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    益氣滋陰湯治療慢傳輸型便秘大鼠的實 驗 研 究*

    2021-11-21 08:17:18尹園緣賓東華王珊蘋
    中醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年5期
    關(guān)鍵詞:莫沙滋陰含水

    詹 敏,尹園緣,李 逵,賓東華,王珊蘋

    (湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,湖南 長沙 410007)

    慢傳輸型便秘(slow transit constipation,STC)是一種頑固性的慢性疾病,表現(xiàn)為排便次數(shù)減少、排便困難和便意減少或消失[1]。近年來慢傳輸型便秘呈高發(fā)趨勢,我國的發(fā)病率為7.0%~20.3%[2],其中老年人占了絕大多數(shù)。便秘通常分為原發(fā)性便秘和繼發(fā)性便秘,慢傳輸型便秘屬于原發(fā)性便秘[3]。雖然便秘癥狀尚不威脅生命,但它帶來的疾病負(fù)擔(dān)卻不容忽視。長期便秘會加重原有的消化道癥狀,使消化功能進(jìn)一步紊亂,用力排便甚至?xí)T發(fā)心腦血管疾病。便秘患者的反復(fù)就醫(yī)和情緒低落,也會出現(xiàn)一些心理情緒障礙,對患者的生活質(zhì)量、工作效率及醫(yī)療資源消耗都有一定的影響,給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[4]。中醫(yī)藥從整體觀出發(fā),在治療慢傳輸型便秘方面有著非常理想的效果,但是具體治療機(jī)制尚不明確,因此探討STC的治療機(jī)制對指導(dǎo)臨床治療具有重要的意義。本研究采用中西醫(yī)不同的方法治療慢傳輸型便秘模型大鼠,探究兩者的療效和作用機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物20周齡健康的SD大鼠(湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司提供),60只,體質(zhì)量(180±15)g,動物許可證號:SCXK(湘)2013-0004,動物合格證號:43004700020983。本實驗已通過本院實驗動物倫理審查(ZYFY20160301-4)。

    1.1.2 實驗藥物 益氣滋陰湯藥物組成:太子參30 g,白術(shù)30 g,肉蓯蓉30 g,枳殼10 g,火麻仁20 g,制何首烏20 g,黃芪15 g,杏仁15 g,玄參15 g,檳榔10 g,甘草6 g(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備);枸櫞酸莫沙必利片(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),批號:20160105)。

    1.1.3 主要試劑與儀器 電泳儀(北京六一儀器廠,型號:DYY-6C),紫外可見分光光度計(上海spectrum公司,型號:SP-752),超微量分光光度計(美國Nanodrop,型號:One C),臺式高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo,型號:micro21R),實時定量PCR儀(美國Bio-Rad,型號:CTX96),RIPA蛋白裂解液(江蘇碧云天,貨號:P007B),Bradford蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天,貨號:P0006),超敏化學(xué)放光顯色試劑盒(江蘇碧云天,貨號:PA003 WB),Gold View核酸染料(北京索萊寶,貨號28596580)。

    1.2 方法

    1.2.1 造模 參考文獻(xiàn)[5]方法,用生大黃粉開水沖泡制成的混懸液灌胃,1次/d,首次給藥劑量為150 mg/(kg·d),此后按150 mg/(kg·d)的劑量每日遞增,至大鼠夜間12 h糞便含水比達(dá)70%以上時,維持劑量用藥至大鼠夜間12 h糞便含水比降至50%以下,此為一個循環(huán),再按150 mg/(kg·d)的劑量遞增,如此進(jìn)行3個循環(huán),共計60 d,首次致瀉劑量為1 950 mg/(kg·d),最終劑量為2 700 mg/(kg·d)。大鼠夜間12 h糞便含水比保持在50%以下為造模成功。

    1.2.2 動物分組與給藥方法60只SD大鼠隨機(jī)取15只為空白組,其余45只造模成功后隨機(jī)分為益氣滋陰湯組、莫沙必利對照組、模型組,每組15只。

    按照大鼠與人體表面積及體質(zhì)量進(jìn)行換算,益氣滋陰湯組使用益氣滋陰湯中藥煎劑灌胃,2.5 mg(生藥)/kg,1次/d,2周為1個療程。莫沙必利對照組予莫沙必利片藥液灌胃,1.5 mg/kg,1次/d,2周為1個療程。模型組與對照組灌胃等量生理鹽水,1次/d,2周為1個療程。

    1.3 觀察指標(biāo)

    1.3.1 糞便數(shù)量及糞含水比 造模前后檢測大鼠糞便數(shù)量及糞便含水比,糞便數(shù)量(粒):將各組分為造模前、造模后及治療后3個時期,每個時期均為14 d,收集每日糞便,計算總和。糞便含水比(%)為濕、干糞質(zhì)量之差與濕糞質(zhì)量的比值,濕糞質(zhì)量為收集不同時期大鼠的濕糞進(jìn)行稱量,干糞質(zhì)量為收集的濕糞置于恒溫箱烘烤(90℃烘烤3 h)后稱量。

    1.3.2 大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá) 實驗結(jié)束后,各組大鼠禁食24 h,用烏拉坦淺麻醉后,打開腹腔,取距肛側(cè)5 cm結(jié)腸全層,截取1 cm長,截取后3 s內(nèi)放入液氮中以備實時定量熒光PCR檢測使用。取各組大鼠結(jié)腸組織樣本于勻漿器中,加入Trizol試劑提取總RNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA純度,并測定其濃度,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明,將RNA逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件:94℃,4min;94℃,40 s;60℃,30 s;循環(huán)40次。從NCBI中下載基因序列,采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物序列。相關(guān)引物序列:c-kit,F(xiàn) 5'-ATCATGGAG GATGACGATT-3',R 5'-GCCATCCACTTCCAGGTAG-3'。采用2-ΔΔCt法計算結(jié)腸組織中c-kit mRNA表達(dá)水平。

    1.3.3 大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá) 取大鼠結(jié)腸組織,提取組織總蛋白質(zhì),應(yīng)用BCA法測定蛋白含量,取50 μg總蛋白上樣。進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后,封閉處理1 h,加入一抗VIP、AQP3兔抗鼠多克隆抗體,孵育過夜,洗膜后加二抗,室溫孵育1 h,暗室加ECL化學(xué)發(fā)光劑壓片,顯影、定影后掃描X-膠片。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)處理使用SPSS 24.0軟件,計量資料以(±s)表示,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用SNK-q檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠糞便數(shù)量及糞便含水比比較 模型組、益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠造模后糞便數(shù)量和糞便含水比均較造模前明顯降低(P<0.05);益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠治療后糞便數(shù)量和糞便含水比明顯高于造模后(P<0.05),與空白組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠造模后、治療后糞便數(shù)量和糞便含水比均明顯低于空白組(P<0.05)。益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠治療后糞便數(shù)量和糞便含水比均高于模型組(P<0.05)。(見表1~2)

    表1 各組大鼠不同時期的糞便數(shù)量比較(±s,粒)

    表1 各組大鼠不同時期的糞便數(shù)量比較(±s,粒)

    注:益氣滋陰湯組為生藥劑量;與空白組比較,aP<0.05;與造模前比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05;與造模后比較,dP<0.05

    組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 造模前 造模后 治療后空白組 15 - 275.19±0.51 274.21±9.81 275.09±6.21模型組 15 - 272.42±5.37 175.13±3.17ab175.23±1.27a益氣滋陰湯組 15 2.5 272.76±4.56 177.64±6.16b 270.77±5.32cd莫沙必利對照組15 1.5 271.82±5.68 174.93±4.77b 272.24±1.56d F 1.606 865.118 2 017.323 P 0.198 0.000 0.000

    表2 各組大鼠不同時期的糞便含水比比較(±s,%)

    表2 各組大鼠不同時期的糞便含水比比較(±s,%)

    注:益氣滋陰湯組為生藥劑量;與空白組比較,aP<0.05;與造模前比較,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.05

    組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg) 造模前 造模后 治療后空白組 15 - 74.3±6.1 66.1±4.2 65.1±5.5模型組 15 - 62.1±10.7 53.2±3.4ab 53.4±3.6a益氣滋陰湯組 15 2.5 75.8±0.7 55.4±2.5b 68.1±3.5bc莫沙必利對照組 15 1.5 69.8±4.4 55.7±2.4b 66.4±4.8bc F 10.323 48.561 34.112 P 0.000 0.000 0.000

    2.2 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較 模型組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)低于空白組(P<0.01);益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)高于模型組(P<0.05)。(見表3、圖1)

    表3 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較(±s)

    表3 各組大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平比較(±s)

    注:益氣滋陰湯組為生藥劑量;與空白組比較,aP<0.01;與模型組比較,bP<0.05

    組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)c-kit mRNA(RQ值)空白組 15 - 1.32±0.50模型組 15 - 0.05±0.01a益氣滋陰湯組 15 2.5 0.25±0.14b莫沙必利對照組15 1.5 0.23±0.10b F 71.840 P 0.000

    圖1 c-kit mRNA表達(dá)擴(kuò)增曲線與溶解曲線

    2.3 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)比較 模型組大鼠結(jié)腸組織中VIP、AQP3蛋白含量均高于空白組(P<0.05);益氣滋陰湯組和莫沙必利對照組大鼠結(jié)腸組織中VIP、AQP3蛋白含量均低于模型組(P<0.01)。(見圖2、表4)

    圖2 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)情況

    表4 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)比較(±s)

    表4 各組大鼠結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)比較(±s)

    注:益氣滋陰湯組為生藥劑量;與空白組比較,aP<0.01,bP<0.05;與模型組比較,cP<0.01

    組別 動物數(shù)(只)給藥劑量(mg/kg)VIP/βactin AQP3/βactin空白組 15 - 0.24±0.07 0.19±0.18模型組 15 - 0.58±0.09a 0.53±0.08a益氣滋陰湯組 15 2.5 0.38±0.17b c 0.27±0.07b c莫沙必利對照組 15 1.5 0.39±0.08b c 0.28±0.08b c F 24.213 25.978 P 0.000 0.000

    3 討 論

    慢傳輸型便秘目前已成為嚴(yán)重影響人類身心健康的重要疾病之一,其病理機(jī)制與Cajal間質(zhì)細(xì)胞(ICC)功能、水通道蛋白表達(dá)、腸神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)遞質(zhì)、胃腸激素分泌等密切相關(guān)[6],但具體發(fā)病機(jī)制尚未明確。臨床上治療方法眾多,目前主要使用大黃蒽醌類瀉劑治療,如大黃、番瀉葉、蘆薈等。西醫(yī)治療慢傳輸型便秘多使用增加動力型藥物(如莫沙必利)[7]、高滲性導(dǎo)瀉藥(如福松)、刺激性泄劑(如酚酞、脫氧膽酸)及微生態(tài)制劑等[8]。上述治療近期有效,遠(yuǎn)期療效不明顯,容易形成大腸黑變病。長期使用會使腸道的敏感性降低,造成腸壁內(nèi)神經(jīng)元不可逆的損害[9]。

    目前普遍認(rèn)為,水通道蛋白3(AQP3)的異常表達(dá)能引起結(jié)腸對水分的過度吸收,從而導(dǎo)致腸道水液代謝紊亂,導(dǎo)致便秘的發(fā)生[10]。胃腸慢波始動細(xì)胞Cajal間質(zhì)細(xì)胞的作用也受到重視,其細(xì)胞表達(dá)受酪氨酸激酶受體c-kit及其配體干細(xì)胞因子(stem cell factor,SCF)調(diào)控,現(xiàn)有研究已證實SCF/c-kit信號途徑在ICC前體分化、發(fā)育及存活中具有重要作用[11-12]。

    中醫(yī)學(xué)認(rèn)為便秘病位在大腸,基本病機(jī)為大腸傳導(dǎo)失司,與脾、肺、肝等臟腑的功能失調(diào)也有關(guān),與自身氣血、經(jīng)絡(luò)、五臟六腑也有一定關(guān)系[13-15]。既往一些醫(yī)家常用大黃、芒硝、番瀉葉等苦寒之品,易傷及脾胃,使“后天之本”失固,導(dǎo)致癥狀反復(fù)發(fā)作[16]。張西平[17]認(rèn)為慢傳輸型便秘可以從“氣虛”“陰虛”兩方面論治。耿彬[18]、李超男等[19]研究表明治療慢傳輸型便秘常用的健脾益氣藥有生白術(shù)、黃芪,常用的補(bǔ)陰藥有沙參、麥冬。本次研究選擇的益氣滋陰湯化裁自《幼科直言》卷五中益氣滋陰湯,前期的臨床研究已經(jīng)證實益氣滋陰湯治療老年慢傳輸型便秘具有顯著的療效[20]。益氣滋陰湯中黃芪、太子參、白術(shù),性甘溫,可補(bǔ)肺脾之氣,杏仁、火麻仁可潤腸通便,玄參、制何首烏具有滋陰養(yǎng)血功效,檳榔、枳殼能夠行氣導(dǎo)滯,肉蓯蓉則可補(bǔ)腎助陽,兼具潤腸通便功效,甘草可調(diào)和諸藥。諸藥配伍共奏益氣滋陰之功效,使得患者脾肺之氣得生,補(bǔ)益精血,滋潤大腸津虧,進(jìn)而推動腸內(nèi)糟粕下行,便結(jié)易解,緩解患者便秘?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示:黃芪有增強(qiáng)細(xì)胞免疫、體液免疫的功能,白術(shù)可提高機(jī)體免疫力[21],肉蓯蓉具有抗衰老、緩解疲勞、潤腸通便的功效[22]。

    本次研究結(jié)果顯示,模型組、益氣滋陰湯組、莫沙必利對照組大鼠糞便數(shù)量、糞便含水比、結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平均低于空白組,結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)水平均高于空白組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);益氣滋陰湯組、莫沙必利對照組大鼠糞便數(shù)量、糞便含水比、結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平均高于模型組,結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白表達(dá)水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。益氣滋陰湯組大鼠糞便數(shù)量,糞便含水比,結(jié)腸組織VIP、AQP3蛋白水平及結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)與莫沙必利對照組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。此次實驗研究證實益氣滋陰湯能增加慢傳輸型便秘模型大鼠糞便量及糞便含水比,顯著降低其結(jié)腸組織中VIP、AQP3蛋白的表達(dá),提高大鼠結(jié)腸組織c-kit mRNA表達(dá)水平,其療效與莫沙必利基本相當(dāng)。

    綜上所述,益氣滋陰湯可明顯改善慢傳輸型便秘大鼠的腸道功能和糞便癥狀,作用機(jī)制可能與減少神經(jīng)遞質(zhì)VIP蛋白和水通道蛋白AQP3的表達(dá),以及增加SCF/c-kit信號通路的表達(dá)有關(guān)。此次實驗為益氣滋陰湯的臨床使用提供了實驗依據(jù),有助于益氣滋陰湯的臨床推廣,也為進(jìn)一步探究此方的其他作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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