植物生物反應(yīng)器表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

許惠濱 王福祥

摘?要：由于成本低廉、易于規(guī)?；a(chǎn)、可減少污染哺乳動物病原的風(fēng)險且能對表達(dá)蛋白進(jìn)行翻譯后修飾等優(yōu)點，植物正逐漸成為一種重要的重組蛋白生產(chǎn)平臺，而以轉(zhuǎn)基因植物作為工業(yè)與化工產(chǎn)品生產(chǎn)的天然生物反應(yīng)器也越來越受關(guān)注。植物生物反應(yīng)器主要有穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)和瞬時表達(dá)系統(tǒng)，概述了這兩種不同的表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點及其研究進(jìn)展，并闡述了植物生物反應(yīng)器的發(fā)展趨勢，以期為植物生物反應(yīng)器的發(fā)展和應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：植物;重組蛋白;生物反應(yīng)器;表達(dá)系統(tǒng)

中圖分類號：S 31?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：0253-2301（2021）09-0076-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.09.013

Research Progress of Plant Bioreactor Expression Systems

XU Hui?bin?1， WANG Fu?xiang2，3

（1.Marine and Agricultural Biotechnology Laboratory， College of Geography and Oceanography，

Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2.National Rice Engineering Laboratory of China，

Rice Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China;

3.College of Agriculture， Fujian Agricultral and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China）

Abstract： Plants are emerging as a promising platform for recombinant protein production due to time and cost efficiency， scalability， lack of harboured mammalian pathogens and possession of the machinery for eukaryotic post?translational protein modification.Transgenic plants are gaining increasing attention from the industry as a natural bioreactor for the production of industrial and chemical products. Plant bioreactor mainly consists of stable expression system and transient expression system. Here， we overview the advantages and disadvantages of different expression systems and their research progress， and the development trend of plant bioreactor was also described. In order to lay a theoretical foundation for the development and application of plant bioreactor.

Key words： Rlant; Recombinant protein; Bioreactor; Expression system

得益于近年來系統(tǒng)生物學(xué)和分子生物學(xué)等多方面技術(shù)的發(fā)展，合成生物學(xué)的研究對象正逐步過渡到更為復(fù)雜的多細(xì)胞體系。植物擁有豐富的內(nèi)膜系統(tǒng)和細(xì)胞器、高度特化的生物合成基因簇、精細(xì)的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為開展相關(guān)研究提供了理想的模式體系。植物生物反應(yīng)器是指通過基因工程途徑，以常見的農(nóng)作物作為“化學(xué)工廠”，生產(chǎn)具有高經(jīng)濟(jì)附加值的醫(yī)用蛋白、工農(nóng)業(yè)用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂類及其他一些次生代謝產(chǎn)物等生物制劑的方法[1] ，在過去的幾十年里，它已發(fā)展成為生產(chǎn)有用重組蛋白的重要平臺。Fisher等首次引入分子農(nóng)業(yè)或“生物制藥”的概念來描述“植物中重組蛋白的產(chǎn)生”[2-3] 。早期，該領(lǐng)域的研究對象主要是重組大分子，如血液蛋白、疫苗和抗體，目前也涉及化妝品原料和醫(yī)療治療方面[4] 。

表達(dá)/生產(chǎn)系統(tǒng)的選擇不僅取決于研究者自身的需求，還取決于生產(chǎn)目標(biāo)生物制劑的最終目的和功能。傳統(tǒng)的基于大腸桿菌、酵母、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)的生物制藥大規(guī)模生產(chǎn)平臺已經(jīng)建立并不斷完善。復(fù)雜的治療性蛋白質(zhì)必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)恼郫B或加工以達(dá)到所需的生物活性，這需要在酵母或哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中而不是原核生物中產(chǎn)生，然而哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中最令人擔(dān)憂的是擴(kuò)大規(guī)模的高運營成本和動物傳播病毒或病毒粒子的潛在污染[5] 。鑒于這些問題，植物生物反應(yīng)器是生產(chǎn)特定重組蛋白的一個很好的選擇。因為它具有很多優(yōu)勢：首先，植物只需要光、水和土壤等溫室條件就能生產(chǎn)蛋白質(zhì)，相比細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞和哺乳動物培養(yǎng)系統(tǒng)所需的生物反應(yīng)器便宜;其次，與傳統(tǒng)生產(chǎn)系統(tǒng)不同，人畜共患病病原體無法感染植物，因此不會成為分子農(nóng)業(yè)衍生產(chǎn)品的污染物來源;再次，通過將密碼子優(yōu)化、細(xì)胞器特異性啟動子的加入、N聚糖的人源化和瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)等技術(shù)進(jìn)一步提高了分子農(nóng)業(yè)的優(yōu)勢，產(chǎn)量超過1 mg·g-1的新鮮植物重量;最后，植物瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)也提高了生產(chǎn)速度，在轉(zhuǎn)染成株后數(shù)日內(nèi)即可收獲，而不是在數(shù)月內(nèi)獲得穩(wěn)定表達(dá)[6-7] 。植物作為最廉價的“工廠”，具有廣闊的應(yīng)用前景。如何最大限度提高植物源蛋白表達(dá)量是當(dāng)前研究的重點和難點。為了更好地應(yīng)用植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用重組蛋白，本文對影響外源蛋白表達(dá)效率的幾種表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行概述，以期促進(jìn)植物生物反應(yīng)器的推廣和應(yīng)用。

1?植物表達(dá)系統(tǒng)

植物中有多種表達(dá)系統(tǒng)，歸納起來主要有兩大類，既穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)和瞬時表達(dá)系統(tǒng)（圖1）[4] ，每種系統(tǒng)都有優(yōu)缺點（表1），而利用哪種系統(tǒng)取決于使用整株植物或最小加工形式的應(yīng)用程序。穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)可以進(jìn)一步細(xì)分為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化或基因槍轟擊使細(xì)胞核或葉綠體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的技術(shù)，以及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù);而瞬時表達(dá)可以通過植物病毒或農(nóng)桿菌滲透實現(xiàn)[8-9] 。在早期的研究階段，穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用，然而近年來瞬時表達(dá)系統(tǒng)已成為首選。

2?穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)

穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是將外源目的基因?qū)胫参锛?xì)胞中，使其在植物基因組中穩(wěn)定地整合，并誘導(dǎo)長成新的植株，同時，在植物生長過程中表達(dá)目標(biāo)基因，將目標(biāo)性狀傳給子代，成為表達(dá)目標(biāo)蛋白的品系，目標(biāo)蛋白的表達(dá)持久、穩(wěn)定。

2.1?農(nóng)桿菌或基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化

農(nóng)桿菌或基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)是利用穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化方法表達(dá)和生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，其優(yōu)點是操作簡便、獨特的糖基化模式、來自動物傳播污染物的低風(fēng)險和廉價的存儲成本[5，10-11] 。目前已報道了成功利用該系統(tǒng)在煙草、水稻、馬鈴薯、番茄和萵苣等多種植物中生產(chǎn)有價值的重組蛋白[12-16] 。通過細(xì)胞核轉(zhuǎn)化（nuclear transformation）和葉綠體體轉(zhuǎn)化（plastid transformation）兩種方法均可獲得穩(wěn)定的重組蛋白轉(zhuǎn)基因植物。

2.1.1?細(xì)胞核轉(zhuǎn)化?細(xì)胞核轉(zhuǎn)化是應(yīng)用最早的植物轉(zhuǎn)化體系，它將目的基因隨機插入并整合到植物染色體的核基因組中，再經(jīng)抗性篩選獲得表達(dá)外源蛋白的植株。由于外源基因整合到核基因組上，使其在植物體內(nèi)能夠穩(wěn)定表達(dá)。細(xì)胞核轉(zhuǎn)化已經(jīng)在許多植物中應(yīng)用和報道，其不足之處有3個方面：外源蛋白在植物中表達(dá)量偏低;為了獲得穩(wěn)定遺傳的純合子需要經(jīng)過多代篩選，費時費力;轉(zhuǎn)基因植物后代篩選過程中花粉可能會給環(huán)境帶來基因污染，因此，其種植環(huán)境和管理要求嚴(yán)格[17] 。

2.1.2?葉綠體轉(zhuǎn)化?葉綠體轉(zhuǎn)化是將外源基因經(jīng)同源重組的方式定點整合到葉綠體基因組中。每個植物細(xì)胞中含有10～100個葉綠體，每個葉綠體中又含有10～100個質(zhì)體基因組，因此，外源基因在每個葉綠體中會有100～10000?個拷貝，這樣通過葉綠體轉(zhuǎn)化就能夠高效表達(dá)外源蛋白[18-20] ;它還具有穩(wěn)定性強[21] 以及由于母性遺傳，大多數(shù)作物都有開放栽培的可能性。其存在的問題是插入了外源基因的葉綠體基因組只占較少一部分，易形成異質(zhì)體，而異質(zhì)體不穩(wěn)定，須通過去除野生型葉綠體基因組拷貝得到同質(zhì)體方可穩(wěn)定遺傳。此外，葉綠體中所表達(dá)的蛋白不能進(jìn)行翻譯后加工修飾，因此，此系統(tǒng)僅適于表達(dá)結(jié)構(gòu)簡單的蛋白，如抗菌、抗病毒的亞基疫苗和生長素等[22] 。在葉綠體中開發(fā)新的治療性蛋白質(zhì)，以滿足某些代謝或遺傳疾病的緊急醫(yī)療需求，在食用植物細(xì)胞中表達(dá)高水平蛋白質(zhì)的能力，將凍干細(xì)胞在環(huán)境溫度下儲存數(shù)月/年而不會失去治療效果，預(yù)示著推進(jìn)這種低成本、無冷鏈的傳遞系統(tǒng)，以降低蛋白質(zhì)藥物的成本，并使急需蛋白質(zhì)藥物的人群能夠消費得起。

2.2?懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化形成的植株或愈傷組織可以在液體培養(yǎng)基中繁殖，進(jìn)而產(chǎn)生穩(wěn)定的懸浮細(xì)胞系進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)。自從首次報道在煙草細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中生產(chǎn)白蛋白以來，開啟了利用各種植物源細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生多種藥用蛋白的研究[23-24] ，可以制備懸浮細(xì)胞的植物種類從煙草擴(kuò)大到胡蘿卜、苜蓿、番茄、大豆、水稻和紅花等植物[25] 。這種系統(tǒng)有幾個優(yōu)點，包括生長迅速;提高了重組蛋白生產(chǎn)的連續(xù)性;在可控的發(fā)酵罐中培養(yǎng)能夠避免受到生物或非生物的脅迫，降低了轉(zhuǎn)錄后沉默的發(fā)生[4，25] 。但是以該系統(tǒng)生產(chǎn)的產(chǎn)品需要經(jīng)過復(fù)雜的下游純化過程和低溫?zé)o菌存儲運輸，其成本相對較高，無法發(fā)揮出植物生物反應(yīng)器的優(yōu)越性?[6] 。

3?瞬時表達(dá)系統(tǒng)

瞬時表達(dá)系統(tǒng)是將編碼目的基因序列插入病毒基因組中，基于植物病毒對植物的感染，以病毒作為載體將重組病毒接種到植物葉片上，使得目的基因隨病毒在植物體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯和裝配，在轉(zhuǎn)基因植物或細(xì)胞中產(chǎn)生多拷貝重組蛋白基因[26-27] 。宿主細(xì)胞在導(dǎo)入表達(dá)載體后不經(jīng)選擇培養(yǎng)，載體DNA隨細(xì)胞分裂而丟失，目的蛋白的表達(dá)時限短暫。20世紀(jì)90年代后期，瞬時表達(dá)系統(tǒng)主要用于檢測載體或目的蛋白在完整或病毒感染的植物中是否表達(dá)以及確定重組蛋白的功能[4] 。

轉(zhuǎn)基因植物通常用于獲得重組蛋白或者定位蛋白質(zhì)，但是轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生需要大量的時間，表達(dá)蛋白的產(chǎn)量也相對較低。而以植物病毒為載體的瞬時表達(dá)系統(tǒng)不需要穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化，從病毒侵染到高量表達(dá)僅僅需要7～?14 d[28] 。這種表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用植物病毒在植物中復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和傳播，其技術(shù)具有簡單、快速和產(chǎn)量高等優(yōu)點[29] ，被廣泛接受并用于生產(chǎn)大量重組蛋白。該系統(tǒng)的缺點是技術(shù)條件要求高，如質(zhì)粒的純度、轉(zhuǎn)染的效率等，而且由于瞬時轉(zhuǎn)染中外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不與基因組染色體相整合，當(dāng)細(xì)胞復(fù)制后，誘導(dǎo)的性狀消失，使得瞬時轉(zhuǎn)染得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)物保存時間較短，只能持續(xù)數(shù)天到2周。

3.1?病毒表達(dá)載體

常用的植物病毒載體包括煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、花椰菜花葉病毒（Cauliflower mosaic virus，CMV）、豇豆花葉病毒（ Cowpea mosaic virus，CPMV）、馬鈴薯X病毒（Potato X virus，PVX）等。其中，來源于TMV的病毒載體30B具有表達(dá)量高的優(yōu)點，利用該載體在植物瞬時表達(dá)GFP，表達(dá)量達(dá)到總可溶性蛋白的4.8%[30] 。目前，CPMV表達(dá)載體已經(jīng)廣泛使用于動物保護(hù)性疫苗生產(chǎn)[11] 。

3.2?侵染技術(shù)

先前，植物瞬時表達(dá)主要有兩種方法：一種是通過電擊或PEG滲透進(jìn)行原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[31] ;另一種是粒子轟擊植物表皮細(xì)胞或葉片，也稱為基因槍法[32-33] 。由于原生質(zhì)體培養(yǎng)耗時長、成功率低，而基因槍法需要專用的基因槍配套設(shè)備，因此，這兩種方法均難以廣泛應(yīng)用。與上述兩種方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時轉(zhuǎn)化具有成本低、操作簡單、成功率高等優(yōu)點，可應(yīng)用于基因表達(dá)檢測、基因沉默、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)相互作用分析、抑制劑功能鑒定等[34] 。根癌農(nóng)桿菌作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的常用工具，主要采用牙簽接種法[35] 、注射法[36] 、高壓噴射法[37] 和真空滲透法[38] 。這些方法已成功應(yīng)用于許多植物組織，如擬南芥葉片[39] ;百合花和金魚草的花瓣;半夏的葉、葉柄和愈傷組織[40] ;生菜和番茄的葉子和果實;蘋果、梨、桃子、草莓和橙子的果實[34] 。此外，還有煙草、馬鈴薯、芥菜、苜蓿、黑眼豆和水稻等，煙草作為受體材料，因其適合培養(yǎng)且能夠被多種病毒侵染，故被人們所青睞;而選用馬鈴薯和西紅柿主要是方便進(jìn)行動物飼喂試驗[11] 。

4?展望

地球上所有的生命形式都依賴于光合作用，這是植物將光能轉(zhuǎn)換成化學(xué)能的過程。當(dāng)我們通過DNA重組技術(shù)將某一代謝通路引入植物中時，我們就可以將植物轉(zhuǎn)化為一個高效的工廠，而且這個工廠使用結(jié)束后還可以轉(zhuǎn)化為肥料，因此，植物是一種理想的生物反應(yīng)器，也是一個可以生物降解的工廠[41] ?；谥参锏谋磉_(dá)系統(tǒng)是生產(chǎn)具有藥用價值的重組蛋白的強大、可擴(kuò)展和成本效益高的平臺。在分子農(nóng)業(yè)這一總稱下，以植物為基礎(chǔ)生產(chǎn)藥用蛋白是通過在植物或植物細(xì)胞中的瞬時表達(dá)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化獲得的，具有廣闊的應(yīng)用前景。那么選用哪一種植物作為宿主，選擇哪一種表達(dá)系統(tǒng)和侵染技術(shù)進(jìn)行蛋白的表達(dá)與生產(chǎn)，以及如何解決規(guī)?；a(chǎn)的問題等，還有待進(jìn)一步研究。這些問題的解決，為植物生物反應(yīng)器的發(fā)展和應(yīng)用奠定扎實的研究基礎(chǔ)，將為外源重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和應(yīng)用開辟更廣闊的道路。

植物中有多種表達(dá)系統(tǒng)，而每種系統(tǒng)都有其各自的優(yōu)缺點，在此已經(jīng)簡單介紹了各個系統(tǒng)的一些應(yīng)用案例。今后，利用植物生產(chǎn)有用重組蛋白的需求將不斷擴(kuò)大，而生產(chǎn)有用重組蛋白的經(jīng)濟(jì)可行性將決定生產(chǎn)企業(yè)的生存能力。不同的表達(dá)系統(tǒng)重組蛋白的表達(dá)效率不同，在本文討論的生產(chǎn)系統(tǒng)中，瞬時表達(dá)系統(tǒng)最常被不同的公司采用，目前已有16種安全環(huán)保的可上市產(chǎn)品通過室內(nèi)或室外試驗[42] 。以生物反應(yīng)器為基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)可以快速擴(kuò)大規(guī)模，并且不含哺乳動物病原體，已經(jīng)被傳統(tǒng)的以發(fā)酵為基礎(chǔ)的公司所采用。盡管如此，關(guān)于植物生物反應(yīng)器的應(yīng)用情況仍然存在障礙，研究人員仍需努力通過將各個領(lǐng)域的技術(shù)的融合與發(fā)展，進(jìn)而不斷拓寬植物生物反應(yīng)器的應(yīng)用市場。

參考文獻(xiàn)：

[1]楊晶，杜林娜，王法微，等.新型植物生物反應(yīng)器研究進(jìn)展[J].2018（5）：104-109.

[2]FISCHER R，LIAO YC，HOFFMANN K，et al.Molecular farming of recombinant antibodies in plants[J].Biological Chemistry，1999，380（7-8）：825-839.

[3]FISCHER R，DROSSARD J，COMMANDEUR U，et al.Towards molecular farming in the future： Moving from diagnostic protein and antibody production in microbes to plants[J].Biotechnol Appl Biochem，1999，30（2）：101-108.

[4]MOON KB， PARK JS， PARK Y， et al.Development of Systems for the Production of Plant?DerivedBiopharmaceuticals[J].Plants，2019，9（1）：30.

[5]MA J，DRAKE P，CHRISTOU P.The production of recombinant pharmaceutical proteins in plants[J].Nat Rev Genet，2003，4（10）：794-805.

[6]劉蓉蓉.轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗和藥物的研發(fā)進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報，2017， 33（9）：17-22.

[7]CHARLES A.Plant?made vaccines and therapeutics：from′Edible Vaccines′ to Ebola therapeutics[J].Plant Biotechnology Journal，2015，13：1013-1016.

[8]FISCHER R， SCHILLBERG S.Molecular Farming：Plant?Made Pharmaceuticals and Technical Proteins[M].John Wiley & Sons： Hoboken， NJ， USA， 2004.

[9]STOGER E， MA JK， FISCHER R，et al.Sowing the seeds of success： Pharmaceutical proteins from plants[J].Curr Opin Biotechnol，2005，16（2）：167-173.

[10]XU J F， DOLAN MC， MEDRANO G， et al.Green factory： Plants as bioproduction platforms for recombinant proteins[J].Biotechnol Adv，2012， 30（5）：1171-1184.

[11]楊麗萍.植物瞬時表達(dá)系統(tǒng)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究，2019（5）：51-52.

[12]FLOSS DM， MOCKEY M， ZANELLO G， et al.Expression and immunogenicity of the mycobacterial Ag85B/ESAT6 antigens produced in transgenic plants by elastin?like peptide fusion strategy[J].J Biomed Biotechnol， 2010， 274346.

[13]TOKUHARA D， LAVAREZ B， MEJIMA M，et al.Rice?based oral antibody fragment prophylaxis and therapy against rotavirus infection[J].J Clin Investig， 2013， 123（9）：3829-3838.

[14]THANAVALA Y， MAHONEY M， PAL S，et al.Immunogenicity in humans of an edible vaccine for hepatitis B[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（9）：3378-3382.

[15]CHEN Y H，WANG A X， ZHAO L X，et al.Expression of thymosin α1 concatemerin transgenic tomato （solanum lycopersicum） fruits[J].Biotechnol Appl Biochem，2009， 52（4）：303-312.

[16]MOHEBODINI M， JALALI?JAVARAN M， ALIZADEH H，et al.Agrobacterium?mediated transformation of lettuce （lactuca sativa L.） to express lgG?binding protein A and human pro?insulin as a fusion protein[J].J Hortic Sci Biotechnol， 2014， 89：719-725.

[17]陳金梅，姜路壹，洪治.植物生物反應(yīng)器制藥的現(xiàn)狀及展望[J].生物技術(shù)通報，2015， 31（10）：1-7.

[18]CARDI T， LENZI P， MALIGA P.Chloroplasts as expression platforms for plant?produced vaccines[J].Expert Rev Vaccines， 2010， 9（8）：893-911.

[19]RUHLMAN T， VERMA D， SAMSON N， et al.The role of heterologous chloroplast sequence elements in transgene integration and expression[J].Plant Physiol， 2010， 152（4）： 2088-2104.

[20]OEY M， LOHSE M， KREIKEMEYER B， et al.Exhaustion of the chloroplast protein synthesis capacity by massive expression of a highly stable protein antibiotic[J].Plant J， 2009， 57（3）：436-445.

[21]AHMAD N， MICHOUX F， LOSSL AG，et al.Challenges and perspectives in commercializing plastid transformation technology[J].J Exp Bot， 2016， 67（21）：5945-5960.

[22]SIJMONS PC， DEKKER BM， SCHRAMMEIJER B， et al.Production of correctly processed human serum albumin in transgenic plants[J].Biotechnology （N Y）， 1990， 8（3）：217-221.

[23]HUANG TK， MCDONALD KA.Bioreactor engineering for recombinant protein production in plant cell suspension cultures[J].Biochem Eng J，2009， 45：168-184.

[24]YANO A， MAEDA F， TAKEKOSHI M.Transgenic tobacco cells producing thehuman monoclonal antibody to hepatitis B virus surface antigen[J].J Med Virol， 2004， 73（2）：208-215.

[25]GIRARD L S， FABIS M J， BASTIN M， et al.Expression of a human anti?rabies virusmonoclonal antibody in tobacco cell culture[J].Biochem Biophys Res Commun，2006， 345（2）：602-607.

[26]KUMAR G， KARTHIK L， RAO K V B.Plant vaccines： An overview[J].Microbial Bioprospecting for Sustainable Development?，2018， 35（3）：249-263.

[27]郝宇娉，陸琳，楊志紅.轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究進(jìn)展[J].核農(nóng)學(xué)報，2020， 34（12） ： 2708-2724.

[28]HEFERON K L.Plant virus expression vectors set the stage as production platforms for biopharmaceutical proteins[J].Virology，?2012， 433（1）：1-6.

[29]CHEN Q， LAI H F， HURTADO J，et al.Agroinfltration as an efective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins[J].Adv Tech Biol Med， 2013，1（1）：103.

[30]楊麗萍， 金太成， 徐洪偉， 等.植物中瞬時表達(dá)外源基因的新型侵染技術(shù)[J].遺傳， 2013， 35（1）：111-117.

[31]SHEEN J.Signal transduction in maize and arabidopsis mesophyll protoplasts[J].Plant Physiol， 2001， 127（4）：1466-?1475.

[32]SESSA G， BORELLO U， MORELLI G， et al.A transient assay for rapid functional analysis of transcription factors in arabidopsis[J].Plant Mol Biol Report，1998， 16：191.

[33]SCHWEIZERP J， ABDERHALDEN O， DUDLER R.A transient assay system for the functional assessment of defense?related genes in wheat[J].Mol Plant?Microbe Interact， 1999， 12：647-654.

[34]ZHAO WT， WEI JH， LIU XD， et al.Main methods and application progress of plant instantaneous expression technology[J].Biotechnol Commun， 2013：294-300.

[35]LU R， MALCUIT I， MOFFETT P， et al.High throughput virus?induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance[J].EMBO J， 2003， 22（21）：5690-?5699.

[36]FU DQ， ZHU BZ， ZHU HL， et al.Virus?induced gene silencing in tomato fruit[J].Plant J， 2005， 43（2）：299-308.

[37]LIU Y L， SCHIFF M， DINESH?KUMAR S P.Virus?induced gene silencing in tomato[J].Plant J， 2002， 31（6）：777-786.

[38]EKENGREN SK， LIU Y L， SCHIFF M， et al.Two mapk cascades， NPR1， and TGA transcription factors play a role in pto?mediated disease resistance in tomato[J].Plant J， 2003，36（6）：905-917.

[39]CLOUGH SJ， BENT AF.Floral dip： a simplified method for Agrobacterium?mediated transformation of arabidopsis thaliana[J].Plant J， 1998， 16（6）：735-743.

[40]JIA Y F， MA Y K， GUO Y L， et al.Research on the transient express of gus gene by Agrobacterium tumefaciens in pinellia ternata breit[J].Acta Agric Boreali?Sin， 2007（4）：42-?45.

[41]YOSHIDA K， SHINMYO A.Transgene expression systems in plant， a naturalbioreactor[J].J Biosci Bioeng， 2000， 90（4）：353-362.

[42]MCCORMICK A A， REDDY S， REINL S J，et al.Plant?produced idiotype vaccines for the treatment of non?hodgkin′s lymphoma： safety and immunogenicity in a phase I clinical study[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105（29）：10131-10136.

（責(zé)任編輯：柯文輝）