產(chǎn)超氧化物歧化酶乳酸菌的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

張秋月，黎謝飛，曾小群，吳 振，蔡振東，郭宇星，潘道東，*

（1 寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院 浙江省動(dòng)物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 浙江寧波 315211 2 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院 南京 210097）

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一類革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性，不產(chǎn)芽孢、厭氧或兼性好氧的球菌或桿菌，可發(fā)酵各種碳水化合物產(chǎn)生乳酸[1]。乳酸菌作為一種被認(rèn)可的益生菌，可抑制發(fā)酵和非發(fā)酵產(chǎn)品中真菌的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)品的安全性[2]；可增強(qiáng)機(jī)體免疫力，緩解氧化應(yīng)激引起的相關(guān)疾病[3-4]；改善發(fā)酵食品風(fēng)味，提高食品質(zhì)量和感官特性[5-6]。目前，從自然界和各種傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中篩選具有多種功能的乳酸菌備受關(guān)注，也成為研究熱點(diǎn)之一。李丹陽(yáng)等[7]從新疆風(fēng)干肉中篩選的乳酸乳球菌A-18 和戊糖片球菌C-11 產(chǎn)蛋白酶較高，且具有較好的耐酸、耐膽鹽特性，可應(yīng)用于發(fā)酵肉制品中品質(zhì)控制的研究；劉孝芳等[8]從生鮮牛奶中篩選的植物乳桿菌具有高膽鹽水解酶活性，可水解胃腸道中的甘氨膽酸鹽產(chǎn)生游離態(tài)膽酸，與膽固醇共沉淀排出體外，為降膽固醇產(chǎn)品的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

活性氧（Reactive oxygen species，ROS）是一類含有不成對(duì)電子的原子或原子團(tuán)，主要包括氧自由基、過(guò)氧化氫（H2O2）、單線態(tài)氧和臭氧[9]。生物體內(nèi)的ROS 可與脂質(zhì)、細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞造成不可逆的損傷，其中危害最大的是超氧陰離子自由基。超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）是一種金屬蛋白，它含有銅、鋅、錳、鐵或鎳作為天然的輔基，可催化超氧陰離子自由基歧化成分子氧和過(guò)氧化氫，是抗氧化酶防御系統(tǒng)的第1 道防線，也是最重要的一道防線[10]。根據(jù)金屬輔助因子的不同，將SOD 分為4 種類型：Cu/Zn-SOD、Ni-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD[11-12]，這些SOD 分布在細(xì)胞的不同區(qū)域，在應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激中起關(guān)鍵作用[13]。

目前，針對(duì)SOD 的研究主要集中在臨床醫(yī)學(xué)研究、食品保藏、化妝品和植物抗逆性等4 個(gè)方面[14]。使用由鄰香草醛和柔性脂肪胺合成的含有雙核結(jié)構(gòu)的Mn-SOD 模擬化合物可顯著抑制促炎因子，減輕肝臟炎癥反應(yīng)，具有保護(hù)肝臟的作用[15]；從植物中提取的SOD 通過(guò)冷凍干燥得到的凍干粉是食品生產(chǎn)中穩(wěn)定性較高的酶制劑[16]，可抑制過(guò)氧化酶活性，減少食品變質(zhì)及腐敗，同時(shí)還可用作水果和蔬菜的保鮮劑[17]。本文從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選高產(chǎn)SOD 的乳酸菌菌株，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化菌株產(chǎn)SOD 的培養(yǎng)條件，為高產(chǎn)SOD 乳酸菌的工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)沙臭豆腐（C），紹興臭豆腐（S），寧波臭豆腐（N），南京臭豆腐（J），貴州泡菜（G）均為農(nóng)家制作。

MRS 瓊脂、MRS 肉湯，青島Hopebio 公司；無(wú)水碳酸鈣、氯化鈉、30%過(guò)氧化氫溶液，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司；總DNA 提取試劑盒、DNA marker，北京Trans Gen 生物技術(shù)有限公司；革蘭氏染色液試劑盒，北京Solarbio 公司；100 mmol/L PBS緩沖液 （pH 7.2～7.4），上海萊博科技有限公司；SOD 測(cè)定試劑盒，南京建成生物工程研究所；BCA蛋白測(cè)定試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

QHZ-12A 型組合式恒溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司；YXQ-30SII 型立式高壓滅菌鍋，濟(jì)南捷島分析儀器有限公司；Axio 顯微鏡，德國(guó)ZEISS 公司；5804R 型高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德有限公司；MultiGeneTM梯度PCR 儀，美國(guó)萊伯特公司；Infinite M200 PRO 型多功能酶標(biāo)儀，瑞士TECAN 公司；SCIENTZ-ⅡD 型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化 用無(wú)菌PBS 對(duì)樣品進(jìn)行梯度稀釋，涂布于含0.1 g/L 碳酸鈣的MRS 瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，挑選菌落形態(tài)不同且有明顯碳酸鈣溶解能力的菌株進(jìn)行劃線分離，分離3～5 代，直至得到純的培養(yǎng)物。對(duì)分離純化得到的菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶觸實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色，將過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)呈陰性和革蘭氏染色呈陽(yáng)性的菌株用體積分?jǐn)?shù)30%的甘油冷凍保藏于-40℃超低溫冰箱中。

1.3.2 抗過(guò)氧化氫乳酸菌的篩選 細(xì)胞中引起氧化應(yīng)激的因素有很多，在體外，過(guò)氧化氫常被用來(lái)構(gòu)建細(xì)胞的氧化損傷模型，研究抗氧化劑對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用。本試驗(yàn)中乳酸菌抗過(guò)氧化氫能力的測(cè)定根據(jù)陳曉琳等[18]的方法稍作改進(jìn)，初步篩選具有抗氧化能力的菌株，將生長(zhǎng)良好的菌株做好標(biāo)記，用于下一步SOD 酶活性的測(cè)定。

1.3.3 乳酸菌無(wú)細(xì)胞提取物的制備 取2 mL 活化培養(yǎng)的菌液于100 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，6 000 r/min 離心10 min，棄上清，用無(wú)菌PBS 洗3 次，將菌體重懸于PBS 溶液中，調(diào)整菌液密度至OD600nm=1.0，混勻。在冰浴條件下，用超聲細(xì)胞粉碎機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行破碎，4 ℃，10 000 r/min 離心30 min，取上清，用于SOD 酶活性的測(cè)定。

1.3.4 SOD 酶活性的測(cè)定 SOD 酶活性的測(cè)定按照SOD 檢測(cè)試劑盒的步驟進(jìn)行。以PBS 為對(duì)照，在測(cè)定過(guò)程中樣品的濃度需稀釋至抑制率在40%～60%范圍內(nèi)，在此之間酶活性的測(cè)定具有較高的精確度。規(guī)定當(dāng)SOD 的抑制率達(dá)50%時(shí)，所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD 活力單位（U）。

參照BCA 蛋白定量試劑盒的說(shuō)明書，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 16S rRNA 分子生物學(xué)鑒定 對(duì)SOD 酶活性高的菌株進(jìn)行16S rRNA 分子鑒定，分析方法在Hasan-Beikdashti[19]基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些修改。取1 mL 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，用DNA 試劑盒提取DNA，相關(guān)步驟參照DNA 提取試劑盒進(jìn)行。以DNA 為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），上游引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR 反應(yīng)組分如表1所示。

表1 PCR 反應(yīng)體系組分Table 1 The components of PCR

將各組分按照上表加樣后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，選取在1 500 bp 處有單一條帶的樣品送上海生物工程有限公司測(cè)序，利用BLAST 將分離得到的序列與Gen Bank 中的序列進(jìn)行比較，通過(guò)MEGA 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)篩選菌株進(jìn)行鑒定。

1.3.6 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線的測(cè)定 將活化后的菌液以2%的接種量接種至100 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃連續(xù)培養(yǎng)30 h，每隔2 h 進(jìn)行一次菌密度和pH 值的測(cè)定，連續(xù)測(cè)定30 h，分析數(shù)據(jù)并繪制生長(zhǎng)曲線和pH 變化曲線[20]。

1.3.7 單因素實(shí)驗(yàn) 為方便后續(xù)食品加工中對(duì)菌株產(chǎn)SOD 能力的判定，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程中菌株的酶活性用U/mL 來(lái)表示。

溫度：將活化后的菌株分別在20，25，30，37，42 ℃下培養(yǎng)18 h，混勻錐形瓶，取相同體積的菌液，無(wú)菌PBS 洗2 次，最終重懸于相同體積的PBS中用于SOD 酶活性測(cè)定，每組試驗(yàn)做3 個(gè)重復(fù)，下同。

接種量：將活化后的菌株密度調(diào)整為一致，按照1%，2%，3%，4%，5%的比例接種至MRS 肉湯培養(yǎng)基中，在相同的溫度下連續(xù)培養(yǎng)18 h 后測(cè)定菌株的SOD 酶活性。

pH 值：分別用1 mol/L 的鹽酸和1 mol/L 的氫氧化鈉將MRS 肉湯培養(yǎng)基的pH 值調(diào)至5.5，6.0，6.5，7.0，7.5 和8.0。在相同培養(yǎng)條件下對(duì)菌株的SOD 酶活性進(jìn)行測(cè)定。

裝液量：將活化后的菌液分別接種至50，75，100，125，150 mL 的MRS 肉湯培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)18 h 后，4 ℃8 000 r/min 離心10 min，無(wú)菌PBS洗滌，測(cè)定菌株的SOD 酶活性，確定最佳裝液量。

1.3.8 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出菌株產(chǎn)SOD 的最佳發(fā)酵溫度、接種量、pH 值和裝液量，設(shè)計(jì)4 因素3 水平的L9（34）正交試驗(yàn)，根據(jù)SOD 的活性進(jìn)一步確定菌株的最佳發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離和過(guò)氧化氫抗性試驗(yàn)

從5 份樣品中篩選出了104 株在CaCO3-MRS 瓊脂培養(yǎng)基上具有明顯鈣溶圈且與乳酸菌有相似表型特征的菌株進(jìn)行分離純化[21]。其中，20 株來(lái)自長(zhǎng)沙臭豆腐 （編號(hào)C1～C20），22 株來(lái)自紹興臭豆腐（編號(hào)S1～S22），20 株來(lái)自寧波臭豆腐（編號(hào)N1～N20），20 株來(lái)自南京臭豆腐 （編號(hào)J1～J20），22 株來(lái)自貴州泡菜（編號(hào)G1～G22）。對(duì)這些分離的菌株進(jìn)行革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶觸試驗(yàn)，所有挑選的菌株都表現(xiàn)出過(guò)氧化氫酶陰性、革蘭氏陽(yáng)性。根據(jù)對(duì)過(guò)氧化氫抗性能力的測(cè)定，初步篩選出20 株具有抗氧化能力的菌株，用作下一步酶活性的測(cè)定。

2.2 超氧化物歧化酶活性的測(cè)定

初步篩選出20 株對(duì)過(guò)氧化氫有抗性的乳酸菌，用SOD 檢測(cè)試劑盒對(duì)20 株乳酸菌進(jìn)行酶活性測(cè)定，結(jié)果如圖1所示（酶活性低且差異性不顯著的數(shù)據(jù)未顯示）。

圖1 乳酸菌產(chǎn)SOD 的差異水平分析Fig.1 Different level analysis of SOD produced by lactic acid bacteria

如圖1所示，C8 產(chǎn)SOD 的酶活性最高，達(dá)349.62 U/mg，其次是S9、N2、N3 和C18。N5、N6、J7和G2 之間的SOD 酶活性不存在顯著性差異（P＞0.05），J15 和C18 的酶活性不存在顯著差異（P＞0.05），C8 的SOD 酶活性大小是G2 的4.2 倍，J15的2.1 倍，可作為高產(chǎn)SOD 酶的菌株做進(jìn)一步的研究。

2.3 產(chǎn)SOD 乳酸菌的鑒定

C8 的碳酸鈣溶解能力和革蘭氏染色如圖2A和2B 所示，根據(jù)16S rRNA 基因序列，通過(guò)同源性分析構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2C 所示。C8 屬于乳球菌屬（Lactococcus），與已知菌株Lactococcus lacticL105 的序列同源性達(dá)到100%，可將其確定為乳酸乳球菌。

圖2 C8 的菌落形態(tài)特征和分子鑒定Fig.2 Colony morphology and molecular identification of C8

2.4 菌株生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酸能力的分析

乳酸乳球菌在30 h 內(nèi)的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線如圖3所示，菌株在培養(yǎng)4 h 后OD 值顯著上升，pH 曲線和生長(zhǎng)曲線保持相同的趨勢(shì)，在培養(yǎng)4 h 后，pH 值開始下降。結(jié)果表明，乳酸乳球菌在4～12 h 間處于快速增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)18 h 后增長(zhǎng)緩慢，進(jìn)入穩(wěn)定期。Sorde 等[22]對(duì)菌株B4 和C2產(chǎn)新型谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)酶的最大產(chǎn)量均出現(xiàn)在生長(zhǎng)穩(wěn)定期。因此選擇培養(yǎng)18 h 時(shí)的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件優(yōu)化。

圖3 乳酸乳球菌生長(zhǎng)曲線和pH 值變化曲線Fig.3 The growth curve and pH value change curve of Lactococcus lactis

2.5 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

乳酸乳球菌在不同發(fā)酵溫度（20～42 ℃）下的SOD 活性如圖4a 所示。結(jié)果表明，隨著溫度的升高，SOD 的活性從20 ℃的14.2 U/mL 逐漸增加到37 ℃的46.7 U/mL，提高了3.3 倍。30 ℃條件下培養(yǎng)的乳酸乳球菌SOD 的產(chǎn)量雖然高于25 ℃，但兩者無(wú)顯著性差異（P>0.05）。當(dāng)溫度從37 ℃上升到42 ℃時(shí)，酶的產(chǎn)量急劇下降到6.4 U/mL。在37 ℃培養(yǎng)條件下，乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 的量分別是20，25，30，42 ℃的3.3，1.13，1.1，7.3 倍。研究結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度過(guò)高（42 ℃）或過(guò)低（20 ℃）均會(huì)對(duì)乳酸乳球菌的SOD 活性產(chǎn)生顯著影響，可能非最適培養(yǎng)溫度不利于乳酸乳球菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響酶的積累。在特定的接種濃度和培養(yǎng)時(shí)間下，乳酸乳球菌在37 ℃具有最高酶活性，可作為最優(yōu)產(chǎn)酶溫度用于SOD 的生產(chǎn)。

為確定乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 的最優(yōu)初始接種量，將菌株以不同比例接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h 后測(cè)定SOD 的活性。結(jié)果如圖4b所示，SOD 酶的變化與溫度優(yōu)化的趨勢(shì)相似，隨著菌液接種量的增加，乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 的能力不斷增強(qiáng)，在接種量為3%時(shí)，達(dá)到最大酶活（60.5 U/mL）。接種量為4%和5%時(shí)，SOD 的活性逐漸下降，分別為58.3，47.8 U/mL，兩者存在顯著差異（P≤0.05）。與3%接種量相比，以4%接種量培養(yǎng)的乳酸乳球菌SOD 活性略有下降，然而兩者無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，在37 ℃培養(yǎng)條件下，初始接種量為3%時(shí)，乳酸乳球菌的SOD 酶活性最高，接種量低于或高于3%均會(huì)影響SOD 的產(chǎn)量，可能由于固有培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分在3%的接種量時(shí)，可達(dá)到最大利用率，接種量越大越不利于菌株的生長(zhǎng)，或者在接種量大的培養(yǎng)條件下菌株不能達(dá)到生長(zhǎng)的穩(wěn)定期，不利于SOD 酶的積累。

通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH 值，比較在不同pH 環(huán)境下乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 的差異性。結(jié)果如圖4c 所示，在中性或弱堿性條件下，乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 的能力顯著高于弱酸性條件（P≤0.05）。在pH 5.5 和pH 6.0 的弱酸性條件下，培養(yǎng)的乳酸乳球菌SOD 活性較低，分別為59.21 U/mL 和60.12 U/mL，兩者不存在顯著性差異（P＞0.05）。在初始pH 值為7.5 的弱堿性條件下，菌株的SOD 活性達(dá)76.69 U/mL。結(jié)果表明，與弱酸性條件相比，弱堿性的培養(yǎng)環(huán)境更有利于乳酸乳球菌SOD 的生成，可能由于弱堿性環(huán)境有利于乳酸菌產(chǎn)生乳酸，促進(jìn)乳酸菌生長(zhǎng)。

圖4d 表明不同灌裝量對(duì)乳酸乳球菌產(chǎn)SOD的影響。如圖所示SOD 的活性隨培養(yǎng)基體積的增加而逐漸降低，從92 U/mL（75 mL）降至86.1 U/mL（150 mL）。在150 mL 和50 mL、100 mL 和125 mL中培養(yǎng)的乳酸乳球菌SOD 的活性無(wú)顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，在250 mL 錐形瓶中，當(dāng)灌裝量為75 mL 時(shí)，SOD 活性最高。灌裝量的多少反映了菌株發(fā)酵過(guò)程中的通氣量，影響菌體的生長(zhǎng)[18]。在本研究中灌裝量的多少直接影響乳酸乳球菌的生長(zhǎng)和SOD 酶的積累，75 mL 可作為最佳的裝液量。

圖4 不同培養(yǎng)條件下乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 的能力Fig.4 The ability of Lactococcus lactis to produce SOD under different culture conditions

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)的正交試驗(yàn)如表2所示。在不同發(fā)酵條件下測(cè)定各組SOD 的活性，結(jié)果如表3所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 2 The design of orthogonal experiments

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiments

由極差R可知，各發(fā)酵條件對(duì)乳酸乳球菌產(chǎn)SOD 活性的影響順序?yàn)闇囟龋ˋ）＞pH（C）＞接種量（B）＞裝液量（D），表明溫度和初始pH 值對(duì)菌株產(chǎn)SOD 能力的影響顯著。根據(jù)k1、k2和k3可知，最優(yōu)水平組合為A2B2C2D2，其SOD 的活性如表4所示。最優(yōu)組合的SOD 活性較優(yōu)化前提高了2 倍多，三者存在顯著性差異，可確定最優(yōu)組合為：發(fā)酵溫度37 ℃、接種量3%、初始pH 值7.5、最佳裝液量75 mL。

表4 正交試驗(yàn)的驗(yàn)證Table 4 Verification of orthogonal experiments

3 討論與結(jié)論

傳統(tǒng)發(fā)酵食品是篩選具備各種功能乳酸菌的主要來(lái)源，例如：泡菜、干腌肉和奶酪，其中乳酸菌為發(fā)酵產(chǎn)品提供了額外的益生菌特性[23-24]。SOD 是一種內(nèi)源性抗氧化酶，主要來(lái)源于真核生物，如植物和動(dòng)物[25-26]，具有較強(qiáng)的抗氧化能力，可催化超氧陰離子產(chǎn)生氧氣[27]。真核生物中對(duì)SOD 的純化可顯著提高SOD 的活性，被廣泛用作抗衰老配方的添加劑。Santos 等[28]采用DEAE 生物凝膠柱對(duì)來(lái)自脫硫弧菌的Fe-SOD 進(jìn)行純化，純化后酶活性達(dá)到1 900 U/mg。Thakur 等[29]測(cè)定了來(lái)自地衣芽孢桿菌SPB-13 的熱穩(wěn)定性Fe/Mn-SOD，其粗酶活力達(dá)245.12 U/mg，純化后為3 965.51 U/mg。與真核微生物相比，產(chǎn)SOD 的乳酸菌具有更多的優(yōu)勢(shì)特性，在食品中的應(yīng)用更為廣泛。首先，乳酸菌可作為發(fā)酵劑直接在發(fā)酵食品中使用，其次乳酸菌產(chǎn)生的SOD 不需要繁瑣的純化步驟。本研究從長(zhǎng)沙臭豆腐中篩選出一株SOD 活性達(dá)349.62 U/mg 的乳酸乳球菌，可用作發(fā)酵產(chǎn)品的發(fā)酵劑，提高產(chǎn)品的功能特性。

得到具有高活性的SOD 不僅需要篩選潛在產(chǎn)SOD 的菌株，還需要優(yōu)化其培養(yǎng)條件。張海玲等[30]采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化重組酵母產(chǎn)SOD 的發(fā)酵條件，在培養(yǎng)溫度28 ℃，接種體積分?jǐn)?shù)1%，誘導(dǎo)體積分?jǐn)?shù)1%的條件下，重組酵母產(chǎn)SOD 的活性顯著提高近3 倍。李曉艷等[31]對(duì)海洋來(lái)源的植物乳桿菌CLP0279 產(chǎn)低溫SOD 的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，在發(fā)酵溫度20 ℃，時(shí)間68 h，初始pH 7.0，接種量8%，裝液量75 mL 的條件下，植物乳桿菌產(chǎn)SOD 的活性提高了1.32 倍。本研究在此基礎(chǔ)上通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究了發(fā)酵溫度、接種量、初始pH值和灌裝量對(duì)乳酸乳球菌SOD 活性的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)培養(yǎng)條件為發(fā)酵溫度37 ℃，接種量3%，初始pH 7.5，灌裝量75 mL。乳酸乳球菌經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)后產(chǎn)SOD 的活性提高2 倍多，可為后期工業(yè)化生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)參考。

今后，可在此優(yōu)化條件下繼續(xù)深入研究：（1）乳酸乳球菌與保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌群效應(yīng)如何？ 是否可顯著提高菌群的SOD 活性？（2）乳酸乳球菌是否會(huì)對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)產(chǎn)生影響？與市售發(fā)酵乳相比，是否可提高發(fā)酵乳的總抗氧化能力？ 本研究的深入探索可為功能性發(fā)酵乳的研發(fā)提供可實(shí)施的思路和基礎(chǔ)。