基于16S rDNA序列、MALDI-TOF-MS和VITEK的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的鑒定

孟令緣，牛沁雅，廉魯昕，黃巾凌，崔生輝，閆韶飛，李鳳琴，楊保偉*

（1 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌 712100 2 中國食品藥品檢定研究院 北京 102629 3 國家食品安全風(fēng)險評估中心 北京 100022）

沙門氏菌（Salmonella）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是常見的食源性致病菌，也是導(dǎo)致公共衛(wèi)生安全和健康問題的主要微生物種類。準(zhǔn)確、高效的微生物鑒定技術(shù)是有效控制致病菌傳播和預(yù)防相關(guān)疾病的前提。隨著科學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，可供檢測人員選擇的微生物鑒定方法和技術(shù)越來越多。然而，不同方法間的差異常使得鑒定結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性受到質(zhì)疑[1-2]。

目前，微生物的形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、生理生化和蛋白質(zhì)譜等特性通常作為檢測、分類和鑒定的依據(jù)。形態(tài)學(xué)鑒定簡單、快速，然而結(jié)果受檢測人員主觀因素影響較大，對檢測人員操作水平要求較高，且不能作為最終評判依據(jù)[3-4]。分子生物學(xué)鑒定方法具有準(zhǔn)確性高、結(jié)果穩(wěn)定、數(shù)據(jù)庫全面的特點，一直被廣泛應(yīng)用于臨床、環(huán)境及食品微生物鑒定領(lǐng)域。其中，16S rDNA 序列長度適中，有保守區(qū)和可變區(qū)，是微生物鑒定和分子分型的最優(yōu)標(biāo)志物之一[5-6]。VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和API等全自動微生物生化鑒定系統(tǒng)均以微生物的特征性生化反應(yīng)作為鑒定依據(jù)，結(jié)果可靠，已被國內(nèi)外多數(shù)政府部門和有資質(zhì)的檢驗機(jī)構(gòu)選擇[7-9]。然而，全自動生化鑒定設(shè)備和配套耗材的經(jīng)濟(jì)成本較高，一般實驗室難以負(fù)擔(dān)?；|(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（Matrix-assisted-laser-desorptionionizer time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）主要依據(jù)菌體蛋白質(zhì)譜，與現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對得到鑒定結(jié)果，是20世紀(jì)80年代末問世的一項新技術(shù)，操作簡單、鑒定迅速，為快速、準(zhǔn)確的微生物鑒定帶來新方向，被廣泛應(yīng)用于臨床微生物鑒定。然而，其鑒定結(jié)果判斷完全依賴于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫，而我國缺少自有數(shù)據(jù)庫的問題一直沒有得到解決，導(dǎo)致鑒定結(jié)果不夠準(zhǔn)確[10-11]。截至目前，哪種方法為微生物鑒定的較佳選擇尚未定論。

微生物鑒定的時效性、鑒定時間和水平被認(rèn)為是鑒定方法選擇的決定性因素。本研究選用16S rDNA 序列測定、MALDI-TOF-MS 和VITEK全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)3 種方法鑒定沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，以期確定一種時效性高的鑒定方法，為微生物參考物質(zhì)研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

食源性沙門氏菌92 株，為西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物食品安全研究室前期分離得到，菌株已通過PCR 和血清學(xué)鑒定。臨床患者源沙門氏菌118 株，由上海市疾病預(yù)防與控制中心惠贈。食源性金黃色葡萄球菌18 株，由中國食品藥品檢定研究院惠贈。鑒定中使用大腸桿菌ATCC 25922 和金黃色葡萄球菌ATCC 29213作為質(zhì)控對照。

1.2 試劑與儀器

Luria-Bertani（LB）瓊脂培養(yǎng)基、Brain Heart Infusion（BHI）瓊脂培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；VITEK COMPACT 2 GP 細(xì)菌鑒定卡、GN細(xì)菌鑒定卡，法國梅里埃公司；MALDI-TOF-MS鑒定用HCCA 基質(zhì)，德國Bruker 公司；無水乙醇、乙腈、甲酸等，廣東光華科技有限公司。

NU-425-400E 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；yCycler PCR 擴(kuò)增儀、170-3672 瓊脂糖凝膠電泳儀，Bio-Rad 公司；VITEK 2 COMPACT 60全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)、手持式比濁儀，法國梅里埃公司；MALDI-TOF-MS，德國Bruker Auto-flexcontrol 公司；GNP-9080 生化培養(yǎng)箱，北京科偉實驗儀器有限公司；LAC-5080S 冰箱，日本三洋公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 16S rDNA 擴(kuò)增和測序 用無菌牙簽挑取適量LB 瓊脂培養(yǎng)基活化18～24 h 后的菌株培養(yǎng)物，均勻分散于裝有100 μL 無菌ddH2O 的PCR管，振蕩。PCR 儀中100 ℃加熱10 min 后，13 200 r/min 離心10 min，取上清液，即為DNA 模板，備用。

PCR 擴(kuò)增用引物為F：5'-AGAGTTTGATCC TGGCTCAGPCR-3' 和 R：5'-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3'。擴(kuò)增程序為：94 ℃10 min；94 ℃1 min，55 ℃1 min，72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，低溫條件送楊凌天潤奧科生物科技有限公司測序。在NCBI 數(shù)據(jù)庫比對并下載標(biāo)準(zhǔn)菌株同源序列，使用MEGA 7 軟件鄰接法（Neighbor-Joining）自舉1 000 次構(gòu)建進(jìn)化樹[12-13]，使用iTOL 軟件對進(jìn)化樹處理。

1.3.2 MALDI-TOF-MS 鑒定方法 樣品預(yù)處理采用甲酸提取法，具體為：無菌接種環(huán)挑取已在BHI 瓊脂平板上培養(yǎng)12 h 的單菌落，轉(zhuǎn)移到裝有300 μL 無菌超純水的Eppendorf 管中，混勻。向Eppendorf 管中加入900 μL 無水乙醇，渦旋振蕩1 min。13 200 r/min 離心2 min，去除上清液。相同條件再次離心。向裝有菌泥的Eppendorf 管中加入50 μL 甲酸水溶液（V甲酸∶V水=7∶3），渦旋振蕩，充分混勻。再向管內(nèi)加入50 μL 乙腈，移液槍反復(fù)吹打混均，13 200 r/min 離心2 min。取1 μL 上清液滴加到清潔的靶板上，確認(rèn)每個樣本的靶位與所用樣本跟蹤方案一一對應(yīng)。靶板在室溫下晾干后，再將1 μL IVD HCCA 基質(zhì)溶液均勻涂敷于每個樣本表面，室溫晾干。將靶板插入預(yù)熱的MALDI-TOF-MS 儀運行程序。

1.3.3 VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定方法 用無菌牙簽挑取適量已在BHI 瓊脂培養(yǎng)基上活化12 h 的單菌落，均勻分散在裝有3 mL VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)配套測試液的比濁管中，調(diào)整比濁管麥?zhǔn)蠞岫葹?.48～0.52。將VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)生化鑒定試劑板的虹吸管插入菌懸液后，整體移至VITEK 2 COMPACT 60 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)進(jìn)行鑒定。沙門氏菌使用GN 卡，金黃色葡萄球菌使用GP 卡鑒定。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 使用R 語言軟件包（v3.6.1）中的ggplot2 包對鑒定結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA 序列測定

210 株（100.0%）沙門氏菌均可與NCBI 基因庫中登錄號為NR 074799.1 和NR 074910.1 的沙門氏菌聚為一簇，鑒定為沙門氏菌（圖1）。

圖1 210 株沙門氏菌16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of 210 Salmonella strains

NCBI 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果顯示，除1 株菌16S rDNA 序列與參比菌序列覆蓋度小于95%外，其余序列的覆蓋度（Cover number）均在98.0%～99.0%，鑒定結(jié)果可信。序列的相似性（Identity）均集中在99.0%～100.0%，且呈正態(tài)分布（圖4a）。16S rDNA 序列分析結(jié)果表明鑒定菌株均為沙門氏菌，可將其鑒定到屬水平。

18 株金黃色葡萄球菌中，15 株（83.3%）菌的16S rDNA 序列均可與基因庫登錄號為NR 113956.1 和NR 115606.1 的金黃色葡萄球菌聚在一簇，編號為SA002、SA004 和SA016 的菌株16S rDNA 序列與其它菌株親緣性較遠(yuǎn)（圖2），該3 株菌僅能被鑒定到葡萄球菌屬水平，未能鑒定到種水平。18 株金黃色葡萄球菌16S rDNA 序列與參比菌株相應(yīng)序列覆蓋度集中在99.0%，相似性集中在99.0%，鑒定結(jié)果可信（圖4a）。

圖2 18 株金黃色葡萄球菌16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 16S rDNA sequence of 18 Staphylococcus aureus strains

2.2 MALDI-TOF-MS 鑒定

基于德國Bruker 公司MALDI-TOF-MS 數(shù)據(jù)庫提供的評分標(biāo)準(zhǔn)，210 株（100.0%）沙門氏菌鑒定結(jié)果評分均大于2.0，為高度匹配，可被鑒定為沙門氏菌屬，均未鑒定到種。其中，142 株（67.6%）沙門氏菌鑒定結(jié)果評分大于2.3，為極高度匹配（表1、圖3）。取中間值2.376 作為標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，沙門氏菌的匹配度集中在100.0%～105.0%（圖4a）。

圖3 1 株沙門氏菌MALDI-TOF-MS 鑒定色譜圖Fig.3 MALDI-TOF-MS identification chromatogram of a Salmonella strain

18 株（100%）金黃色葡萄球菌MALDI-TOFMS 鑒定結(jié)果評分均大于2.0，為高度匹配，鑒定為金黃色葡萄球菌。其中，17 株（94.4%）菌鑒定評分均大于2.3，為極高度匹配（表1）。取中間值2.44作為標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，匹配度集中在99.0%～100.0%（圖4c）。

表1 210 株沙門氏菌和18 株金黃色葡萄球菌MADIL-TOF-MS 鑒定結(jié)果Table 1 Identification results of 210 Salmonella and 18 Staphylococcus aureus strains by MALDI-TOF-MS

2.3 VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定

210 株（100.0%）沙門氏菌均可被鑒定到沙門氏菌屬水平，未鑒定到種。沙門氏菌VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果匹配度集中在97.0%～99.0%，其中，165 株（78.6%）菌鑒定結(jié)果匹配度大于等于98.0%，僅有2 個結(jié)果的匹配度小于95.0%（表2、圖4a）。18 株（100.0%）金黃色葡萄球菌均被鑒定為金黃色葡萄球菌，其中16 株（88.9%）菌鑒定結(jié)果的匹配度大于等于98.0%，僅有1 個結(jié)果的匹配度小于95.0%。

表2 210 株沙門氏菌和18 株金黃色葡萄球菌VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of 210 Salmonella and 18 Staphylococcus strains using VITEK

2.4 數(shù)據(jù)分析

通過3 種方法對沙門氏菌檢測結(jié)果間的相關(guān)性分析表明，各檢測結(jié)果各自獨立，沒有影響，結(jié)果可信（圖4b）。對金黃色葡萄菌檢測結(jié)果相關(guān)性分析可知，質(zhì)譜和16S rDNA 序列鑒定結(jié)果一致性間有0.46 的負(fù)相關(guān)，其余各檢測結(jié)果獨立，互相沒有影響，結(jié)果可信（圖4d）。

圖4 3 種鑒定方法對210 株沙門氏菌及18 株金黃色葡萄球菌鑒定結(jié)果的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of 3 identification methods for 210 Salmonella strains and 18 Staphylococcus aureus strains

3 討論與結(jié)論

影響微生物檢測和鑒定的主要因素有培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基、菌株是否為純培養(yǎng)物、生化反應(yīng)是否明顯、不同廠商提供的數(shù)據(jù)庫差異、儀器差異和人員操作等[1]。就檢測時間而言，基于細(xì)菌的保守基因序列，即16S rDNA 片段，擴(kuò)增測序需要時間最長，約8～10 h，一次可檢測約96 個樣品；VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定不同種類細(xì)菌一般約需5～8 h，一次可檢測約40 個樣品；MALDI-TOF-MS約需2～4 h，針對本試驗所用儀器靶板，一次最多可檢測384 個樣品。若基于檢測時間和通量評判，MALDI-TOF-MS 效率最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因序列測定和VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定，因此MALDI-TOF-MS 也被認(rèn)為是高通量鑒定最優(yōu)最快速的方法。就鑒定結(jié)果的精確性而言，3 種方法均可以將沙門氏菌鑒定到屬，準(zhǔn)確性為100.0%，然而不能將其全部鑒定到種或具體的血清型。3種方法均可將金黃色葡萄球菌鑒定到屬，準(zhǔn)確性為100%，VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)和MALDITOF-MS 還可以進(jìn)一步將其準(zhǔn)確鑒定到種。何江等[14]比較了MALDI-TOF-MS 和16S rDNA 序列對19 株弧菌科細(xì)菌的鑒定結(jié)果，表明2 種方法的鑒定結(jié)果一致，MALDI-TOF-MS 可作為一種新的鑒定、檢測技術(shù)，可縮短檢測周期，然而有個別擬態(tài)弧菌和霍亂弧菌在16S rDNA 序列聚類樹狀圖中的位置和親緣關(guān)系差異較大。這與本研究通過16S rDNA 序列對金葡菌的鑒定結(jié)果比較相似，導(dǎo)致差異出現(xiàn)的原因可能與菌株16S rDNA 序列在系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建時所選擇的參照菌株外群和聚類方法有很大關(guān)系，也可能與這些菌株來源比較廣泛，其親緣關(guān)系本身就比較遠(yuǎn)有關(guān)。Kang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在對沙門氏菌血清型鑒定時，MALDI-TOFMS 比使用16S rDNA 序列分析更具有優(yōu)勢，然而種鑒定時沒有明顯差異；他們使用自建庫作為蛋白質(zhì)譜比對條件，而本研究以Bruker 公司提供的商業(yè)數(shù)據(jù)庫作為對比，因此沒有將沙門氏菌鑒定到血清型。劉娜等[16]也通過本研究使用的3 種方法鑒定了3 種常見的食源性致病菌，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的質(zhì)譜鑒定結(jié)果和基因測序結(jié)果與本研究基本相同，然而在生化鑒定時可以將少數(shù)特殊血清型的沙門氏菌鑒定到種。

采用分子生物學(xué)方法對菌株檢測時，常使用PCR 擴(kuò)增其特定的序列，然后對其測序分析。對于分離得到的某一種微生物，或者已經(jīng)通過生化試驗或其它方法初步確定種屬的菌，可擴(kuò)增其特異性基因片段，如沙門氏菌的保守基因invA[17-18]。然而，對于分離得到的多種微生物，或者菌種間親緣關(guān)系較近，則可選擇擴(kuò)增其具有普遍存在性和序列保守性特點的16S rDNA 序列。近年來，隨著高通量測序和大數(shù)據(jù)分析等技術(shù)的快速發(fā)展與應(yīng)用，基于16S rDNA 的微生物鑒定技術(shù)已逐漸成為主流。由于16S rDNA 并不能將微生物鑒定到種及亞種以下水平，因此許多研究結(jié)合ITS 序列分析，彌補了16S rDNA 保守性強(qiáng)、變異程度弱的缺點[19]。有研究認(rèn)為，16S rDNA 序列間相似性如果達(dá)到95%～97%以上即為同一屬，相似性達(dá)到99%以上即為同一種[20-21]，然而一些相似的種之間仍不能明確鑒定，如腸桿菌屬（Enterobacter）和泛菌屬（Pantoea）的16S rDNA 序列也存在99%相似性[22]。因此，也有學(xué)者基于16S rDNA 序列，建立了更快速、更靈敏的細(xì)菌鑒定方法[23-24]。當(dāng)然，對沙門氏菌來說，還可以采用血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定，然而仍有部分沙門氏菌存在莢膜或缺乏鞭毛導(dǎo)致無法進(jìn)行血清分型，因此也使用多位點序列分型（Multi locus sequence typing，MLST）和脈沖場凝膠電泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）等分子分型技術(shù)輔助檢測[25]。

MALDI-TOF-MS 通過檢測微生物蛋白指紋圖譜并將之與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)菌株蛋白圖譜對比進(jìn)行鑒定。極高的準(zhǔn)確性和較快的檢測速度使得該方法被廣泛應(yīng)用于臨床、環(huán)境和食品等研究領(lǐng)域的微生物檢測[26]。然而，高額的設(shè)備和維護(hù)費使得一些普通實驗室無法承擔(dān)[11，27]。其次，基質(zhì)的選擇、培養(yǎng)條件、菌株處理方式、菌體量、數(shù)據(jù)庫等因素也會影響試驗結(jié)果[28-30]。本研究中5 株腸炎沙門氏菌的鑒定結(jié)果在第2 匹配項中評分低于2.0，為中度匹配；1 株愛丁堡沙門氏菌和1 株湯普遜沙門氏菌的鑒定結(jié)果在第2 匹配項中評分低于2.0且鑒定為克氏檸檬酸桿菌，這可能由于檸檬酸桿菌屬和沙門氏菌屬同屬于腸桿菌科，其蛋白特性有相似之處，在Bruker 公司提供的數(shù)據(jù)庫中沙門氏菌屬數(shù)據(jù)不全，存在混淆的可能。本研究結(jié)果也證明了現(xiàn)有的商業(yè)菌種庫譜圖并不能將沙門氏菌屬的微生物鑒定到亞種以下，無法確定其血清型，而一些學(xué)者通過自己建庫則可以區(qū)分傷寒和非傷寒型沙門氏菌[31]。一些研究認(rèn)為，鑒定評分≥2.0即鑒定到種，評分＜2.0 且≥1.7 即鑒定到屬水平，評分＜1.7 即未鑒定出結(jié)果[11]，按照這樣的標(biāo)準(zhǔn)，本研究所有菌株均可通過MALDI-TOF-MS 鑒定到種水平。Seng 等[32]用此方法鑒定了1 660 株微生物，準(zhǔn)確率高達(dá)95.4%，其中84.1%鑒定到種水平，11.3%鑒定到屬水平，并且同步使用16S rDNA 基因檢測，對比了2 種試驗方法的效率，認(rèn)為MALDI-TOF-MS 的綜合成本約為傳統(tǒng)基因檢測的22%～23%。Liang 等[30]認(rèn)為，與VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定方法相比，MALDI-TOF-MS 鑒定的經(jīng)濟(jì)成本約為其1/3，時間成本約為其1/7。質(zhì)譜法檢測使用的靶板一次性可以檢測384 個樣品，平均每個樣品僅需30 s 左右，本研究采用的樣品前處理方法每個樣品約需3～5 min。當(dāng)然，也可以采用直接點樣的方法，更加節(jié)約時間，但對技術(shù)人員的操作要求較高。

VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對微生物生長時間、是否為純培養(yǎng)及菌種量都有較高的要求，該鑒定系統(tǒng)準(zhǔn)確性較高，平均識別率為93.8%，因此，被眾多機(jī)構(gòu)推薦、批準(zhǔn)作為參考標(biāo)準(zhǔn)[8，33]。本研究中所有菌株的鑒定結(jié)果準(zhǔn)確無誤，然而也有報道顯示臨床中VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)對不常見血清型的沙門氏菌判斷錯誤[34]。對沙門氏菌的鑒定結(jié)果不能準(zhǔn)確到血清型，然而其鑒定結(jié)果中的某些特性可以為血清型鑒定方向提供依據(jù)[7]。

綜上所述，本研究采用的16S rDNA 序列測定、MALDI-TOF-MS 和VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)均可將210 株（100.0%）沙門氏菌鑒定為沙門氏菌屬，MALDI-TOF-MS 和VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)可以將18 株（100.0%）金黃色葡萄球菌鑒定為金黃色葡萄球菌，16S rDNA 序列測定對18 株（100.0%）金黃色葡萄球菌準(zhǔn)確鑒定到屬水平，15株（83.3%）金黃色葡萄球菌準(zhǔn)確鑒定到種水平。就鑒定結(jié)果對細(xì)菌種屬的評判準(zhǔn)確性而言，MALDITOF-MS 和VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)略高于16S rDNA 序列測定方法。相對而言，MALDITOF-MS 鑒定的時效性均遠(yuǎn)高于其它2 種方法，約占VITEK 全自動細(xì)菌鑒定系統(tǒng)鑒定時間的5%，16S rDNA 序列鑒定時間的10%。綜合考慮，選擇MALDI-TOF-MS 進(jìn)行菌種鑒定最優(yōu)，在實踐中，具體如何選擇試驗方法需結(jié)合實驗室設(shè)備配備和實驗人員技術(shù)水平等綜合考慮。