分子對(duì)接結(jié)合熒光光譜法探究單寧酸與血清蛋白結(jié)合的pH依賴(lài)性

范金波，周素珍，閆 泳，呂長(zhǎng)鑫，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013）

酚類(lèi)化合物作為次生代謝物存在于大多數(shù)植物中，它們具有抗氧化、抗凋亡、抗衰老、抗癌、抗炎、心臟血管保護(hù)、內(nèi)皮功能增強(qiáng)活性、抑制血管再生和細(xì)胞增殖活性等多種生化特性[1-2]。酚類(lèi)化合物一般具有較差的穩(wěn)定性，顯著降低了其功效，因此其蛋白基載體的保護(hù)和遞送成為研究的熱點(diǎn)[3]。

人血清白蛋白（Human serum albumin，HSA）是血漿蛋白中常見(jiàn)的載體蛋白，在血漿中以結(jié)合形式攜帶藥物。在許多條件下，結(jié)合會(huì)導(dǎo)致藥物和蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化[4]。HSA 由585 個(gè)氨基酸多肽鏈、3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，包含2 個(gè)常見(jiàn)的結(jié)合位點(diǎn)，分別位于亞結(jié)構(gòu)域IIA 和IIIA[5]。牛血清白蛋白（Bovibe serum albumin，BSA） 是牛血清中的一種球蛋白，由583 個(gè)氨基酸殘基組成，是HSA 的同源蛋白。BSA 有2 個(gè)色氨酸殘基（Trp 134 和Trp 213），其中Trp 213 是位點(diǎn)Sudlow's site I 的主熒光殘基，而Trp 134 位于分子表面，HSA 只有1 個(gè)色氨酸殘基（Trp 214） 位于亞結(jié)構(gòu)域IIA。BSA/HSA 能夠結(jié)合多種內(nèi)源性和外源性活性物質(zhì)，并在其遞送、分布和代謝中起重要作用。

單寧是一類(lèi)酚類(lèi)化合物，存在于各種各樣的食物和飲料中[6]。單寧酸（Tannic acid，TA）屬于一種水溶性單寧，常見(jiàn)的果蔬中都含有豐富的TA。TA 因富含羥基和羧基，可與許多分子，如蛋白質(zhì)、多糖和生物堿形成復(fù)合物[7]，故常被用作交聯(lián)劑或穩(wěn)定劑[8]。層層組裝制備蛋白-TA 多層膜，能夠使活性成分免于胃消化，而在腸道中正常消化吸收，從而提高活性成分功效[9]。有研究報(bào)道蛋白-TA 復(fù)合物可作為有效的抗氧化乳化劑[10-11]。Kaspchak等[6]研究了熱處理和離子強(qiáng)度對(duì)于BSA 與TA 結(jié)合的影響以及結(jié)合作用對(duì)體外蛋白質(zhì)消化率的影響，結(jié)果表明，高離子強(qiáng)度促進(jìn)了兩者的結(jié)合，同時(shí)降低了體外蛋白質(zhì)消化率；熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，不利于兩者結(jié)合，同時(shí)促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解。

相互作用取決于多種因素，如單寧和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、pH 值、離子強(qiáng)度、溫度和溶液中蛋白質(zhì)的濃度[12]。目前，很少有用熒光光譜結(jié)合分子模擬研究pH 值對(duì)TA 與BSA/HSA 分子相互作用的影響。本文以BSA/HSA 為模型蛋白，以TA 為配體分子，通過(guò)熒光光譜結(jié)合分子模擬技術(shù)研究pH 值對(duì)BSA/HSA-TA 相互作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（99%）、人血清白蛋白（99%），北京百靈威科技有限公司；TA （98%）、布洛芬（Ibuprofen，IBUP 98% ）、華法林（Warfarin，WARF 98%），生工生物工程（上海）有限公司；無(wú)水乙醇、磷酸氫二鈉、檸檬酸等均為分析純級(jí)；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

F-7000 熒光分光光度計(jì)，日本日立高新技術(shù)公司；FE20 實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-2700 紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，日 本SHIMADZU 公司；Milli-Q Reference 型 超純水機(jī)，德國(guó)默克密理博有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 儲(chǔ)備液的配制 配制0.2 mol/L 磷酸緩沖液 （pH 7.4，5.0，4.0），并配制1.2×10-4mol/L 的BSA 儲(chǔ)備液，以及濃度為3.6×10-4mol/L 的TA、WARF、IBUP 儲(chǔ)備液。

1.3.2 TA 與血清白蛋白相互作用的熒光光譜測(cè)定 熒光發(fā)射光譜：取8 支離心管，移液槍準(zhǔn)確移取1.2×10-4mol/L BSA 30 μL，再分別移取一定體積3.6×10-4mol/L TA，用不同pH 值緩沖溶液定容至3 mL，使得BSA 濃度為1.2 μmol/L、TA 濃度為0～4.2 μmol/L，充分反應(yīng)30 min。設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫的寬度分別設(shè)定為2.5 nm 和5 nm，掃描速度為700 nm/min，測(cè)定290～450 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜并記錄。

同步熒光光譜：室溫下，固定激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)之間的間隔分別為Δλ=60 nm 和Δλ=15 nm，分別測(cè)定樣品的色氨酸殘基在波長(zhǎng)200～380 nm和酪氨酸殘基在波長(zhǎng)235～380 nm 的同步熒光光譜。

1.3.3 TA 與血清白蛋白的結(jié)合位點(diǎn)分析 參照1.3.2 節(jié)方法，加入TA 前，先加入WARF/IBUP 充分搖勻反應(yīng)20 min，使其濃度為6.0 μmol/L，后續(xù)操作與1.3.2 節(jié)相同。

1.3.4 分子對(duì)接 采用AutoDock vina 4.0 軟件研究單寧酸與血清蛋白分子對(duì)接。BSA（ID：4OR0）、HSA （ID：1HA2）來(lái)源于RCSB PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)，去除b 鏈和水，TA（PubChem CID：16129778）3D 結(jié)構(gòu)來(lái)源于PubChem，通過(guò)默認(rèn)設(shè)置與Gasteiger 電荷計(jì)算準(zhǔn)備，BSA/HSA/TA 結(jié)構(gòu)都加入了氫原子[13]。設(shè)置網(wǎng)格框 （BSA，x=82、y=45 和z=67，間距為1.0 ?） 和 （HSA，x=87、y=35 和z=77，間距為1.0 ?），以覆蓋所有位點(diǎn)。BSA/HSA 選擇剛性對(duì)接，而TA 選擇柔性對(duì)接，使用LGA 遺傳算法，參數(shù)都使用默認(rèn)值。以最低能量確定最佳對(duì)接構(gòu)象，由Discovery Studio v17.2.0 軟件分析相互作用力，并由Pymol 軟件呈現(xiàn)分子對(duì)接3D 圖[13-14]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 TA 對(duì)血清白蛋白熒光的影響

2.1.1 TA 對(duì)BSA 熒光的影響 圖1所示，不同pH 值條件下，TA 對(duì)BSA 均產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，隨著TA 濃度（0～4.2 μmol/L）改變呈現(xiàn)規(guī)律性的變化，具有量效關(guān)系。當(dāng)pH 7.4 時(shí)，BSA 的熒光強(qiáng)度峰值降低了95%；而在pH 5.0 和pH 4.0 時(shí)，BSA的熒光強(qiáng)度峰值分別降低了82%和77%。不同pH值條件下，最大發(fā)射波長(zhǎng)（λmax）變化趨勢(shì)不同，pH 7.4 時(shí)發(fā)生藍(lán)移（338～332 nm），而pH 5.0（331～338 nm）和pH 4.0（331～337 nm）時(shí)發(fā)生紅移，可能是由于pH 和TA 對(duì)于BSA 共同作用改變了熒光基團(tuán)的微環(huán)境。由圖1d 所示，隨著TA 濃度的增大猝滅率逐漸增大，其中pH 7.4 時(shí)，顯著高于pH 5.0 和pH 4.0（P＜0.05），而pH 5.0 和pH 4.0 差異不顯著（P＞0.05）。這些結(jié)果表明，不同pH 值條件下TA 均與BSA 發(fā)生結(jié)合作用，從而產(chǎn)生了內(nèi)源性熒光猝滅作用。

2.1.2 TA 對(duì)HSA 熒光的影響 由圖2a、2b 可知，隨著TA（0～4.2 μmol/L）的加入，HSA 熒光光譜均產(chǎn)生了規(guī)律的猝滅作用，峰形無(wú)顯著變化，而圖2c 峰形產(chǎn)生明顯變化，在310 nm 波長(zhǎng)處出現(xiàn)新峰且總體峰強(qiáng)顯著降低。據(jù)文獻(xiàn)[15]報(bào)道，該峰為“酪氨酸熒光肩”，是酪氨酸殘基特征峰，由于280 nm激發(fā)波長(zhǎng)下酪氨酸的熒光量子產(chǎn)率低于色氨酸，所以峰強(qiáng)顯著降低，這些結(jié)果說(shuō)明pH 4.0 時(shí)HSA熒光基團(tuán)顯著變化，酪氨酸殘基貢獻(xiàn)顯著增加，與BSA 相比（圖1c），pH 4.0 對(duì)于HSA 的影響更大。pH 值變化影響λmax，pH 7.4，5.0，4.0 時(shí)，λmax分別為335，337，324 nm，隨著TA 濃度的增加λmax分別藍(lán)移5 nm（335～330 nm）、紅移4 nm（337～341 nm）和藍(lán)移14 nm（324～310 nm），這些都說(shuō)明TA與HSA 發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，加之pH 值的影響改變了HSA 的結(jié)構(gòu)。由圖2d 可知，pH 7.4 時(shí)猝滅率最高，而pH 5.0 時(shí)最低，說(shuō)明pH 值影響了TA 與HSA 的結(jié)合反應(yīng)。Sekowski 等[16]研究了3 種單寧與HSA 的相互作用，熒光發(fā)射光譜表明隨著單寧濃度的增加（0.0～10.0 μmol/L）均出現(xiàn)熒光猝滅現(xiàn)象。

圖1 pH 值對(duì)TA 與BSA 結(jié)合熒光光譜的影響Fig.1 Effect of TA on fluorescence spectra of BSA at different pH value

2.2 熒光猝滅機(jī)理

Stern-Volmer 方程（1）常用來(lái)分析小分子與蛋白的結(jié)合作用和熒光猝滅機(jī)理，一般熒光猝滅主要分為靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅[4，17]。

式中，F(xiàn)0——未加TA 時(shí)熒光強(qiáng)度；F——加入TA 時(shí)熒光強(qiáng)度；[Q]——TA 的濃度，mol/L；Kq——雙分子猝滅速率常數(shù)，L/（mol·s）；τ0——熒光分子平均壽命，其值為10-8s；Ksv——Stern-Volmer 猝滅常數(shù)，L/mol。

根據(jù)方程（1），可計(jì)算不同條件下TA 與血清白蛋白結(jié)合的Ksv和Kq，具體結(jié)果見(jiàn)1 和表2。由表1可知，生理?xiàng)l件下（pH 7.4），隨著溫度的升高，Ksv由4.770×106降至3.160×106，且Kq均大于2×1010（生物分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)），說(shuō)明TA 對(duì)BSA 猝滅是通過(guò)靜態(tài)猝滅作用，生成了TA-BSA 復(fù)合物[18]。同理，由表2可知，TA 對(duì)BSA猝滅作用也是通過(guò)靜態(tài)猝滅實(shí)現(xiàn)的，最后生成了TA-HSA 復(fù)合物。相同溫度條件下（298 K）pH 值變化影響了Ksv，在pH 7.4 時(shí)無(wú)論是BSA 還是HSAKsv最大，Ksv隨著pH 值的降低而呈減小趨勢(shì)，該結(jié)果驗(yàn)證了圖1、圖2的結(jié)果。

圖2 pH 值對(duì)TA 與HSA 結(jié)合熒光光譜的影響Fig.2 Effect of TA on fluorescence spectra of HSA at different pH value

2.3 結(jié)合常數(shù)計(jì)算

蛋白熒光猝滅數(shù)據(jù)（存在和不存在猝滅劑）可以用來(lái)計(jì)算結(jié)合常數(shù)，由于本試驗(yàn)最大TA 濃度是BSA/HSA 濃度的3.5 倍，最適合應(yīng)用方程（2）計(jì)算TA 與BSA/HSA 結(jié)合常數(shù)[15，19]。

式中，F(xiàn)——不同TA 濃度下測(cè)定的熒光強(qiáng)度；F0——未加TA 時(shí)熒光強(qiáng)度；Fc——完全絡(luò)合蛋白的熒光；Kd=1/Ka解離常數(shù)；[P]t，[L]a——BSA/HSA 和TA 的分析濃度，mol/L。

基于方程（2）采用Origin 進(jìn)行非線性擬合，不同條件下BSA/HSA 與TA 的結(jié)合常數(shù)見(jiàn)表1和表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同條件下TA 與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)Ka都在105-107L/mol 數(shù)量級(jí)，說(shuō)明結(jié)合能力很強(qiáng)，pH 值變化顯著影響結(jié)合常數(shù)，生理?xiàng)l件下（pH 7.4）結(jié)合常數(shù)最大。研究發(fā)現(xiàn)3 種大戟單寧與HSA 結(jié)合常數(shù)（pH 7.4，298 K）在2.8×105～5.7×105L/mol 范圍內(nèi)，與本文結(jié)果一致[16]。Kaspchak 等[6]通過(guò)等溫滴定量熱法測(cè)得BSA 與TA 結(jié)合常數(shù)（pH 3.0，298 K）為2.9×104L/mol，與本文的差別可能是由于pH 值降低的影響，進(jìn)一步說(shuō)明了pH 值顯著影響了BSA 與TA 的結(jié)合反應(yīng)。

表1 TA 與BSA 相互作用熒光猝滅常數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants of BSA by TA

表2 TA 與HSA 相互作用熒光猝滅常數(shù)Table 2 Fluorescence quenching constants of HSA by TA

2.4 熱力學(xué)性質(zhì)和作用力類(lèi)型

非共價(jià)蛋白-多酚復(fù)合物的形成主要通過(guò)氫鍵、范德華力、疏水相互作用和靜電相互作用4 種作用力[20]。當(dāng)溫差較小時(shí)，ΔH可被認(rèn)為不變，兩溫度下通過(guò)Van’t Hoff 方程（3）和（4）計(jì)算熱力學(xué)參數(shù)[21]。

式中，K1，K2，Ka——T1（298 K），T2（310 K）和T時(shí)，TA 與血清白蛋白的結(jié)合常數(shù)；熱力學(xué)參數(shù)ΔG，ΔH，ΔS——結(jié)合反應(yīng)的吉布斯自由能、焓變和熵變。

由表3可知，ΔH<0 且ΔS<0 時(shí)，說(shuō)明BSATA 復(fù)合物的形成是一個(gè)放熱過(guò)程，焓驅(qū)動(dòng)的過(guò)程，主要作用力為氫鍵[22]，結(jié)論與文獻(xiàn)[6]報(bào)道一致；而對(duì)于HSA ΔH<0 且ΔS>0 時(shí)，HSA-TA 復(fù)合物的形成也是一個(gè)放熱過(guò)程，屬于焓和熵共同驅(qū)動(dòng)，主要作用力為氫鍵和疏水相互作用。BSA/HSA 吉布斯自由能降低（ΔG<0），表明復(fù)合物的形成均是自發(fā)進(jìn)行的。

表3 TA 與血清白蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic constants for the interaction of TA with serum albumin

2.5 同步熒光光譜測(cè)定

由于蛋白質(zhì)中芳香氨基酸的固有熒光對(duì)微環(huán)境敏感[23]，所以同步熒光光譜常用來(lái)評(píng)價(jià)活性小分子結(jié)合作用引起的蛋白質(zhì)微環(huán)境的變化，本文通過(guò)同步熒光光譜測(cè)定TA 誘導(dǎo)的BSA/HSA 構(gòu)象的變化。當(dāng)△λ=15 nm 和△λ=60 nm 時(shí)，同步熒光光譜分別反映酪氨酸殘基和色氨酸殘基的微環(huán)境的變化[24]。TA 對(duì)BSA/HSA 同步熒光光譜的影響結(jié)果如圖3所示。隨著TA 濃度的增加，酪氨酸殘基和色氨酸殘基內(nèi)源熒光強(qiáng)度均逐漸降低，在此過(guò)程中酪氨酸（BSA 3 nm/HSA 2 nm）和色氨酸（BSA 2 nm/HSA 1 nm）均出現(xiàn)了微弱的藍(lán)移，說(shuō)明酪氨酸的極性微減，疏水作用略有增強(qiáng)，說(shuō)明蛋白質(zhì)分子發(fā)生了一定變化，空間趨于折疊[25]。以上，可以推測(cè)酪氨酸殘基和色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生了微弱的變化，說(shuō)明TA 的結(jié)合改變了BSA/HSA 的構(gòu)象。

圖3 TA 對(duì)BSA（a、b）和HSA（c、d）的同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of tannic acid on synchronous fluorescence spectra of BSA /HSA

2.6 TA 與血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)分析

為確定TA 在血清白蛋白的實(shí)際結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)。通過(guò)利用華法林與血清白蛋白的亞結(jié)構(gòu)域ⅡA（Sudlow's site I）及布洛芬與血清白蛋白的亞結(jié)構(gòu)域ⅢA（Sudlow's site II）的特異性結(jié)合，比較猝滅率的變化來(lái)判斷TA 與血清白蛋白結(jié)合位點(diǎn)的位置。

2.6.1 TA 與BSA 結(jié)合位點(diǎn)分析 如圖4a 和圖4b 所示，在pH 7.4 條件下，IBUP 的存在沒(méi)有顯著影響TA 對(duì)BSA 的熒光猝滅作用，說(shuō)明TA 與BSA 結(jié)合位點(diǎn)與IBUP 不同，不在亞結(jié)構(gòu)域ⅢA 附近；而華法林的存在顯著降低了TA 與BSA 的結(jié)合，說(shuō)明TA 與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)與WARF 相似，在亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 附近，即Sudlow's site I 附近。

由如圖4c 和圖4d 可知，在pH 5.0 條件下，IBUP 和WARF 的存在沒(méi)有顯著影響TA 與BSA的結(jié)合，說(shuō)明TA 與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)既不在亞結(jié)構(gòu)域ⅢA 附近，也不在亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 附近。因此，pH 值影響了TA 與BSA 的結(jié)合，不同pH 值的結(jié)合位點(diǎn)也不同。

由如圖4e 和圖4f 可知，在pH 4.0 條件下，IBUP 和WARF 的存在顯著降低了TA 與BSA 的結(jié)合，說(shuō)明TA 與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)位于亞結(jié)構(gòu)域ⅢA 和亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 之間。2.6.2 TA 與HSA 結(jié)合位點(diǎn)分析 如圖5a 和圖5b 所示，在pH 7.4 條件下，IBUP 的存在顯著增加TA 對(duì)HSA 的熒光猝滅作用，說(shuō)明TA 與HSA 結(jié)合位點(diǎn)與IBUP 不同；而華法林的存在顯著降低了TA 與HSA 的結(jié)合，說(shuō)明TA 與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)與WARF 相似，在亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 附近。Sekowski等[16]研究證實(shí)3 種單寧以不同結(jié)合力均結(jié)合到HSA疏水腔Sudlow's site I 上，與本文結(jié)論相同。

圖4 WARF 和IBUP 對(duì)TA 與BSA 結(jié)合的影響Fig.4 Influence of WARF and IBUP on the binding between TA and BSA

圖5 WARF 和IBUP 對(duì)TA 與HSA 結(jié)合的影響Fig.5 Influence of WARF and IBUP on the binding interaction between TA and HSA

由如圖5c～5f 可知，在pH 5.0 和pH 4.0 條件下，IBUP 和WARF 存在沒(méi)有顯著影響TA 與HSA 的結(jié)合，說(shuō)明TA 與HSA 的結(jié)合位點(diǎn)既不在亞結(jié)構(gòu)域ⅢA 附近，也不在亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 附近。因此，pH 值影響TA 與HSA 的結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)隨著pH 值發(fā)生變化，可能與不同pH 值下蛋白溶解度、伸展程度有關(guān)。

2.7 分子對(duì)接

分子對(duì)接是研究小分子在蛋白質(zhì)上最佳結(jié)合位點(diǎn)的有效且準(zhǔn)確的方法[26]。本文通過(guò)Autodock vina 軟件研究TA 與BSA/HSA 的分子對(duì)接，最佳構(gòu)象ΔG分別為-40.61 kJ·mol-1和-45.64 kJ·mol-1，與熒光結(jié)果一致。由圖6可知，無(wú)論是BSA 還是HSA 都結(jié)合到亞結(jié)構(gòu)域ⅡA 與亞結(jié)構(gòu)域ⅢA 之間，其它構(gòu)象同樣結(jié)合到該位置附近，可能與TA的空間構(gòu)象大（約5 000 ?3）有關(guān)，其它位點(diǎn)不能容納TA。由圖6A 可知，TA 與BSA 結(jié)合位點(diǎn)位于Sudlow's siteⅠ外側(cè)，主要通過(guò)TYR451、ARG256和ARG435 等殘基形成氫鍵 （表4），這與位點(diǎn)Marker 試驗(yàn)結(jié)果一致，同時(shí)與ALA290、LYS187、ARG435 和LEU237 殘基形成疏水鍵，與LYS221、GLU443 殘基形成離子鍵，這些化學(xué)鍵對(duì)于TABSA 復(fù)合物的形成提供了有力支撐。同樣，由圖6B 和表4可知，TA 與HSA 結(jié)合位點(diǎn)位于Sudlow's site Ⅰ，主要作用力為疏水相互作用（ALA191、ALA291 等），同時(shí)氫鍵（ARG222、LYS436、LYS195 等） 和離子相互作用（ARG218、LYS436）也有利于結(jié)合反應(yīng)，這些與位點(diǎn)Marker試驗(yàn)和熱力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果一致。

表4 TA-BSA/HSA 結(jié)合能，K，結(jié)合位點(diǎn)氨基酸殘基及作用力結(jié)合自由能Table 4 Binding free energy，K，amino acid residues in binding site and interaction forces of TA-BSA/HSA

圖6 TA 與BSA（A）和HSA（B）的預(yù)測(cè)結(jié)合位點(diǎn)、位點(diǎn)氨基酸殘基和作用力Fig.6 Predicted binding sites，the binding sites amino acids and interaction forces of between BSA （A） and HSA （B） with TA

3 結(jié)論

論文采用熒光光譜法研究了TA 與BSA/HSA在pH 7.4/pH 5.0/pH 4.0 條件下的結(jié)合作用，通過(guò)Stern-volumer 方程、非線性方程和Van't Hoff方程解析猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)和作用力類(lèi)型，通過(guò)同步熒光考察TA 對(duì)BSA/HSA 構(gòu)象的影響，最后位點(diǎn)Marker 實(shí)驗(yàn)結(jié)合分子對(duì)接確定結(jié)合位點(diǎn)、關(guān)鍵氨基酸和作用力。結(jié)果表明，3 種pH 值條件下，TA 對(duì)BSA/HSA 均產(chǎn)生了熒光猝滅現(xiàn)象，Ksv呈pH依賴(lài)性，pH 7.4 時(shí)猝滅作用最強(qiáng)，說(shuō)明生理pH 條件下TA 與BSA/HSA 更容易結(jié)合，結(jié)合常數(shù)Ka結(jié)果與Ksv結(jié)果相似，同樣受pH 值的影響；熱力學(xué)參數(shù)結(jié)合分子對(duì)接表明TA 與BSA/HSA 主要依賴(lài)氫鍵和疏水相互作用結(jié)合，反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行；位點(diǎn)Marker 試驗(yàn)與分子對(duì)接試驗(yàn)證實(shí)，pH 7.4 條件下TA 與BSA/HSA 的結(jié)合位點(diǎn)均位于Sudlow's site I 附近，而且pH 值影響TA 與BSA/HSA 的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果表明，TA 與BSA/HSA 的結(jié)合存在pH 值依賴(lài)性，這對(duì)于設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)蛋白基-TA 載體提供了理論參考且具有重要意義。