紅色熒光碳量子點(diǎn)用于腫瘤微酸環(huán)境診斷

黃靖 ，王丹陽(yáng) ，李淑花 ，范紅 ，范樓珍 ,＊

1北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，北京 100875

2首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院，北京 100043

3山西省人民醫(yī)院，太原 030012

1 引言

近年來(lái)，癌癥已經(jīng)成為危害人類(lèi)身體健康的主要疾病1–3。腫瘤的早期診斷能顯著提高癌癥患者存活率或延長(zhǎng)生存期4–6。目前，用于腫瘤診斷的熒光材料主要通過(guò)識(shí)別腫瘤細(xì)胞膜上特定的受體蛋白分子來(lái)實(shí)現(xiàn)，只能檢測(cè)某一種或某一類(lèi)腫瘤7–10。因此，利用腫瘤的獨(dú)特性發(fā)展一種普適性熒光材料檢測(cè)腫瘤非常重要11–13。

腫瘤的微環(huán)境指標(biāo)，如低pH、低氧和高隙間壓力是所有實(shí)體瘤的普遍特征14。低pH的主要原因是腫瘤細(xì)胞葡萄糖攝取率升高而氧化磷酸率降低，從而導(dǎo)致乳酸聚集15–17。腫瘤組織內(nèi)的pH值為6.4–6.8，正常組織的pH值通常在7.0–7.4，因此在pH 6.8左右響應(yīng)的熒光材料適合檢測(cè)腫瘤18–20。傳統(tǒng)pH響應(yīng)的熒光材料多選用染料作為熒光劑，具有較大的毒性，響應(yīng)范圍比較寬，且容易受光漂白影響21–27。

碳量子點(diǎn)(CQDs)作為一種新型的零維碳納米材料，由于低毒性、易于表面修飾、良好的水溶性、抗光漂白性以及優(yōu)異的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物成像、藥物傳遞等方面28–36。我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道了一種pH響應(yīng)的熒光碳量子點(diǎn)(pRF-CQDs)，當(dāng)pH > 6.8時(shí)呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，而pH <6.8時(shí)呈現(xiàn)綠色熒光，但是藍(lán)綠色短波熒光信號(hào)容易受生物體自身背景熒光干擾，因此需要設(shè)計(jì)一種紅色的CQDs用于腫瘤微酸環(huán)境的診斷35。

我們以4-二甲氨基苯酚為前驅(qū)體，采用溶劑熱法合成了一種紅色熒光CQDs (R-CQDs)，RCQDs熒光發(fā)射峰為640 nm，絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率為12.8%，通過(guò)修飾單甲醚聚乙二醇衍生物(MeOPEG-PDPA)，設(shè)計(jì)了pH響應(yīng)紅色熒光CQDs (pRFR-CQDs)37–43。當(dāng)pH < 6.8時(shí)，pRF-R-CQDs的氨基質(zhì)子化呈現(xiàn)紅色熒光，而pH > 6.8時(shí)，pRF-R-CQDs的氨基去質(zhì)子化導(dǎo)致紅色熒光淬滅，因此能夠利用熒光顏色差別區(qū)分出腫瘤組織和正常組織44–46。當(dāng)腫瘤位置處沒(méi)有形成明顯腫塊時(shí)，pRF-R-CQDs能夠檢測(cè)到微酸性腫瘤組織。因此，pRF-R-CQDs在臨床腫瘤診斷方面具有潛在的實(shí)用價(jià)值。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 主要試劑及實(shí)驗(yàn)儀器

4‐二甲氨基苯酚(分析純，阿法埃莎化學(xué)有限公司)、高碘酸鉀(分析純，上海阿拉丁生物科技有限公司)、單甲醚聚乙二醇2000 (分析純，上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司)。

熒光光譜儀(珀金埃爾默股份有限公司，Perkin Elmer-LS55)、紫外可見(jiàn)吸收光譜儀(島津儀器有限公司，UV2450)、透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社，JEM2100)，激光共聚焦熒光顯微鏡(徠卡儀器有限公司，LEICA STP)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司，F(xiàn)ACS Diva)、X射線光電子能譜(賽默飛世爾科技公司，Thermo Scientific)傅里葉變換紅外光譜儀(賽默飛世爾科技公司，Nicolet)、小動(dòng)物活體成像儀(珀金埃爾默儀器有限公司，IVIS Lumina Series)。

2.2 R-CQDs的制備

將20 mg的4-二甲氨基苯酚和60 mg的高碘酸鉀溶解在10 ml的乙醇中，超聲10 min，再將此溶液轉(zhuǎn)移至25 mL的聚四氟乙烯的高壓釜中，置于180 °C的烘箱中反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，將此高壓釜置于室溫下冷卻，在8000 r?min?1下離心10 min，除去不溶性雜質(zhì)后將溶液烘干，在以CH3OH和CH2Cl2為洗脫劑(體積比1 : 25)的硅膠柱中分離后得到R-CQDs。

2.3 絕對(duì)量子產(chǎn)率的測(cè)量

采用配備120 mm積分球的FLR025光譜儀測(cè)量R-CQDs的量子產(chǎn)率。把FLR025光譜儀的測(cè)試光傳送到積分球上，量子點(diǎn)的乙醇溶液放置在石英比色皿中，溶劑乙醇作為空白對(duì)照，測(cè)量R-CQDs的量子產(chǎn)率。

2.4 pRF-R-CQDs的制備

將10 g除水處理過(guò)的MeO-PEG-OH加入250 mL圓底燒瓶中，將圓底燒瓶浸入冰鹽浴中不斷攪拌，并滴加4.3 mL溴代異丁基酰溴，體系在室溫下攪拌反應(yīng)48 h。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去THF，并將100 mL水加入剩余的有機(jī)相中，用二氯甲烷萃取有機(jī)相。對(duì)有機(jī)相依次進(jìn)行洗滌、干燥、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將得到的有機(jī)濃縮體系加入無(wú)水乙醚沉淀，減壓抽濾得到大分子引發(fā)劑(MeO-PEG-Br)。在25 mL圓底燒瓶中加入0.56 g MeO-PEG-Br、14.4 mg催化劑CuBr、2.56 g甲基丙烯酸二異丙基氨基乙酯(DPAMA)和1.42 g R-CQDs。在瓶?jī)?nèi)保持氮?dú)夥諊氯∨?體N,N,N?,N?,N?- 五 甲 基 二 亞 乙 基 三 胺(PMDETA，99%)21 μL加入瓶中，將圓底燒瓶浸入60 °C油浴中反應(yīng)48 h。通過(guò)中性A12O3柱除去催化劑和配體等雜質(zhì)，得到嵌段共聚物(MeO-PEGPDPA)。將R-CQDs、MeO-PEG-PDPA和N-羥基琥珀酰亞胺混合后置于室溫中于黑暗處劇烈攪拌并過(guò)夜反應(yīng)，再將得到的溶液以CH3OH和CH2Cl2為洗脫劑(體積比1 : 20)在硅膠柱中分離，最終得到pRF-R-CQDs。

2.5 細(xì)胞活性檢測(cè)

采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞活性。將三種細(xì)胞懸液接種在96孔板中，培養(yǎng)板置于5% CO2、37 °C下預(yù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)組向每孔加入10 μL不同濃度的pRF-R-CQDs緩沖溶液，空白對(duì)照組每孔加入10 μL生理鹽水，再將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。每孔加入10 μL CCK溶液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，測(cè)定在450 nm處的吸光度值。

2.6 活體成像

活體成像實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為5–6周雌性裸鼠(15–20 g)。在裸鼠右腋下接種腫瘤細(xì)胞，至腫瘤體積達(dá)到約150 mm2進(jìn)行活體成像實(shí)驗(yàn)。荷瘤裸鼠通過(guò)尾靜脈注射100 μL pRF-R-CQDs緩沖溶液(劑量為5 mg?kg?1)。注射后，在不同時(shí)間點(diǎn)采用活體成像儀收集熒光信號(hào)。此外，將注射12 h后的荷瘤裸鼠解剖得到腫瘤、肌肉、腦、腎、腸、脾、肺和心，在活體成像儀下觀察腫瘤、肌肉和不同器官的成像。

2.7 組織成像

將腫瘤和腿部肌肉組織分別放平擺在組織支撐器中，滴入少許包埋劑，迅速置于冷凍臺(tái)中。將冷凍的組織在冷凍切片機(jī)的機(jī)械承器上加緊，轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕，將組織修復(fù)平整，制作冰凍組織切片(厚度：20 μm)。將切好的組織切片轉(zhuǎn)移到載玻片上，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)為561 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 R-CQDs的熒光性質(zhì)

圖1a是R-CQDs水溶液在日光燈和365 nm紫外燈照射下的照片，R-CQDs水溶液發(fā)出明亮的紅色熒光。圖1b是R-CQDs的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖(UV-Vis)及熒光光譜(PL)。在波長(zhǎng)為210 nm處存在明顯的吸收峰，對(duì)應(yīng)于sp2共軛結(jié)構(gòu)的π–π*的躍遷吸收。在波長(zhǎng)為285 nm附近存在一個(gè)較弱吸收峰，對(duì)應(yīng)于C＝O等結(jié)構(gòu)的n–π*躍遷吸收，R-CQDs在545 nm處有特征吸收峰，對(duì)應(yīng)的熒光發(fā)射峰位置為640 nm。圖1c是不同pH下R-CQDs的熒光光譜，熒光強(qiáng)度在pH 6–8范圍內(nèi)無(wú)明顯變化，表明RCQDs的熒光強(qiáng)度在pH 6–8范圍內(nèi)受pH影響較小。在30天的連續(xù)光照下，如圖1d所示，R-CQDs的熒光強(qiáng)度沒(méi)有明顯變化，具有良好的穩(wěn)定性。

圖1 (a)日光燈(左)和紫外燈(右)照射下的R-CQDs水溶液，(b)R-CQDs的UV-Vis和PL光譜圖，(c)R-CQDs在不同pH下的PL光譜(激發(fā)波長(zhǎng)540 nm)，(d)R-CQDs的熒光穩(wěn)定性Fig. 1 (a)The photographs of R-CQDs aqueous solution under visible light and UV light, (b)UV-Vis absorption and PL spectra of R-CQDs, (c)PL spectra of R-CQDs at different pH, (d)Photostabilities of R-CQDs.

3.2 R-CQDs的形貌與結(jié)構(gòu)表征

透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果表明R-CQDs的尺寸大小約為4 nm (圖2a)，高分辨透射電鏡(右上插圖)結(jié)果顯示，R-CQDs的晶格間距為0.21 nm，對(duì)應(yīng)于石墨烯(100)晶面的衍射。X射線光電子能譜(XPS)如圖2b–d所示，R-CQDs主要由C、N、O三種元素組成，原子百分比分別為85.77%、4.32%、9.91%。R-CQDs的C 1s譜圖中主要有284.8 eV一個(gè)比較強(qiáng)的峰，對(duì)應(yīng)于石墨類(lèi)sp2雜化C原子(C＝C)的結(jié)合能。另外在285.8、286.4和287.8 eV處還有三個(gè)較弱的峰，分別對(duì)應(yīng)于C―N、C―O和C＝O的結(jié)合能。R-CQDs的N 1s峰位置分別位于399和400.6 eV，分別對(duì)應(yīng)于氨基氮和石墨化氮。在傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜中(圖2e)，1065、1405、1640和3456 cm?1的峰分別對(duì)應(yīng)于C―N、C＝C、C＝O和O―H的伸縮振動(dòng)。拉曼(Raman)光譜圖(圖2f)中可以看到R-CQDs在1340和1585 cm?1處分別出現(xiàn)石墨烯特有的D峰和G峰，ID/IG值約為0.81，表明R-CQDs結(jié)晶性良好，缺陷較少。圖2g是R-CQDs的X射線衍射(XRD)圖，在23°左右出現(xiàn)一個(gè)弱而寬化的衍射峰，對(duì)應(yīng)石墨(002)晶面間距。以上結(jié)構(gòu)表征結(jié)果表明，R-CQDs表面含有大量的羰基和羥基，氮元素主要以石墨氮的形式存在，由此推斷RCQDs的結(jié)構(gòu)示意圖(圖2h)。

圖2 R-CQDs的(a)TEM圖，(b–d)XPS圖，(e)FT-IR光譜圖，(f)Raman光譜圖，(g)XRD圖譜，(h)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 2 (a)TEM images, (b–d)XPS analysis, (e)FT-IR spectra, (f)Raman spectrum, (g)XRD spectrum,(h)structure diagram of R-CQDs.

3.3 pRF-R-CQDs的熒光性質(zhì)

圖3a為pRF-R-CQDs的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3b是365 nm紫外燈激發(fā)下不同pH值的pRF-R-CQDs緩沖溶液外觀圖，當(dāng)pH < 6.8時(shí)溶液呈現(xiàn)紅色熒光，當(dāng)pH > 6.8時(shí)溶液熒光淬滅。不同pH值下熒光光譜圖(圖3c)顯示，pRF-R-CQDs溶液在pH > 6.8時(shí)熒光基本淬滅。當(dāng)pH < 6.8時(shí)，且其熒光強(qiáng)度明顯增高，pH 6.5時(shí)熒光最強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)酸堿滴定的方法確定了pRF-R-CQDs的pKa值，圖3d是酸堿滴定曲線，計(jì)算了pRF-R-CQDs的pKa約等于6.76，非常接近于熒光突變點(diǎn)6.8。圖3e是不同pH值下pRF-R-CQDs的TEM照片，當(dāng)pH > 6.8時(shí)pRF-R-CQDs的氨基去質(zhì)子化呈現(xiàn)膠束狀，當(dāng)pH < 6.8時(shí)pRF-R-CQDs的氨基質(zhì)子化呈現(xiàn)膠束解離狀。

圖3 (a)pRF-R-CQDs的分子結(jié)構(gòu)，(b)不同pH條件下pRF-R-CQDs在紫外燈(365 nm)照射下的照片，(c)不同pH下pRF-R-CQDs的熒光光譜(激發(fā)波長(zhǎng)540 nm)，(d)pRF-R-CQDs的酸堿滴定曲線，(e)不同pH條件下pRF-R-CQDs的TEM圖Fig. 3 (a)Structure diagram of pRF-R-CQDs. (b)Photographs showing fluorescence under UV light (excited at 365 nm)of the pRF-R-CQDs at different pH values. (c)Fluorescence spectra excited at 540 nm of pRF-R-CQDs at different pH values. (d)Potentiometric titration curves of pRF-R-CQDs. (e)TEM images of pRF-R-CQDs at different pH.

3.4 pRF-R-CQDs用于腫瘤組織檢測(cè)

將pRF-R-CQDs分別皮下注射至四種荷瘤裸鼠(腫瘤類(lèi)型分別為HepG2、PANC-1、HCT116和A549)的腫瘤和腿部肌肉處，12 h之后將腫瘤和腿部肌肉取出，冷凍切片后放置于激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。如圖4所示，四種腫瘤組織相對(duì)于正常組織即腿部肌肉組織密而細(xì)，并且發(fā)出明亮的紅色熒光，而腿部肌肉組織未呈現(xiàn)熒光。結(jié)果表明pRF-R-CQDs可以避開(kāi)生物自身熒光的干擾，利用腫瘤微酸性區(qū)分出正常組織和腫瘤組織。

圖4 pRF-R-CQDs分別皮下注射至HepG2、PANC-1、HCT116和A549荷瘤裸鼠的腫瘤和腿部肌肉處，12 h之后腫瘤組織冷凍切片(左二)和腿部肌肉組織冷凍切片(右二)的激光共聚焦熒光顯微鏡照片及相應(yīng)的明場(chǎng)照片(標(biāo)尺：24 μm)Fig. 4 Representative confocal microscopy images of indicated tumors in red fluorescence channel and white field(left two panels)and muscles in red fluorescence channel and white field (right two panels). Scale bars: 24 μm.

3.5 pRF-R-CQDs用于腫瘤診斷

將pRF-R-CQDs緩沖溶液通過(guò)尾靜脈注射至HeLa荷瘤裸鼠體內(nèi)，注射后選用活體成像儀收集熒光信號(hào)。圖5a為pRF-R-CQDs注射后不同時(shí)間點(diǎn)的活體成像圖。從圖中可以觀察到，注射2 h后，在腫瘤處觀察到微弱的紅色熒光信號(hào)，說(shuō)明pRFR-CQDs在參與裸鼠血液循環(huán)中能夠識(shí)別微酸性環(huán)境。由于腫瘤的被動(dòng)靶向性，pRF-R-CQDs在腫瘤處聚集，其熒光信號(hào)隨時(shí)間增強(qiáng)。24 h后裸鼠腫瘤處的熒光信號(hào)明顯減弱，表明pRF-R-CQDs在裸鼠體內(nèi)逐漸被代謝排出體外。解剖得到的主要器官熒光成像結(jié)果如圖5b所示，由于失調(diào)的糖酵解引起腫瘤細(xì)胞間呈現(xiàn)微酸環(huán)境，所以pRF-R-CQDs在腫瘤處顯示紅色熒光，即pRF-R-CQDs可以應(yīng)用于腫瘤的診斷。

圖5 (a)荷瘤裸鼠通過(guò)尾靜脈注射pRF-R-CQDs (5 mg?kg-1)后不同時(shí)間的活體成像圖，(b)12 h后解剖得到腫瘤、肌肉和各個(gè)器官的熒光成像圖，(c)裸鼠接種腫瘤后，不同時(shí)間尾靜脈注射pRF-R-CQDs后的活體成像圖Fig. 5 (a)Representative images of a HeLa tumor-bearing mouse at the indicated time points after intravenous injection of pRF-R-CQDs (5 mg?kg?1). (b)Imaging of tumor, muscle, major organs from a mouse treated with pRF-R-CQDs.(c)After tumor inoculation, mice were intravenously administered pRF-R-CQDs solution at a dose of 5 mg?kg?1 every days. Twelve hours after each injection, mice were imaged.

將含1 × 106個(gè)細(xì)胞(0.1 mL)的HeLa細(xì)胞懸液皮下注射到裸鼠右側(cè)腋窩。接種后每天將pRF-RCQDs緩沖溶液尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，12 h后進(jìn)行活體成像，重復(fù)觀察10天。從圖5c中可以看出，HeLa細(xì)胞植入裸鼠體內(nèi)第3天時(shí)，可以觀察到裸鼠的右腋出現(xiàn)微弱的熒光信號(hào)，而此時(shí)對(duì)應(yīng)的灰度圖中沒(méi)有明顯的腫塊，第8天時(shí)該位置出現(xiàn)明顯的凸起，有微小的腫塊長(zhǎng)成，熒光信號(hào)比較明顯。隨著HeLa細(xì)胞植入天數(shù)的逐漸增加，腫瘤繼續(xù)增大，同時(shí)腫瘤的熒光信號(hào)也逐漸增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)腫瘤位置處產(chǎn)生微酸環(huán)境并沒(méi)有形成明顯的腫塊時(shí)，pRF-R-CQDs可以顯示熒光信號(hào)，有助于實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷。

圖6 (a)HeLa細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞和HUVEC與不同濃度pRF-R-CQDs溶液作用后的細(xì)胞活性圖，(b)主要器官蘇木精-伊紅染色切片(標(biāo)尺：40 μm)Fig. 6 (a)Cytotoxicity of pRF-R-CQDs on indicated cells. (b)Representative images of indicated tissues with H&E staining, Scale bars: 40 μm.

3.6 pRF-R-CQDs的毒性測(cè)試

評(píng)估了pRF-R-CQDs對(duì)三組細(xì)胞的毒性，其中HeLa與MCF-7為腫瘤細(xì)胞，HUVEC (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)來(lái)自正常組織。將一系列不同濃度pRF-RCQDs依次添加到細(xì)胞中，24 h后測(cè)定細(xì)胞活力。圖6a表明pRF-R-CQDs在濃度高達(dá)100 μg?mL?1時(shí)不表現(xiàn)出明顯的毒性。進(jìn)一步研究pRF-R-CQDs對(duì)活體動(dòng)物的毒性。給健康小鼠每隔一天尾靜脈注射pRF-R-CQDs，在第15天取出腦、心、肝、脾、肺、腎等主要器官，并切取后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色圖6b，與對(duì)照組相比，pRF-R-CQDs處理過(guò)的小鼠的主要器官中均未出現(xiàn)明顯的毒性。結(jié)果表明pRFR-CQDs在臨床癌癥診斷方面具有較大的潛能。

4 結(jié)論

合成了一種紅色熒光碳量子點(diǎn)R-CQDs，并將MeO-PEG-PDPA修飾到其表面，制備了一種pH 6.8響應(yīng)熒光碳量子點(diǎn)(pRF-R-CQDs)。當(dāng)pH值小于6.8時(shí)呈現(xiàn)紅色熒光，當(dāng)pH值大于6.8時(shí)其熒光淬滅，能夠?qū)崿F(xiàn)腫瘤的診斷。由于pRF-R-CQDs能夠區(qū)分腫瘤和正常組織，具有低毒性以及對(duì)腫瘤的高特異性和敏感性等特點(diǎn)，因此在腫瘤早期診斷方面有廣泛的應(yīng)用前景。此外，通過(guò)本研究中描述的方法可能合成近紅外波長(zhǎng)的熒光碳量子點(diǎn)用于腫瘤診斷。