白藜蘆醇通過調(diào)控NLRP3/caspase-1信號通路抑制H2O2誘導(dǎo)的心肌纖維化*

趙雅欣，范奕好，程 陽，蒙中元，吳建福，吳倩文，何 燕

(廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南寧 530000)

心房顫動(房顫)是最常見的心律失常，房顫的藥物治療效果較差，其中一個關(guān)鍵原因是心肌纖維化過程難以逆轉(zhuǎn)。心臟重構(gòu)與氧化應(yīng)激水平升高、細(xì)胞凋亡均與心肌纖維化有關(guān)，心房纖維化引起的結(jié)構(gòu)重構(gòu)促進(jìn)了房顫的發(fā)生和發(fā)展[1-5]。衰老和高血壓均可誘發(fā)心房纖維化[6]。有研究表明，高血壓患者存在固有免疫異常激活，介導(dǎo)下游炎性反應(yīng)的發(fā)生[7]。炎癥所致的結(jié)構(gòu)重構(gòu)是發(fā)生房顫的重要病理生理基礎(chǔ)[8]。預(yù)防心房纖維化可能是治療房顫的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一[9]。

白藜蘆醇(resveratrol，RES)是一種具有較強(qiáng)的抗氧化和抗炎活性的天然多酚化合物，其存在于葡萄、花生等植物中[10]。有研究表明，RES可參與干擾成纖維細(xì)胞活化過程而發(fā)揮對心肌肥厚、心肌纖維化和心力衰竭的治療作用[11-12]。然而，其具體作用機(jī)制尚未清楚。因此，本研究探討了RES是否通過抑制氧化應(yīng)激下的炎性反應(yīng)從而抑制心肌纖維化，以期進(jìn)一步明確RES對心肌纖維化的干預(yù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物

SD乳鼠(出生1～3 d)10只均購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2 試劑

RES、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)均購自美國Sigma公司，兔抗大鼠NOD樣受體蛋白3(NOD like receptor protein 3，NLRP3)抗體購自美國Abcam公司，兔抗大鼠Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)/Ⅲ型膠原(Ⅲ型膠原)抗體、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器

提RNA試劑盒、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司，NanoDrop微量核酸蛋白分析儀購自美國Thermo Fisher公司，7500實(shí)時熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司，F(xiàn)luorChem FC3全能型成像系統(tǒng)購自美國ProteiinSimple公司。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng)

取SD乳鼠心臟，使用差速貼壁法提取心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFs)于10%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)。采用倒置相差顯微鏡觀察SD乳鼠CFs形態(tài)。

1.4.2免疫熒光鑒定

取2代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞爬片后去掉培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution，PBS)洗5 min×2，4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min，用PBS洗5 min×3，0.25%Triton破膜，37 ℃保存10 min，用PBS洗5 min×3，10%山羊血清溶液37 ℃封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜。第2天取爬片，用PBS洗10 min×3，熒光標(biāo)記素標(biāo)記羊抗兔二抗37 ℃孵育45 min，用PBS洗10 min×3，抗熒光埣滅劑(含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚)封片，于熒光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。

1.4.3CCK-8法檢測CFs存活率

細(xì)胞培養(yǎng)后分為對照組，H2O2(5、10、20、40、80 μmol/L)組，接種于96孔板培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基更換成含不同濃度H2O2的培養(yǎng)基預(yù)處理6 h后更換培養(yǎng)基，再加入CCK-8試劑10 μL，37 ℃孵育3 h，在450 nm波長處使用酶標(biāo)儀檢測其光密度值，計算CFs存活率。

1.4.4PCR檢測基因表達(dá)水平

將細(xì)胞分為對照組、H2O2(10 μmol/L)組和H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組，RES預(yù)處理12 h后加H2O2(10 μmol/L)處理6 h，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄，加GAPDH、白細(xì)胞介素(interleukin，IL-1)、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ引物上機(jī)并計算相關(guān)基因表達(dá)量。

1.4.5Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

分組處理與1.4.4項相同，提取蛋白并用2,2′-聯(lián)喹啉-4,4′-二羧酸二鈉檢測蛋白濃度，對蛋白樣品(總量30 μg/μL)進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，GAPDH、NLRP3、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白抗體孵育，二抗孵育，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，計算上述蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 倒置相差顯微鏡觀察SD乳鼠CFs形態(tài)

細(xì)胞逐漸變成為成纖維細(xì)胞形態(tài)，體積大，呈三角形或星形，一般含2～3個細(xì)胞核，核較大且多居中，細(xì)胞核呈卵圓形，細(xì)胞質(zhì)透明。細(xì)胞呈放射狀貼壁，隨著細(xì)胞融合度增加逐漸變?yōu)樗笮?，見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察CFs形態(tài)(40×)

2.2 免疫熒光鑒定

CFs特異性生物學(xué)標(biāo)記物——波形蛋白呈陽性表達(dá)，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為CFs，見圖1、2。

2.3 CCK-8法檢測CFs存活率

與對照組比較，H2O2(10 μmol/L)組CFs存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖3；與H2O2(10 μmol/L)組比較，H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組CFs存活率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

圖2 CFs表達(dá)波形蛋白的免疫熒光鑒定(100×)

a:P<0.05，與對照組比較。

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與H2O2(10 μmol/L)組比較。

2.4 PCR檢測基因表達(dá)水平

與對照組比較，H2O2(10 μmol/L)組IL-1、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ基因表達(dá)水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2(10 μmol/L)組比較，H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組IL-1、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ基因表達(dá)水平均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

2.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)水平

與對照組比較，H2O2(10 μmol/L)組和H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組NLRP3、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)均升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H2O2(10 μmol/L)組比較，H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組NLRP3、caspase-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

A：對照組；B：H2O2(10 μmol/L)組；C：H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組。a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與H2O2(10 μmol/L)組比較。

A：對照組；B：H2O2(10 μmol/L)組；C：H2O2(10 μmol/L)+RES(5 μmol/L)組。a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05，與H2O2(10 μmol/L)組比較。

3 討 論

目前，有研究表明，心房重構(gòu)、自主神經(jīng)系統(tǒng)改變、鈣離子異常電流共同作用引起房顫，其中心房重構(gòu)在房顫中扮演了重要角色[13]。心房重構(gòu)由心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和心房電重構(gòu)組成，心肌纖維化是結(jié)構(gòu)重構(gòu)的特征性改變，其主要表現(xiàn)為膠原沉積導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)擴(kuò)增，CollagenⅠ/CollagenⅢ比例的改變造成細(xì)胞外基質(zhì)代謝異常，進(jìn)而導(dǎo)致正常心肌纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞，從而影響心肌細(xì)胞之間的傳導(dǎo)連續(xù)性，包括減慢傳導(dǎo)速度、增加傳導(dǎo)異質(zhì)性等，為折返環(huán)的形成和單項傳導(dǎo)阻滯提供了病理基礎(chǔ)[14-15]。心肌纖維化作為房顫最危險的因素之一，探討其發(fā)病機(jī)制對阻斷心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)具有重要意義，可為房顫的預(yù)防和治療提供新的思路。

NLRP3炎癥小體是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，其通過促發(fā)宿主細(xì)胞的炎性反應(yīng)而達(dá)到消滅入侵細(xì)菌的目的[16]。NLRP3被細(xì)胞內(nèi)外相關(guān)信號激活后可通過調(diào)控下游關(guān)鍵效應(yīng)分子(如caspase-1)引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致局部或全身炎性反應(yīng)。有研究在小鼠壓力超負(fù)荷模型中發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體參與了心室重構(gòu)的病理生理過程，NLRP3被抑制時心室重構(gòu)可獲得改善[17]。在瓣膜性房顫患者中心房NLRP3表達(dá)明顯增高，并在心房炎性反應(yīng)和血栓形成中發(fā)揮著重要作用[18]。 本研究結(jié)果顯示，CFs被H2O2刺激后NLRP3、caspase-1、IL-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ均升高，說明CFs在氧化應(yīng)激下可能促進(jìn)了炎性反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)了CFs纖維化。

RES是主要存在于桑葚、葡萄、花生等植物內(nèi)的多酚類化合物，據(jù)文獻(xiàn)報道，其具有廣泛的生物和藥理活性，對各大系統(tǒng)如心血管、呼吸、神經(jīng)等發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗凋亡等作用[19-22]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)H2O2刺激CFs氧化應(yīng)激產(chǎn)生炎性反應(yīng)，加入RES后抑制NLRP3、caspase-1蛋白表達(dá)，并降低CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達(dá)，從而減輕心肌纖維化。

綜上所述，RES可能通過NLRP3/caspase-1信號通路調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平抑制炎性反應(yīng)，進(jìn)而減輕心肌纖維化，為預(yù)防和治療房顫提供了新靶點(diǎn)。