食品中乳酸桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR 的快速檢測(cè)運(yùn)用

齊越

通遼市食品藥品檢驗(yàn)所食品室 內(nèi)蒙古通遼 028000

乳酸桿菌大量存在于各種乳制品中，常見的有保加利亞乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌和乳酪乳桿菌等，這些乳酸桿菌可以被用來食品發(fā)酵和生物檢定，但是一些乳酸桿菌尤其是乳桿菌也可能成為物質(zhì)腐爛的主要細(xì)菌之一。在微生物種類檢定中，常用高度保守性的16S rDNA 序列進(jìn)行檢定，本文針對(duì)含有酒花物質(zhì)的啤酒，利用實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)對(duì)啤酒中的乳酸桿菌進(jìn)行檢測(cè)和控制，設(shè)計(jì)通用引物和特異性探針，驗(yàn)證該技術(shù)方法在乳酸桿菌的檢定中具有高度特異性、靈敏度和快速簡(jiǎn)便的特征。

1 試驗(yàn)材料和試驗(yàn)方法

1.1 原材料

本試驗(yàn)選擇植物乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、保加利亞乳酸桿菌開展試驗(yàn)，所有菌種均從實(shí)驗(yàn)室分離得到[1]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)備和試劑

本試驗(yàn)研究選擇實(shí)時(shí)熒光PCR 基因擴(kuò)增設(shè)備、臺(tái)式高速離心機(jī)、恒溫振蕩設(shè)備和厭氧罐作為試驗(yàn)設(shè)備，選擇MRS 等培養(yǎng)基，以及細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒等試劑。

1.3 試驗(yàn)方法和試驗(yàn)步驟

首先第一步，在培養(yǎng)基中進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，然后從試劑中提取基因組DNA，要求在有氧和厭氧的條件下分別培養(yǎng)菌種，以37℃的溫度恒溫培養(yǎng)48 小時(shí)后提取細(xì)菌。第二步，設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光PCR通用引物和特異性探針，即針對(duì)16S rDNA 序列同源性通用比較和非同源性參考菌株的特異性檢測(cè)，在同源性較高的地方設(shè)計(jì)乳酸桿菌通用性引物和探針。第三步，將乳酸桿菌菌株稀釋到不同的梯度后，在不同的反應(yīng)溫度和時(shí)間下開展靈敏度檢測(cè)。具體檢測(cè)步驟包括：將乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株放置于相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間，然后檢測(cè)其靈敏度值，估計(jì)菌株的數(shù)量，然后按照不同梯度進(jìn)行稀釋，取最后幾個(gè)梯度的菌株液涂平板計(jì)數(shù)，如此循環(huán)多次后取平均值確定最后的菌密度，將每一個(gè)梯度的菌株液體各取3 管開展實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，并將檢測(cè)的結(jié)果和平板計(jì)數(shù)結(jié)果相對(duì)照，以確定反應(yīng)菌株的靈敏度情況。最后第四步開展特異性檢測(cè)，即將乳酸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、大腸桿菌、沙門氏菌、黃色葡萄球菌、奇異變形桿菌、弗氏志賀菌分別放置在菌液中培養(yǎng)并提取細(xì)菌DNA，將以上幾種細(xì)菌的DNA 混合后再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，可檢測(cè)非同源性參考菌株的特異性[2]。

2 試驗(yàn)結(jié)果和分析

2.1 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

將植物乳酸桿菌菌株按照一定的梯度進(jìn)行稀釋以后，采用實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)可得到檢測(cè)的濃度是83CFU/mL。將干酪乳桿菌按照同樣的倍數(shù)和方法稀釋以后，再利用實(shí)時(shí)熒光PCR 進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)的結(jié)果可得到最終檢測(cè)的濃度是100CFU/ml。針對(duì)保加利亞乳酸桿菌的靈敏度檢測(cè)，按照1-7的倍數(shù)進(jìn)行稀釋后，再利用實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)，根據(jù)平板計(jì)數(shù)結(jié)果檢測(cè)得到的濃度是40CFU/ml。

2.2 特異性試驗(yàn)結(jié)果

從非同源性參考菌株的實(shí)時(shí)熒光PCR 特異性檢測(cè)結(jié)果可知，乳酸桿菌得到了擴(kuò)增，所有非乳酸桿菌沒有檢測(cè)到熒光信號(hào)，說明實(shí)時(shí)熒光PCR 在檢測(cè)乳酸桿菌的方面具有較好的特異性[3]。

3 試驗(yàn)結(jié)果討論

從上文對(duì)食品中乳酸桿菌的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)分析可知，利用厭氧培養(yǎng)法和平板計(jì)數(shù)是常見的檢測(cè)方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)出試驗(yàn)所需的菌株以后，可直接肉眼觀察初步分析結(jié)果。乳酸桿菌的細(xì)胞呈多樣化多形態(tài)，有細(xì)長狀、彎曲狀和短桿狀等，其一般處于靜止?fàn)顟B(tài)，無芽孢。采用厭氧平板法檢測(cè)時(shí)間較長，往往需要一周甚至更久才能觀測(cè)到結(jié)果，這樣就無法及時(shí)反映微生物是否具有污染特性且污染的嚴(yán)重性。對(duì)于乳酸桿菌而言，其在形成的過程中對(duì)營養(yǎng)的要求比較高，培養(yǎng)特性特殊，無法使用傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，而且后期分離這些培養(yǎng)菌株也需要一定的時(shí)間。因此，需要采用更加快速高效且靈敏度更高的針對(duì)乳酸桿菌的培養(yǎng)、檢測(cè)檢驗(yàn)方法。PCR 檢測(cè)法在一開始在應(yīng)用時(shí)，存在假陽性污染與定量分析和準(zhǔn)確度不高的問題，這些年來開始采用實(shí)時(shí)PCR 熒光定量檢測(cè)技術(shù)，該技術(shù)方法的使用不但可以進(jìn)行乳酸桿菌的定量檢測(cè)還能進(jìn)行定性分析，特異性和靈敏度較高，且定量檢測(cè)更加準(zhǔn)確、速度更快，定性分析也更加精準(zhǔn)，將其用在分子生物學(xué)檢定實(shí)驗(yàn)中具有突出的優(yōu)勢(shì)。

本文針對(duì)食品中的乳酸桿菌，針對(duì)16S rDNA 序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增乳酸桿菌通用引物和非同源性菌株特異性檢測(cè)試驗(yàn)。在采用實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)時(shí)，采用乳酸桿菌通用引物出現(xiàn)了特異性擴(kuò)增，而非乳酸桿菌沒有出現(xiàn)特異性擴(kuò)增。這說明所采用的乳酸桿菌引物和探針都具有較高的特異性，并且只特異性擴(kuò)增了乳酸桿菌。

4 結(jié)語

綜上所述，隨著對(duì)食品質(zhì)量和食品安全的高度重視，提高食品質(zhì)量檢測(cè)的速度、效率和效果已經(jīng)勢(shì)在必行。在對(duì)食品乳酸桿菌檢測(cè)方面，常規(guī)檢測(cè)方法不僅效率不高而且檢測(cè)結(jié)果的精確性較低，檢測(cè)時(shí)間較長無法很準(zhǔn)確反映微生物的污染情況。為此，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了采用實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)食品中乳酸桿菌的方法，提高了檢測(cè)的質(zhì)量可靠性和準(zhǔn)確性，且能在較短的時(shí)間內(nèi)反映污染物的特性，實(shí)用性和時(shí)效性較強(qiáng)，將其應(yīng)用在生物分析鑒定中具有十分廣闊的應(yīng)用發(fā)展前景，為乳酸桿菌的試驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)和理論的發(fā)展奠定良好基礎(chǔ)。