九味楮實顆粒對SD雌鼠中樞性性早熟的體質(zhì)量及性激素水平的影響

黃艷霞 劉建忠 張雪榮

〔摘要〕 目的 應(yīng)用N-甲基-DL-天冬氨酸（NMA）構(gòu)建SD雌性大鼠中樞性性早熟模型，并探討九味楮實顆粒對雌性真性性早熟大鼠體質(zhì)量及垂體分泌的卵泡刺激素（follicule-stimulating hormone， FSH）、促黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、雌二醇（estradiol， E2）水平的影響。方法 選取48只26日齡SD雌鼠隨機(jī)分對照組、模型組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組8只。除對照組外，其余組均采用NMA方法建立性早熟動物模型，中藥組、西藥組分別予九味楮實顆粒、戈那瑞林干預(yù)，對照組和模型組給予等體積的生理鹽水干預(yù)，每日觀察陰道口開放情況，每間隔2 d測一次體質(zhì)量，計算各組大鼠臟器系數(shù)（子宮、卵巢及雙側(cè)乳腺），采用ELISA檢測血清FSH、LH、E2水平。結(jié)果 與對照組比較，模型組大鼠陰道口開放時間提前（P<0.05）;大鼠在出生后26、29、32 d體質(zhì)量無明顯變化（P>0.05）;子宮系數(shù)升高（P<0.05）;血清LH、FSH水平明顯增加（P<0.05）。與模型組比較，西藥組、中藥各劑量組大鼠陰道口開放時間明顯延遲（P<0.05）;中藥高劑量組大鼠在出生后35、38 d體質(zhì)量明顯降低（P<0.05）;西藥組、中藥中劑量組大鼠子宮系數(shù)降低（P<0.05）;西藥組、中藥中劑量組大鼠卵巢系數(shù)及雙側(cè)乳腺系數(shù)無明顯變化（P>0.05）;西藥組、中藥高劑量組、中劑量組的血清LH、FSH、E2水平明顯降低（P<0.05）。與中藥低劑量組比較，中藥高中劑量組的血清LH、FSH、E2水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)論 九味楮實顆粒可抑制NMA誘發(fā)雌鼠性早熟的發(fā)生，同時能降低性早熟模型大鼠的血清LH、FSH、E2的水平，推測九味楮實顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸起到抑制性早熟的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 性早熟;九味楮實顆粒;N-甲基-DL-天冬氨酸;體質(zhì)量;性激素;大鼠

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2021.10.010

Effect of Jiuwei Chushi Granule on Body Mass and Sex Hormone Levels of Central

Precocious Puberty in SD Female Rats

HUANG Yanxia1， LIU Jianzhong1，2*， ZHANG Xuerong1，2

（1. Hubei University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430065， China; 2. The Affiliated Hospital of Hubei

University of Chinese Medicine， Wuhan， Hubei 430061， China）

〔Abstract〕 Objective To construct a SD female rat model of central precocious puberty with N-methyl-DL-aspartate （NMA）， and to explore the effect of Jiuwei Chushi Granule on the body mass and the levels of follicle-stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and estradiol （E2） secreted by pituitary gland. Methods 48 female SD rats at 26 days of age were randomly divided into control group， model group， western medicine group， high dose Chinese medicine group， medium dose Chinese medicine group and low dose Chinese medicine group， with 8 rats in each group. Except for the control group， the animal model of precocious puberty was established by NMA method in other groups. The Chinese medicine group and western medicine group were given Jiuwei Chushi Granule and gonadorelin intervention respectively. The control group and model group were given equal volume of normal saline intervention. The vaginal opening was observed daily， and the body weight was measured every two days. Organ coefficients （uterus， ovary and bilateral mammary gland） were calculated， and serum FSH， LH and E2 levels were detected by ELISA. Results Compared with the control group， the vaginal opening time of model group was earlier （P<0.05）; uterine coefficient increased （P<0.05）; serum LH and FSH levels were significantly increased （P<0.05）; there was no significant change in body weight of rats on day 26， 29 and 32 after birth （P>0.05）. Compared with model group， the opening time of vaginal opening in western medicine group and Chinese medicine groups was significantly delayed （P<0.05）; the body weight of rats in high dose Chinese medicine group was significantly decreased at 35 and 38 days after birth （P<0.05）; uterine coefficient of western medicine group and medium dose Chinese medicine group decreased （P<0.05）; there were no significant changes in ovarian coefficient and bilateral mammary gland coefficient in western medicine group and medium dose Chinese medicine group （P>0.05）; serum LH， FSH and E2 levels in western medicine group， high dose Chinese medicine group and medium dose Chinese medicine group were significantly decreased （P<0.05）. Compared with the low dose Chinese medicine group， the levels of LH， FSH and E2 in the high dose Chinese medicine group and medium dose Chinese medicine group were significantly decreased （P<0.05）. Conclusion Jiuwei Chushi Granule can inhibit NMA induced precocious puberty in female rats and reduce the levels of serum LH， FSH， E2 in precocious rats. Jiuwei Chushi Granule may inhibit precocious puberty by regulating hypothalamus-pituitary-gonadal axis.

〔Keywords〕? precocious puberty; Jiuwei Chushi Granule; N-methyl-DL-aspartate; body mass; sex hormone; rat

性早熟[1]是指女孩在8歲之前、男孩在9歲之前出現(xiàn)性發(fā)育征象，是由GnRH神經(jīng)元的過早激活引起的[2]，是小兒常見的內(nèi)分泌疾病之一。根據(jù)下丘腦-垂體-性腺軸功能啟動與否，又分為真性性早熟和假性性早熟，而真性性早熟以中樞性性早熟最常見[1]。據(jù)報道全球性早熟發(fā)病率約為0.2%，女孩是男孩的5～10倍，性早熟已成為全球關(guān)注的熱點問題，若性早熟患兒得不到及時正確治療，會引起骨骺端提前閉合，致終身高矮小及一系列心理行為問題[3]。目前，治療性早熟常用的西藥為促性腺激素釋放激素類似物，但其價格昂貴，長期使用會給患兒家庭帶來沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，而諸多文獻(xiàn)[4-7]證明中醫(yī)藥治療性早熟已取得良好效果。為了觀察九味楮實顆粒對性早熟的干預(yù)作用及機(jī)制，本實驗以N-甲基-DL-天冬氨酸（NMA）構(gòu)建雌性大鼠真性性早熟模型，采用中藥高、中、低劑量分別進(jìn)行干預(yù)，通過測定血清促黃體生成素（luteinizing hormone， LH）、卵泡刺激素（follicule-stimulating hormone， FSH）、雌二醇（estradiol， E2）水平的變化探討九味楮實顆粒的作用機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1? 主要藥物

九味楮實顆粒為湖北省中醫(yī)院兒科生長發(fā)育?？茀f(xié)定方，依照與九味楮實顆粒處方相同的原料及制備工藝方式提取，并將其濃縮為每毫升浸膏含1.98 g生藥劑型，中藥飲片由湖北省中醫(yī)院藥劑科提供，藥材來源于湖北辰美中藥有限公司，按兒童臨床用量3.33 g/kg將浸膏用蒸餾水混勻，根據(jù)等效劑量換算公式折算成大鼠劑量。NMA（批號：116H5840，Aladdin公司）;注射用戈那瑞林（規(guī)格100 μg/kg，批號：200108-2，馬鞍山豐原制藥有限公司）。

1.2? 動物

大鼠由湖北省實驗動物研究中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2015-0018。在湖北中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房飼養(yǎng)，室溫20～26 ℃，每日光照時間06：00～18：00，濕度60%～70%，喂養(yǎng)普通顆粒飼料（由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供），所有提供的食物和水均是無菌的，自由進(jìn)食飲水，每兩日更換一次墊料。實驗動物的操作均符合湖北中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理學(xué)管理條例。

1.3? 主要儀器與試劑

FA2004C型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;TG16W型微量高速離心機(jī)（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）;GNP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（北京六一儀器有限公司）;DM1000正置顯微鏡（徠卡顯微系統(tǒng)有限公司）;AMR-100酶標(biāo)分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）;APW-200型酶標(biāo)洗板機(jī)（杭州奧盛儀器有限公司）;48T ELISA試劑盒（江蘇菲亞生物科技有限公司，批號：GR2020-10），其中包括E2試劑（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：JYM0608Ra）;FSH試劑（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：JYM0597Ra）;LH試劑（江蘇菲亞生物科技有限公司，貨號：JYM0623Ra）;0.1%呂氏堿性美蘭染液（北京索萊寶科技有限公司）;瑞氏-姬姆薩A染色液（湖南常德比克曼生物科技有限公司）;磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）B液（湖南常德比克曼生物科技有限公司）。

1.4? 造模方法

自26日齡起至陰道口開放之日，對照組皮下注射生理鹽水0.2 mL/次，2次/d;其余各組每日14：00和16：00皮下注射NMA 40 mg/kg，每日觀察各組大鼠陰道口開放情況，當(dāng)大鼠陰道口開放后視為造模成功。

1.5? 動物分組與處理

選出5 d內(nèi)出生的雌仔鼠，分為6籠，每籠8只，由親母喂養(yǎng)，22日齡斷奶，并與母鼠分籠。適應(yīng)性喂養(yǎng)4 d后，選用SPF級體質(zhì)量在（46.49±8.00） g的26日齡SD雌鼠48只，完全隨機(jī)分為6組：對照組、模型組、西藥組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組，每組8只，對照組、模型組每日09：00予生理鹽水灌胃1 mL，西藥組予戈那瑞林皮下注射100 μg/kg，中藥高、中、低劑量組分別予以九味楮實顆粒69.48、34.74、17.37 g/kg灌胃，均為1次/d。對于陰道口已開放的大鼠，每日08：00進(jìn)行陰道細(xì)胞涂片觀察其性周期變化。陰道涂片（自制棉簽法[8]）即用細(xì)的牙簽制成的棉簽放入生理鹽水浸濕，并輕插入大鼠陰道內(nèi)0.5～

1 cm，順牙簽纏繞方向旋轉(zhuǎn)1～2圈后取出，由中心向四周均勻涂于載玻片上，待載玻片自然干燥后，分別同時采用美蘭及瑞氏[9]兩種染色方法，低倍光鏡下觀察其細(xì)胞形態(tài)以確定大鼠性周期各個階段[10]。當(dāng)模型組大鼠出現(xiàn)第一個發(fā)情前期時停止給藥，其他各組同時停止藥物干預(yù)，且停止給藥的動物數(shù)要與模型組的動物數(shù)相等。

1.6? 標(biāo)本采集與制備

當(dāng)模型組大鼠出現(xiàn)第一個發(fā)情前期時當(dāng)日稱量體質(zhì)量后處死，其他各組按1∶1比例同時處死，用0.3 mL/100 g的10%水合氯醛麻醉后腹主動脈采血，取血清，-20 ℃凍存，留取標(biāo)本（第2對乳腺、雙側(cè)卵巢和子宮），稱量第2對乳腺、卵巢和子宮濕重。

1.7? 指標(biāo)測定

1.7.1? 測量各組大鼠體質(zhì)量? 自造模之日起，每間隔2 d按照固定的時間點（上午7時）用SOVO索沃電子秤測量各組大鼠體質(zhì)量，保留兩位小數(shù)，直至實驗結(jié)束。

1.7.2? 計算各組大鼠臟器系數(shù)? 對各組大鼠進(jìn)行麻醉處理后，頸椎脫臼法處死，取大鼠卵巢、子宮、雙側(cè)乳腺組織，用電子天平稱量卵巢、子宮、雙側(cè)乳腺濕重，根據(jù)器官系數(shù)=器官濕重（g）/體質(zhì)量（g），計算臟器系數(shù)。

1.7.3? 測量各組大鼠血清LH、FSH、E2的水平? 取各組大鼠麻醉處死前腹主動脈采血3 mL，利用離心機(jī)3 000 r/min處理15 min后分離上清液，在-20 ℃環(huán)境中保存待檢。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行，包括標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋、加樣、加酶及溫育、洗滌、顯色、終止反應(yīng)、測吸光度（OD值），按照步驟測量血清LH、FSH、E2的含量。

1.8? 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件處理，數(shù)據(jù)以“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;采用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1? 各組大鼠陰道口開放情況

與對照組比較，模型組大鼠陰道口開放時間提前（P<0.05）;與模型組比較，中藥各劑量組及西藥組出現(xiàn)陰道口開放時間明顯延遲（P<0.05）。見圖1。

2.2? 大鼠動情周期陰道細(xì)胞涂片染色情況

大鼠陰道細(xì)胞涂片采用堿性美蘭染色法，如圖2所示，動情間期（M1期）以大量白細(xì)胞為主;動情前期（M2期）以有核上皮細(xì)胞為主，有少量無核角化上皮細(xì)胞;動情期（M3期）幾乎全是片狀的無核角質(zhì)化細(xì)胞;動情后期（M4期）以白細(xì)胞、角化細(xì)胞、有核細(xì)胞3種細(xì)胞并見，以大量白細(xì)胞為主。大鼠陰道口開放當(dāng)日陰道涂片結(jié)果為動情期，SD雌鼠動情周期平均為4～5 d，動情期一般持續(xù)1～2 d，連續(xù)出現(xiàn)有規(guī)律的動情周期。

2.3? 各組大鼠不同日齡體質(zhì)量的變化

與對照組比較，模型組大鼠在出生后26、29、32 d體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與模型組比較，中藥高劑量組大鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

2.4? 各組大鼠不同臟器系數(shù)比較

與對照組比較，模型組大鼠子宮系數(shù)升高（P<0.05）;卵巢系數(shù)及雙側(cè)乳腺系數(shù)變化不明顯（P>0.05）。與模型組比較，西藥組、中藥中劑量組大鼠子宮系數(shù)降低（P<0.05）;西藥組、中藥各劑量組大鼠卵巢系數(shù)及雙側(cè)乳腺系數(shù)無顯著差異（P>0.05）。見表2。

2.5? 各組大鼠性激素LH、FSH、E2水平比較

與對照組比較，模型組大鼠LH、FSH水平升高（P<0.05），E2水平降低（P<0.05）。與模型組比較，西藥組及中藥高、中劑量組大鼠LH、FSH、E2水平降低（P<0.05）;與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組、中藥中劑量組血清LH、FSH、E2降低（P<0.05）。見表3。

3 討論

中國古代醫(yī)學(xué)典籍中并無性早熟這個病名，中醫(yī)病名同現(xiàn)代病名一致。兒童性早熟是由先天及后天因素共同影響的結(jié)果[11]，小兒臟腑嬌嫩，形體未充，肝常有余，腎常不足，其病機(jī)主要責(zé)之于腎陰陽失衡，腎陰不足，累及肝陰，相火偏旺。文獻(xiàn)研究[12]發(fā)現(xiàn)性早熟的證型大致可以分為肝腎陰虛、肝郁化火型、脾胃濕熱型三大類，臨床上常以陰虛火旺型為主癥，以“滋陰補(bǔ)腎、清瀉相火”為治法，其中性早熟的代表方中，以知柏地黃丸[13]及丹梔逍遙丸[14]最為常用。九味楮實方由“知柏地黃丸”合“柴胡疏肝散”加減化裁而來，具體成分為楮實子、醋柴胡、生地黃、知母、黃柏、郁金、荔枝核、貓爪草、白芍。方中以性寒之楮實子、甘苦之生地黃為君藥，滋腎陰清肝;以苦甘寒之知母、苦寒之黃柏、苦微寒之醋柴胡、苦微寒之白芍為臣藥，輔君滋陰降火，兼疏肝解郁;另以苦溫之荔枝核，甘溫之貓爪草，同歸肝經(jīng)，兩者均可理氣化痰散結(jié)，消乳核，共為佐藥;以辛苦寒之郁金，芳香宣達(dá)，歸肝膽心肺經(jīng)，行氣解郁，疏肝散結(jié)為使藥，諸藥合用攻補(bǔ)兼施，寒溫得益，共奏滋陰降火、平調(diào)肝腎、疏肝解郁、消腫散結(jié)之效，標(biāo)本同治。該方為湖北省中醫(yī)院劉建忠主任醫(yī)師帶領(lǐng)的生長發(fā)育?？茍F(tuán)隊經(jīng)過5年余的臨床實踐總結(jié)的經(jīng)驗方[15]，而九味楮實顆粒是在九味楮實方基礎(chǔ)上經(jīng)過加工工藝正在申請的一個院內(nèi)制劑，兩者組方相同。在前期臨床研究[16]中，我們發(fā)現(xiàn)運用九味楮實方配方顆粒口服治療女童中樞性性早熟，可以改善患兒乳腺發(fā)育、陰道分泌物增多等臨床癥狀，抑制患兒子宮、卵巢、卵泡發(fā)育，降低患兒血清LH、FSH、E2水平，臨床療效顯著，本次實驗研究以臨床使用有效劑量作為九味楮實顆粒中劑量組。

NMA屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，使出生后26～29日齡的雌鼠陰門提前開啟，出現(xiàn)性周期，進(jìn)入青春期[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)，性早熟可能由于興奮性氨基酸受體激動劑激活下丘腦GnRH神經(jīng)元，促進(jìn)GnRH分泌增加，從而發(fā)揮中樞作用。故本研究采用NMA構(gòu)建大鼠真性性早熟模型。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠陰道口提前開放;與模型組比較，中藥各組及西藥組出現(xiàn)陰道口開放時間明顯延遲，且中藥高、中劑量組較中藥低劑量組陰道口開放時間延遲，表明九味楮實顆?？梢种艵AAs受體激動劑NMDA誘導(dǎo)的雌性大鼠真性性早熟的發(fā)生。

引起性早熟的因素錯綜復(fù)雜，其中肥胖是導(dǎo)致性早熟的危險因素之一，有研究[19]顯示肥胖者體內(nèi)脂肪組織可以分泌瘦素、脂聯(lián)素等生物活性因子，可能通過影響維生素D和黃體生成素的水平參與特發(fā)性性早熟的發(fā)生，而瘦素可以調(diào)節(jié)脂肪存儲量，通過下丘腦-垂體-性腺軸調(diào)節(jié)青春期啟動和生殖功能，促進(jìn)垂體分泌LH和FSH，促進(jìn)性腺分泌性激素，從而導(dǎo)致青春期提前發(fā)作。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，各干預(yù)組大鼠在出生后26、29、32 d體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），后期還需進(jìn)一步探究早熟大鼠的體質(zhì)量與性早熟之間是否存在聯(lián)系。

SD大鼠未發(fā)育之前，HPG未啟動，體內(nèi)的LH、FSH、E2含量均較低，當(dāng)大鼠性腺功能啟動時，垂體前葉分泌的LH、FSH大量增加，作用于性腺組織，增加E2的分泌，促進(jìn)性腺的發(fā)育。黃體生成素是腺垂體嗜堿性粒細(xì)胞分泌的一種促性腺激素，一般由垂體分泌，可與卵泡刺激素協(xié)同作用于卵巢，促進(jìn)排卵。臨床研究[20]證實兒童血清LH水平的顯著升高是其下丘腦-垂體-性腺軸活動被激活的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組各組大鼠LH、FSH水平上升（P<0.05），與模型組比較，西藥組、中藥各組大鼠LH、FSH、E2水平均下降（P<0.05），說明九味楮實顆粒可降低性早熟大鼠血清LH、FSH、E2的水平;與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組、中藥中劑量組血清LH、FSH、E2水平下降（P<0.05），說明九味楮實顆粒在調(diào)節(jié)性早熟大鼠性激素LH、FSH、E2水平上存在量效關(guān)系。

乳腺發(fā)育主要受下丘腦-垂體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)調(diào)控，乳腺發(fā)育一般為雌激素刺激乳腺組織所致，在解剖上認(rèn)為大鼠的第2對乳腺組織與人類乳腺較為接近[21-22]。子宮、卵巢為SD雌鼠的性腺組織，卵巢為性激素分泌的器官來源，而子宮則是性激素作用的靶器官。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，西藥組、中藥中劑量組子宮系數(shù)降低（P<0.05），說明九味楮實顆粒中劑量在一定程度上可以抑制子宮提前發(fā)育;與模型組比較，西藥組、中藥高中低劑量組卵巢系數(shù)及雙側(cè)乳腺系數(shù)無顯著差異（P>0.05），表明九味楮實顆粒對卵巢及雙側(cè)乳腺組織作用不顯著，后期還需從乳腺病理切片及多次實驗予以驗證。

綜合上述實驗結(jié)果推測，九味楮實顆?？赡苁峭ㄟ^抑制下丘腦-垂體-性腺軸的啟動而起到抑制性早熟作用。后期實驗研究可以從肝腎功能、基因分子表達(dá)方面進(jìn)一步探索九味楮實顆粒治療性早熟的具體作用機(jī)制，為進(jìn)一步申請院內(nèi)制劑及該藥投入臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

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