感染非洲豬瘟強(qiáng)毒株和弱毒株的野豬排毒方式的差異

張文志，劉 金（編譯）

（內(nèi)蒙古烏蘭察布市商都縣畜牧業(yè)服務(wù)中心，內(nèi)蒙 烏蘭察布 013450）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是發(fā)生在家豬和野豬身上的一種病毒性出血性疾病。ASF臨床癥狀廣泛，其中以高熱、厭食、嗜睡和全身出血為特征，大多數(shù)情況下，在家豬和歐亞野豬（Sus scrofa）中幾乎100%致死。非洲豬瘟病毒（ASFV）在撒哈拉沙漠以南及沿外高加索地區(qū)的一些國家流行。ASFV基因II型自2007年開始在東歐流行，2014年傳播到歐盟，2018年又傳播到亞洲。ASFV在亞洲國家已顯示出迅速和廣泛的傳播能力，引起了許多非洲豬瘟暴發(fā)，給受感染的國家?guī)砹藝?yán)重的社會經(jīng)濟(jì)影響。一旦感染蔓延到某個國家，后果是毀滅性的，因?yàn)槠洳粌H對動物健康產(chǎn)生重大影響，而且宰殺感染動物和接觸動物以及貿(mào)易限制會造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，研發(fā)一種安全有效的ASF疫苗是全球的當(dāng)務(wù)之急。

對從天然存在的低毒力ASF株（OURT88/3或NH/P68）獲得的減毒活疫苗（LAVs）研究顯示，有希望在家豬中對抗同源病毒，并對異源毒株有部分的交叉保護(hù)作用。LAV另一個候選毒株為Lv17/WB/Riel，其在家豬和野豬體內(nèi)提供了超過92%的保護(hù)率以抵抗ASFV強(qiáng)毒株Arm07的攻擊。然而，實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，這些候選疫苗存在許多安全性和有效性方面的問題，這源自它們固有的傳染性，如弱毒活病毒的排毒，毒力恢復(fù)，或野毒株與弱毒株或其他毒株之間的重組等。

ASFV一般通過健康動物與感染動物直接接觸或接觸感染動物的排泄物和分泌物的方式傳播。間接傳播也可發(fā)生，比如攝入受污染的肉類或接觸各種污染物，ASFV在污染物中也長期具有感染性。在這方面，排毒途徑和強(qiáng)度決定了病原體通過直接和間接接觸傳播的概率。因此，有必要評估不同ASFV分離株的排毒模式，特別是在主要的野生宿主中，這其中合適的監(jiān)測和疾病控制方案更為復(fù)雜，如當(dāng)前ASF流行中的野豬的情況。在過去的35年里，從西歐到東亞，野豬的數(shù)量經(jīng)歷了前所未有的增長。這種增長趨勢伴隨著直接和間接接觸、病原傳播和分布范圍的增加。這些流行病學(xué)變化也可能增加ASFV在野豬和家豬間的傳播風(fēng)險(xiǎn)。

以往對野豬高毒力毒株的感染研究表明，潛伏期2～6 d后，開始出現(xiàn)排毒。在中度和低毒力毒株的情況下，潛伏期從1～7 d不等，并且在某些情況下，感染低毒力毒株動物的排泄物保持感染性超過70 d。因此，這些排泄物可能在環(huán)境中散播，并成為感染源。在ASFV所有可能的排毒途徑中，口咽似乎是最常見的途徑，然而直腸液體也會有很大的風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)槭芨腥镜呢i可能會發(fā)生出血性腸炎，從而導(dǎo)致它們通過糞便排出有高度感染性的血液。野豬中另一個重要的傳播途徑是它們的血液，因?yàn)橐柏i經(jīng)常打架和同類相食。此外，另外幾種途徑，如鼻腔、眼部和陰道途徑，已經(jīng)被證明具有持續(xù)的較低的滴度。正是由于這個原因，本研究選擇血液、唾液和糞便作為排毒途徑進(jìn)行研究。

文章研究了ASFV弱毒株Lv17/WB/Riel的排毒模式，以評估其作為野豬候選疫苗的潛力。在做先前發(fā)表過的兩個研究（其中一個研究中野豬經(jīng)口接種Lv17/WB/Rie1 ASFV毒株，另一個研究中野豬經(jīng)肌肉接種Arm07 ASFV強(qiáng)毒毒株）時(shí)，收集血液、口腔拭子和糞便來研究ASFV的存活及排毒模式。這一信息有助于判斷人為排放到環(huán)境中的弱毒株的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并與強(qiáng)野毒株進(jìn)行比較，此外將補(bǔ)充先前Barasona和Rodríguez-Bertos 等 的研究。

1 材料和方法

1.1 ASFV毒株

將弱毒的、非血液吸附的、p72基 因II型ASFV Lv17/WB/Riel毒株作為免疫用途。該毒株以前曾在家豬和野豬中進(jìn)行過保護(hù)試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了該分離株的巨大潛力，顯示了對野豬高毒力病毒攻擊的高水平保護(hù)（92%）。該病毒在豬血單核細(xì)胞（PBM）中生長7 d，并如前面所述收集。病毒滴度定義為引起感染培養(yǎng)物中50%細(xì)胞病變的病毒量（TCID50/mL），病變通過使用免疫過氧化物酶染色進(jìn)行評估。

血液吸附p72基因II型Armenia07毒株作為強(qiáng)毒株野毒用途。曾報(bào)道，該分離株為野豬中的一種高毒力ASFV ，引起疾病的急性快速進(jìn)展。如前所述，病毒在PBM中繁殖。病毒滴度定義為引起感染培養(yǎng)物中50%紅細(xì)胞吸附的病毒量（HAD50/mL或TCID50/mL）。

1.2 動物

總共評估了29頭動物，這些動物來源于之前的2個獨(dú)立試驗(yàn)。所有這些動物都是從西班牙埃斯特雷馬杜拉的一個商業(yè)野豬養(yǎng)殖場獲得的3~4個月大，體重 10~15 kg的雌性野豬仔豬。試驗(yàn)在馬德里康普斯頓大學(xué)VISAVET中心，生物安全3級的條件下進(jìn)行。試驗(yàn)開始前2周對動物進(jìn)行馴化。在馴化階段，使用土霉素和伊維菌素對野豬進(jìn)行處理，以清除寄生蟲和控制不明顯的細(xì)菌感染。這些野豬仔豬未接種疫苗，對該地區(qū)下列主要豬病原體檢測呈陰性：偽狂犬病毒，牛分枝桿菌，肺炎支原體，豬圓環(huán)病毒2型。動物飼養(yǎng)管理和試驗(yàn)方法參照歐洲、國家、地區(qū)試驗(yàn)規(guī)程進(jìn)行，并受馬德里社區(qū)道德委員會的監(jiān)督和批準(zhǔn)（參照PROEX 124/18和004/18）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

如前所述，在本研究中所分析的血液、唾液和糞便樣品是從先前2個獨(dú)立試驗(yàn)中獲得的。

在第1個試驗(yàn)中，9頭野豬口服感染104TCID50的弱毒LV17/WB/Riel ASFV分離株，3頭幼齡野豬與這些口服接種的動物直接接觸（n=12）。由于病毒DNA在排毒途徑中的高度相關(guān)性和感染途徑（口和直接接觸）的生物學(xué)相似性，將9頭口服感染和3頭接觸感染的野豬設(shè)置為一組，并命名為弱毒組。此試驗(yàn)中與本研究相關(guān)的試驗(yàn)期內(nèi)，接種持續(xù)了30 d。

在第2個試驗(yàn)中，6頭野豬肌注10 HAD50Arm07 ASFV強(qiáng)毒株，其余11頭野豬與這些肌肉接種的動物直接接觸（n=17）。沒有動物在感染后存活下來。由于肌肉接種和接觸感染的動物在臨床癥狀、病理表現(xiàn)和組織中病毒存在方面并無差異，將6頭肌肉接種的野豬和11頭直接接觸的野豬歸為一組，命名為強(qiáng) 毒 組。在Rodríguez-Bertos等 人的描述中，他們的研究持續(xù)了15 d。（圖1）。

圖1 試驗(yàn)安排和試驗(yàn)分組的示意圖

1.4 取樣和ASFV DNA檢測

2個試驗(yàn)的所有動物每周單獨(dú)取樣2次，在研究期間的最后1 d取樣1次。每頭野豬在采樣和連續(xù)采樣之間都被從圍欄中轉(zhuǎn)出，為避免交叉感染所有采樣所用的材料物品都進(jìn)行消毒。從瞬膜后眼內(nèi)角的眼竇和海綿竇采集血液并用乙二胺四乙酸（EDTA）保存，采樣后立即進(jìn)行處理。用棉簽采集唾液和糞便，在檢測之前保存在-80 ℃環(huán)境中。陰性對照樣品在第0天采集。

按使用說明，應(yīng)用高純預(yù)制模板混合試劑盒（High Pure Template Preparation Mix Kit ，羅 氏 診斷）提取DNA。用King等人先前報(bào)道的TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）方法檢測不同排毒途徑的ASFV DNA。唾液和糞便也使用UPL qPCR技術(shù)以分析其中ASFV DNA的存在。qPCR結(jié)果 判 定依靠循環(huán)閾值（Ct），40個循環(huán)以內(nèi)指示熒光出現(xiàn)在背景之上判定為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 25進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。使用單因素方差分析比較組間qPCR Ct值和不同排毒模式下qPCR檢測陽性動物數(shù)量。使用曼-惠特尼U檢驗(yàn)（Mann–Whitney U）比較兩組間不同病毒接種途徑之間以及血液、唾液和糞便的qPCR陽性結(jié)果開始出現(xiàn)的時(shí)間。P＜ 0.05時(shí)視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

所有強(qiáng)毒組的動物在感染后（4±1） d出現(xiàn)了與ASFV感染相一致的臨床癥狀，在感染（10±3） d死亡。主要臨床癥狀有高燒、嗜睡、厭食。一些動物出現(xiàn)輕微的紅疹，眼部和鼻腔有分泌物，輕度行走困難，呼吸頻率增加。Rodríguez-Bertos等人先前詳細(xì)介紹了這些觀察結(jié)果。

然而，弱毒組的動物沒有出現(xiàn)任何ASF的臨床癥狀。本組監(jiān)測到的僅有的臨床癥狀是12頭動物中有8頭（66.66%）出現(xiàn)了輕微的體溫升高，持續(xù)3.5 d（接種后4~24 d）。

2.2 接種與接觸感染

共分析了592份血液、唾液和糞便個體相應(yīng)的樣本，其中361份來自弱毒組，231份來自強(qiáng)毒組。2個獨(dú)立試驗(yàn)中所有接種和接觸動物均成功感染。在組內(nèi)，病毒接種途徑并未影響接種（口服或肌注）和接觸感染動物在qPCR檢測時(shí)的Ct值(曼-惠特尼U檢驗(yàn)，P＜ 0.05)。

強(qiáng)毒組，所有動物血液樣本的qPCR檢測均呈陽性，而在弱毒組12頭動物中只有8頭qPCR檢測陽性（見表1）。兩組間血液樣本qPCR檢測陽性的動物頭數(shù)具有顯著差異（見表1，單因素方差分析，F(xiàn) = 37.20，P＜ 0.05）。研究觀察到唾液樣本中類似的ASFV DNA陽性頭數(shù)。然而糞便樣本陽性頭數(shù)，強(qiáng)毒組高于弱毒組（曼-惠特尼U檢驗(yàn)，Z = -3.85，P＜ 0.05）。

表1 ASFV DNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果 陽性率（%）

2.3 ASFV基因組檢測和不同途徑排毒的起始時(shí)間

在強(qiáng)毒組的血液中檢測到了最高排毒水平（肌注感染Ct=27.91±8.70；接觸感染Ct= 31.05±9.30），病 毒 血 癥 在感染12 d后達(dá)到峰值（接觸感染Ct=16.32±0.68）。弱毒組血液樣本呈間歇性的高Ct值的qPCR陽性結(jié)果（口服感染Ct=39.32±2.64；接觸感染Ct=38.87±2.51）（圖2）。組間血液qPCR Ct值差異顯著 （見表2；單因素方差分析，F(xiàn) = 36.13，P＜ 0.05）。弱毒組僅有11%的血液樣本檢測呈陽性（圖3）。糞便中，ASFV DNA偶爾被檢測到。兩組間唾液樣本檢出數(shù)無顯著差異（圖3）。然而，兩組間唾液和糞便qPCR Ct值存在顯著差異（表2；圖2；單因素方差分析，F(xiàn)=19.92；F=36.06；P＜ 0.05）。

圖3 ASFV DNA實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)檢測結(jié)果

表2 ASFV DNA實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果

在兩組中，接觸感染與直接接種相比較，其檢測到病毒開始排出的時(shí)間只有輕微的延遲。強(qiáng)毒組動物比弱毒組動物早開始排毒。在ASFV DNA檢測的第1天，來自強(qiáng)毒組的至少1頭動物在感染后3 d的血液、唾液和糞便中結(jié)果呈陽性。然而，弱毒組不僅在開始排毒的時(shí)間上不同，在排毒途徑上也有很大差異。弱毒株初次被檢測到的時(shí)間，在唾液、血液和糞便中分別為感染后10 d、14 d和21 d。在血液、唾液和糞便中第1次檢測到ASFV基因組，兩組間存在顯著差異（曼-惠特尼 U 檢驗(yàn)；分別為Z=-4.35，Z =-3.91,和Z =-3.77，P＜ 0.05）。此外，強(qiáng)毒組ASFV基因組檢測結(jié)果在整個采樣周期恒定不變（從被檢出到動物死亡或施行安樂死）。

3 討論

本研究目的是通過與非洲豬瘟強(qiáng)毒株Arm07在野豬身上的排毒模式相比較，進(jìn)一步評估非洲豬瘟病毒分離毒株Lv17/WB/Rie1作為一種候選疫苗的安全性。通過試驗(yàn)結(jié)果可以觀察到弱毒株組與強(qiáng)毒株組的野豬排毒模式有顯著差異?？偟膩碚f，與強(qiáng)毒株組相比，弱毒株組的動物在血液、唾液和糞便中的非洲豬瘟分離弱毒株基因組陽性率較低。此外，與強(qiáng)毒株組比，弱毒株組開始排毒的時(shí)間較晚，Ct值較高（39以上）。由以上可以說明，弱毒株的排毒量很小，或者說是殘留的病毒DNA。

有趣的是，在弱毒株組中，唾液檢出的病毒量要稍高于其他排毒途徑（見圖2）。而且，唾液中病毒留存時(shí)間要長于血液和糞便。這表明經(jīng)口感染弱毒株的動物，會在扁桃體和淋巴結(jié)入口處控制其局部感染，而不會通過病毒血癥造成全身傳播。有研究表明，唾液中潛在的抑制劑可能會降低ASFV在口腔液中的存活率。這就可能是我們能夠在口腔液中檢測出ASFV，但是豬既不會表現(xiàn)出臨床癥狀也不會出現(xiàn)病毒血癥的原因。另一個原因可能是這些動物在兩次試驗(yàn)中都被放置在受污染的環(huán)境中，因此，出現(xiàn)了反復(fù)感染，但是受到了某種因素保護(hù)，可以控制病毒在口腔內(nèi)的復(fù)制。所有這些都表明，盡管弱毒株組的主要排毒途徑是唾液，但在試驗(yàn)條件下，這種情況可能被高估了。這些觀察結(jié)果連同之前的研究結(jié)果，支持了研究唾液在ASFV感染途徑時(shí)的重要性，這可能是一種有效的以無創(chuàng)方式檢測個體或環(huán)境病毒的方案。

圖2 ASFV排毒水平檢測結(jié)果

在強(qiáng)毒株組，糞便樣本只有29%的呈陽性，弱毒株組更低，僅僅7%。這種結(jié)果可以由我們沒有在強(qiáng)毒株組或弱毒株組中觀察到出血性腸炎來解釋，根據(jù)McVicar的研究表明，腸道出血是通過糞便排出病毒的最可能的原因。本次試驗(yàn)結(jié)果與我們另一個研究結(jié)果相似，另一個研究中僅有8.7%的動物糞便呈陽性。此外，之前的研究發(fā)現(xiàn)，從直腸樣本中分離ASFV很少出現(xiàn)陽性結(jié)果。通過動物糞便排出的ASFV是有限的，但在高致病毒株感染的急性期更為重要。非洲豬瘟弱毒株病毒即使是經(jīng)口腔接種的野豬，也很少會通過糞便排泄出來。

血液在傳統(tǒng)思想上是ASFV主要的傳播途徑，因?yàn)楸桓腥緞游镅簝?nèi)的病毒載量很高。野豬交配爭斗、捕獵和食腐的行為，使血液傳播成為其最主要的途徑。有意思的是，我們在弱毒株組內(nèi)血液樣本中僅發(fā)現(xiàn)了少量ASFV呈陽性的樣本。此外，該組病毒血液含量為間歇性的，且Ct值較高（經(jīng)口感染39.32±2.64），強(qiáng)毒株組陽性血樣數(shù)量較多，且血液中病毒含量較高（經(jīng)肌肉注射Ct值27.91±8.7），這與收集的陽性排泄物具有高度相關(guān)性。這些結(jié)果表明，低毒株與高毒株相比血液傳播風(fēng)險(xiǎn)低得多，這是其作為候選疫苗的一個有價(jià)值的特征。

在本研究中，病毒分離可以作為揭示ASFV排毒模式的一種補(bǔ)充技術(shù)。然而現(xiàn)有的病毒分離技術(shù)和既定程序?qū)σ柏i樣本不可能達(dá)到令人滿意的結(jié)果。檢測ASFV活性的方法包括病毒分離技術(shù)和外周血單核細(xì)胞的紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)。此外，這些試驗(yàn)已經(jīng)通過野豬體內(nèi)外周血單核細(xì)胞進(jìn)行了評估，以提高靈敏度。然而，這兩種檢測方法在被用于檢測野豬排泄物時(shí)均出現(xiàn)了誤差。一些研究者認(rèn)為，很難從野豬樣本中分離ASFV可能是由于樣本的質(zhì)量差，然而我們的研究結(jié)果顯示高品質(zhì)的野豬樣品并沒有提高分離ASFV的成功率。在未來的工作中，應(yīng)該解決這兩種檢測方法在野豬樣本中敏感性低的問題。

在潛伏期方面，我們的研究結(jié)果與其他以家豬為對象的研究結(jié)果略有不同。有一項(xiàng)研究表明，對豬進(jìn)行肌肉接種Georgia 2007/1，ASFV在血液、唾液和糞便中潛伏期為5 d。在另外一個研究中，使用文獻(xiàn)中描述的3種不同毒株，也得到相似的結(jié)果。在本研究中，強(qiáng)毒組內(nèi)，我們首次檢測到每頭動物的血液、唾液和糞便中出現(xiàn)ASFV，是在感染后第3天。但是經(jīng)肌肉接種的平均數(shù)據(jù)，唾液是感染后第5天，血液和糞便是感染后第8天。其原因可能是我們使用了較低的感染劑量和不同毒力的ASFV分離株所導(dǎo)致。

盡管在感染弱毒和強(qiáng)毒株的動物之間觀察到了明顯的差異，但有重要的一點(diǎn)是，兩組是通過不同的感染途徑感染的，這可能會影響到結(jié)果。然而，目前的研究沒有表明肌肉接種或接觸感染動物ASFV排毒模式在qPCR的Ct值上具有顯著差異。此外，除了接觸感染動物有稍微延遲外，弱毒組經(jīng)口感染和接觸感染的動物在排毒模式?jīng)]有顯著差異。這在生物學(xué)上講得通，因?yàn)榻佑|感染類似于自然感染，口服感染也一樣。這些觀察結(jié)果是根據(jù)其他研究得出的，在這些研究中，自然感染的豬在不同排毒途徑上與接種感染的豬結(jié)果相似。然而，毒株的毒力和接種劑量對開始排毒的時(shí)間和其動態(tài)有顯著影響。接種高致病力毒株的豬會出現(xiàn)典型的亞急性癥狀。盡管存在很嚴(yán)重的病毒血癥，但通過其他途徑排毒的情況很少。

重要的是，我們不僅要考慮感染弱毒或強(qiáng)毒毒株的動物其排泄物的病毒水平，而且還要評估這些排泄物對環(huán)境的污染情況。環(huán)境污染在動物反復(fù)感染周期中起很重要的作用，因?yàn)閯游飼掷m(xù)接觸到來自于排泄物的低劑量的病毒。以往的研究證實(shí)，被感染豬只的排泄物污染的飼料及墊料(稻草)，可能會使健康豬只受到傳染。事實(shí)上，病毒污染的環(huán)境使健康豬只被感染只需要很短的時(shí)間，或許僅需1 d。然而，另有一項(xiàng)研究證明，ASFV在感染了Georgia2007/1毒株的豬只排出的糞便中和尿中，21 ℃環(huán)境時(shí)，存活時(shí)間分別長達(dá)3 d和5 d。因此，需要更多的研究來評估環(huán)境污染和野豬種群中不同病毒分離物的感染動力學(xué)。

弱毒疫苗是目前防控非洲豬瘟最有潛力和希望的，包括基因缺失疫苗。這個關(guān)于不同非洲豬瘟病毒毒株排毒模式的研究最有意義的是弱毒分離株誘導(dǎo)高抗體應(yīng)答和保護(hù)接種疫苗的動物對抗高致病力的ASFV II型感染。另外，弱毒毒株的低排毒能力，在疫苗候選毒株NH/P68上也表現(xiàn)相同，這有助于擴(kuò)大接種范圍，因此能降低生產(chǎn)成本，降低大規(guī)模野豬接種的必要。本研究不僅證明弱毒毒株 Lv17/WB/Rie1作為疫苗候選株對于接種和接觸野豬的有效性和安全性，而且表明感染動物的有限排毒量對環(huán)境也相對安全。歐盟和一些東歐國家目前的情況表明，野豬是受感染最嚴(yán)重的宿主，因此野豬在ASFV的傳播和攜帶中具有重要影響。我們的研究提供了一些關(guān)于弱毒毒株的排毒模式，比如Lv17/WB/Rie1，它是一種在野豬群體上對抗ASFV的很有希望的候選疫苗。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究為研究野豬的非洲豬瘟病毒排毒模式提供了有價(jià)值的信息。一般來說，相比于感染強(qiáng)毒株Armenia07，感染弱毒株Lv17/WB/Rie1的野豬在血液、唾液和糞便中檢測呈陽性的比例較少。唾液是感染非洲豬瘟弱毒株動物的主要排毒途徑，病毒血癥是間歇性的，且Ct值較高。無論是強(qiáng)毒株組還是弱毒株組，通過糞便排毒的比例都很少。這些研究有助于評估對野豬群體的新的非洲豬瘟疫苗候選苗的排毒模式，包括與目前最有應(yīng)用前景的基因缺失活疫苗進(jìn)行比較。

原文信息：

題目：Distinct African Swine Fever Virus Shedding in Wild Boar Infected with Virulent and Attenuated Isolates；

鏈接：https://www.mdpi.com/2076-393X/8/4/767/htm；

作者：Aleksandra Kosowska,Estefanía Cadenas-Fernández,Sandra Barroso,et al.