測方法。

表1 本研究與以往鏈霉素檢測方法比對Table 1 Comparison of the study with previous streptomycin detection methods

表面等離子體共振傳感器（Surface plasmon resonance，SPR）是一種建立在免疫學(xué)基礎(chǔ)上，利用物理光學(xué)現(xiàn)象的檢測方法。由于SPR 對小分子物質(zhì)的相應(yīng)信號較低和非特異性吸附的影響，局限了其在食品安全領(lǐng)域的發(fā)展?；谏锼?親和素（Biotin-avidin system，BAS）的親和特性與SPR 結(jié)合[21]，可以提高抗原抗體的親和性，從而提高相應(yīng)信號和檢測的準(zhǔn)確性[22-23]。與傳統(tǒng)SPR 相比，更具優(yōu)勢。本研究將活化酯法合成的生物素化抗原結(jié)合在偶聯(lián)鏈霉親和素的SA 芯片，優(yōu)化了抗體濃度、再生液等條件，建立BAS-SPR 鏈霉素殘留高效檢測方法，對20 例牛奶樣品進(jìn)行測定，該方法較既往的快速檢測方法，靈敏、準(zhǔn)確且可再生多次[24-25]?；贐AS-SPR 的信號放大策略建立的快速檢測方法可為實(shí)際樣品中STR 的檢測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

硫酸鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、硫酸新霉素、雙氫鏈霉素、妥布霉素、（+）-生物素N-羥基琥珀酰亞胺（BNHS，≥98%），美國Sigma Aldrich 公司；10 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）緩沖液、不同pH 值的甘氨酸（Gly）-HCl（10 mmol/L）、50 mmol/L 氫氧化鈉（NaOH）溶液、500 mmol/L 氯化鈉（NaCl）溶液、碳酸鈉（Na2CO3）緩沖溶液、二甲基甲酰胺（DMF），Harmonia Testing Technology Ltd.公司（中國天津）；牛奶樣品，天津師范大學(xué)超市；抗鏈霉素抗體（STR-Ab）6 mg/mL，天津師范大學(xué)動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

BIAcore 3000 儀器，美國GE 公司；SA 芯片，美國Biosensing Instrument 公司；HPLC-MS，美國Thermofinnegan 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BNHS-STR-OVA 的制備 直接交聯(lián)法[26]合成的STR-OVA，用碳酸鈉緩沖溶液（pH 9.6）稀釋為1 mg/mL，與50 μL 在DMF 中的20 mg/mL 的BNHS 混合，將該反應(yīng)混合物室溫?cái)嚢? h，PBS 在4 ℃透析3 d，該抗原BNHS-STR-OVA 的質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL，于4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BNHS-STR-OVA 在SA 芯片表面的固定試驗(yàn)采用SA 芯片進(jìn)行固定化。生物素化抗原與芯片上的鏈霉親和素結(jié)合即將抗原穩(wěn)定的固定在芯片表面。10 mmol/L，pH 7.0 的PBS 作為整個(gè)反應(yīng)中的流動(dòng)相，流速為10 μL/min，對芯片表面進(jìn)行沖洗，固定抗原時(shí)，流速5 μL/min，注射時(shí)間30 s。

1.2.3 測定過程 依據(jù)免疫抑制原理，將構(gòu)建BAS-SPR 免疫傳感器應(yīng)用于目標(biāo)物STR 的定量分析。一系列質(zhì)量濃度的STR-Ab（6.0，7.5，10.0，15.0，30.0，60.0，80.0，100.0 mg/L）分別注入儀器中，流速30 μL/min，注射時(shí)間6 min，解離時(shí)間180 s，優(yōu)化最佳抗體質(zhì)量濃度。每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3 次。PBS 代替抗體，作為對照。

將90 μL 一系列質(zhì)量濃度的STR-PBS 溶液（0.1，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，64.0 μg/L）分別 與抗體等體積混合后注入儀器中，反應(yīng)時(shí)間300 s。每個(gè)質(zhì)量濃度注射3 次，根據(jù)響應(yīng)值的變化，以標(biāo)品質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制相應(yīng)的SPR 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

式中，B0——STR 質(zhì)量濃度為0 的響應(yīng)值；Bx——STR 質(zhì)量濃度為x的響應(yīng)值。

1.2.4 優(yōu)化再生液 對再生液進(jìn)行優(yōu)化，選擇pH 2.0 的甘氨酸-鹽酸（Gly-HCl）、pH 2.2 的Gly-HCl、500 mmol/L 的NaCl 溶液、2.5 mmol/L 的NaOH溶液4 種再生液進(jìn)行優(yōu)化，流速10 μL/min，觀察并比較反復(fù)測定過程中SPR 響應(yīng)值的變化，并對結(jié)果進(jìn)行比較，最后選擇最佳的再生液。

1.2.5 方法特異性評價(jià) 本試驗(yàn)選擇的STR 結(jié)構(gòu)類似物為雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、硫酸新霉素和妥布霉素。所有結(jié)構(gòu)類似物用PBS 稀釋至500，100，20，5，1，0.2 μg/L。用IC50計(jì)算交叉反應(yīng)性百分比（CR%）：

式中，IC50——測試化合物的濃度，其中相應(yīng)的吸光度等于最大吸光度的一半。

1.2.6 樣品前處理及添加回收試驗(yàn) SPR 法：取5 mL 牛奶樣品于10 mL 離心管中，8 000 r/min 離心10 min，取上清液用冰醋酸調(diào)節(jié)pH 值至4.6，振蕩混勻后5 000 r/min 離心5 min，取上清液。處理后的樣品液體儲存于棕色小瓶中-20 ℃?zhèn)溆?，用緩沖液稀釋后過0.22 μm 水系濾膜，即可進(jìn)行檢測。

HPLC-MS 法：參考標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 22969-2008[27]，經(jīng)羧酸型固相萃取柱后用甲酸和庚烷磺酸鈉溶液定容至2.0 mL，混勻后過0.20 μm 濾膜供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定。于牛奶樣品中添加STR 標(biāo)準(zhǔn)品，最終質(zhì)量濃度為20，40，80 μg/L，分別通過SPR 和HPLC-MS 測定回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPR 芯片表面的修飾及抗原固定

SPR 試驗(yàn)常使用葡聚糖修飾的CM5 芯片，或是便于自組裝的裸金芯片。這兩種芯片均需要對綁定探針進(jìn)行預(yù)富集和活化，過程較為繁瑣。本試驗(yàn)采用芯片修飾有鏈霉親和素的SA 芯片，利用其與生物素（BNHS）的高親和性，在SPR 芯片表面形成生物素-親和素-抗原的探針。圖1是BASSPR 傳感器敏感探針制備示意圖。

圖1 抑制型BAS-SPR 傳感器探針制備原理Fig.1 Preparation principle of inhibitory BAS-SPR sensor probe

圖2為BNHS-STR-OVA 在SA 芯片表面結(jié)合情況。上樣量2 μg。第1 次上樣，響應(yīng)值顯著上升，第2 次上樣，響應(yīng)值上升幅度較小，第3 次上樣，響應(yīng)值無明顯變化，說明芯片表面SA 的結(jié)合位點(diǎn)基本達(dá)到飽和狀態(tài)，停止上樣。BNHS-STROVA 共注射6 μg，因此選擇6 μg 為BNHS-STROVA 的最佳固定量，BNHS-STR-OVA 與芯片表面SA 的結(jié)合響應(yīng)值為1 435.4 RU。

圖2 芯片表面BNHS-STR-OVA 的結(jié)合Fig.2 Binding of BNHS-STR-OVA on the chip surface

2.2 STR-Ab 質(zhì)量濃度優(yōu)化

抗體濃度在很大程度上影響了免疫測定的穩(wěn)定性和靈敏度，是免疫分析方法中需要優(yōu)化的一個(gè)重要參數(shù)。將STR-Ab（6.0，7.5，10.0，15.0，30.0，60.0，80.0，100.0 mg/L）分別與結(jié)合在芯片表面的BNHS-STR-OVA 進(jìn)行結(jié)合，結(jié)果如圖3所示，隨著抗體質(zhì)量濃度的增加，響應(yīng)值不斷升高；60 mg/L 和80 mg/L 抗體質(zhì)量濃度的響應(yīng)值分別為148.3 RU 和152.6 RU，幾乎接近，說明抗原與抗體的結(jié)合基本達(dá)到飽和狀態(tài)；這2 個(gè)質(zhì)量濃度3 次進(jìn)樣響應(yīng)值的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV%）分別為5.06，6.53。這可能是由于高質(zhì)量濃度的抗體會(huì)降低再生效果，造成檢測的穩(wěn)定性降低。因此，為節(jié)約抗體，提高穩(wěn)定性，確定抗體添加質(zhì)量濃度為60 mg/mL。

圖3 不同質(zhì)量濃度的抗體與BNHS-STR-OVA 結(jié)合Fig.3 Binding of different concentrations of antibodies to BNHS-STR-OVA

2.3 再生條件的確定

再生液需要洗去結(jié)合的抗體，并保留結(jié)合在芯片上的抗原穩(wěn)定，適當(dāng)?shù)脑偕芤簺Q定了試驗(yàn)的穩(wěn)定性及芯片的使用壽命。鏈霉素堿性條件下不穩(wěn)定，為保護(hù)芯片上的抗原，試驗(yàn)選擇較為溫和的再生液進(jìn)行優(yōu)化，分別為50 mmol/L NaCl，pH 2.0 Gly-HCl，pH 2.2 Gly-HCl 及2.5 mmol/L NaOH溶液，根據(jù)4 次結(jié)合反應(yīng)和基準(zhǔn)響應(yīng)值變化進(jìn)行再生效果比較。由圖4顯示的結(jié)果表明：50 mmol/L NaCl 溶液不能完全洗去抗體，因此再生時(shí)出現(xiàn)基準(zhǔn)響應(yīng)值上升，結(jié)合相應(yīng)值下降；2.5 mmol/L NaOH 溶液再生結(jié)果表明，即使低濃度的堿性溶液，也會(huì)影響鏈霉素穩(wěn)定，從而造成抗原損失；對比pH 2.0 Gly-HCl 和pH 2.2 Gly-HCl 溶液的再生效果，pH 2.2 Gly-HCl 溶液的再生信號穩(wěn)定性更佳。通過試驗(yàn)可知，采用pH 2.2 Gly-HCl 溶液可使BAS-SPR 敏感膜芯片重復(fù)再生90次，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和再生性。

圖4 再生液優(yōu)化結(jié)果Fig.4 The results of regenerant optimization

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的確定

基于分析物與偶聯(lián)抗原間的競爭性反應(yīng)原理，將抗體STR-Ab（60 mg/L）與等體積濃度梯度的STR 混合后注入芯片，BNHS-STR-OVA 分別與質(zhì)量濃度為0.1，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0，64.0 μg/L 的STR 競爭抗體，根據(jù)抗原抗體結(jié)合響應(yīng)值與STR 濃度相關(guān)聯(lián)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5是不同質(zhì)量濃度STR 與抗原競爭抗體的SPR 結(jié)合曲線，由此繪制出STR 的BAS-SPR 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，如圖6所示，STR 線性檢測范圍是0.4～32.0 μg/L，IC50為1.65 μg/L，IC15為0.37 μg/L，檢測時(shí)間為10 min。

圖5 STR 與BNHS-OVA-STR 競爭試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Results of competition between STR and BNHS-OVA-STR

圖6 鏈霉素BAS-SPR 傳感器檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.6 Standard curve for BAS-SPR sensor detection of STR

2.5 特異性評價(jià)

試驗(yàn)選用了6 種STR 結(jié)構(gòu)及功能類似物分別進(jìn)行BAS-SPR 測試，測定交叉反應(yīng)率（CR%）。由表2結(jié)果可以看出，該抗體可以特異性的識別鏈霉素，且與雙氫鏈霉素有極高的交叉反應(yīng)（98.79%），然而與其它氨基糖苷類和結(jié)構(gòu)類似的抗生素藥物的交叉反應(yīng)率小于0.01%。由于雙氫鏈霉素是鏈霉素的衍生物，與鏈霉素僅相差一個(gè)基團(tuán)，與鏈霉素有相似的生理功能，在國標(biāo)中也將兩者統(tǒng)一計(jì)量[28]，因此在檢測時(shí)可作為同一種物質(zhì)檢測。

表2 各化合物與抗體的交叉反應(yīng)率和IC50 值Table 2 Cross reaction rate and IC50 value of each compound and antibody

2.6 樣品檢測

2.6.1 樣品基質(zhì)影響及消除 牛奶的基質(zhì)影響主要包括蛋白質(zhì)和脂肪。對于包含蛋白質(zhì)和脂肪的牛奶樣品，可以通過簡單地離心，稀釋和超濾將基質(zhì)干擾降至最低。取牛奶樣品進(jìn)行處理，將獲得的樣品提取液經(jīng)PBS 稀釋0，2，4，8，16 倍后的溶液作為STR 標(biāo)品的稀釋液，經(jīng)BAS-SPR 檢測獲得的抑制率曲線即為樣品的基質(zhì)曲線，結(jié)果如圖7所示，樣品稀釋8 倍獲得的基質(zhì)曲線與校正曲線幾乎重合。由此可知，稀釋8 倍基本可以消除基質(zhì)影響。

圖7 牛奶樣品中基質(zhì)消除的優(yōu)化曲線Fig.7 Optimization curve of matrix elimination in milk samples

2.6.2 添加回收試驗(yàn) 在牛奶中添加5.0，20.0，30.0 μg/L 的STR 標(biāo)準(zhǔn)品，通過SPR 和HPLC-MS檢測添加回收率。如表3所示，SPR 回收率為96.6%～101.0%，HPLC-MS 回收率為95.6%～99.4%，SPR 相對于HPLC-MS 添加回收率較高。說明SPR 方法準(zhǔn)確可靠，對牛奶樣品中STR 的檢測提供了一種高效、靈敏的檢測方法。

表3 SPR、HPLC-MS 法檢測STR 的3 個(gè)質(zhì)量濃度水平下樣品的回收率（n = 3）Table 3 SPR and HPLC-MS method for the recovery of samples at three levels of STR（n=3）

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了BAS-SPR 增敏抑制型免疫傳感器并應(yīng)用于牛奶中STR 的快速檢測。將BNHS-STR-OVA 固定于SA 芯片表面形成BAS-Ag 敏感膜，簡化了固定化的活化過程，有效提高了響應(yīng)值和芯片的穩(wěn)定性。敏感膜上的抗原作為探針，依據(jù)免疫抑制原理，對目標(biāo)物STR 進(jìn)行定量分析。經(jīng)過對固定化條件、抗體濃度、再生液等條件的優(yōu)化，最終確定：抗體濃度為60 mg/L；固定化緩沖液為pH 7.0 PBS 緩沖液；芯片再生液為pH 2.2 Gly-HCl。得到競爭抑制型BAS-SPR 對STR 的方法檢出限（IC15）為0.37 μg/L；靈敏度（IC50）為1.65 μg/L；整個(gè)檢測過程用時(shí)10 min；芯片可重復(fù)使用90 次以上。3 個(gè)添加量（5，20，30 μg/L）回收率為96.6%～101.0%。該方法具有快速、樣品處理方法相對簡單，所用時(shí)間短、靈敏、檢測限低等優(yōu)點(diǎn)，在大量樣品的痕量檢測中具有優(yōu)勢。