肝癌細(xì)胞來(lái)源的外泌體作用正常肝細(xì)胞后差異表達(dá)環(huán)狀RNA的篩選*

沈彩紅，孫 林，黃文杰，沈永奇，盧永剛，孫一帆△

(廣西醫(yī)科大學(xué)附屬柳鐵中心醫(yī)院：1.感染科；2.檢驗(yàn)科；3.腫瘤科；4.肝膽外科，廣西柳州 545007)

肝癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其在腫瘤中的發(fā)病率位列第4，病死率位列第3[1]。肝癌具有較高的發(fā)病率和病死率，急切需要有效的早期診斷。目前，肝癌早期診斷較為理想的血清標(biāo)志物為甲胎蛋白，但由于其特異度不高，故亟待探索其他有助于肝癌早期有效診斷的生物標(biāo)志物。近年來(lái)，外泌體在腫瘤疾病中的作用已成為研究熱點(diǎn)之一。外泌體中含大量核酸、蛋白、脂質(zhì)等物質(zhì)，參與了細(xì)胞之間或細(xì)胞與組織間的通訊，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。環(huán)狀RNA(circRNA)作為外泌體內(nèi)含物中的一種核酸，隨著RNA測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，大量circRNA被發(fā)現(xiàn)與腫瘤的發(fā)生存在潛在的關(guān)聯(lián)，發(fā)揮了重要的調(diào)控作用，具有巨大潛力，因此，其有可能成為肝癌早期篩查的一種新型生物標(biāo)志物[2]。本研究通過(guò)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞外泌體與正常肝細(xì)胞LO2共同培養(yǎng)后circRNA表達(dá)進(jìn)行比較，篩選驗(yàn)證了具有差異表達(dá)的circRNA，并預(yù)測(cè)分析了其在肝癌發(fā)展的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

外泌體提取試劑盒(美國(guó)Thermo公司)、總RNA提取試劑盒(美國(guó)Qiagen公司)、Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)、Arraystar Super RNA Labeling Kit(美國(guó)Arraystar公司)、Arraystar Human circRNA Arrays V2(美國(guó)Arraystar公司)、SYBRGreen 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑盒(美國(guó)Thermo公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo公司)、AB7500熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司)、低溫冷凍離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)、Agilent Hybridization Oven、Agilent Scanner G2505C、Nanodrop ND-1000等。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR所用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)引物

1.2 方法

1.2.1外泌體提取與鑒定

收集生長(zhǎng)良好的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中，4 ℃、3 000 r/min離心30 min后收集上清液至新的離心管加入外泌體提取試劑，4 ℃過(guò)夜孵育后再4 ℃、3 000 r/min離心60 min，棄上清液，所得沉淀即為外泌體。用無(wú)菌1×磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS)重懸外泌體，儲(chǔ)存于-80 ℃?zhèn)溆?。通過(guò)透射電鏡掃描和納米顆粒跟蹤分析儀對(duì)所提取的外泌體進(jìn)行鑒定。

1.2.2標(biāo)本收集與處理

分為對(duì)照組(正常肝細(xì)胞LO2)和實(shí)驗(yàn)組[正常肝細(xì)胞LO2+HepG2細(xì)胞外泌體(100 μg/mL)]。按照分組對(duì)LO2細(xì)胞進(jìn)行處理，HepG2細(xì)胞外泌體與LO2細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，加上Trizol裂解液，用總RNA提取試劑盒提取總RNA，進(jìn)行circRNA芯片分析。

1.2.3外泌體處理LO2細(xì)胞后差異表達(dá)circRNA篩選

選取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組標(biāo)本各2份總RNA，使用美國(guó)Arraystar公司的8x15K的Arraystar Human circRNA Arrays V2芯片在Agilent Hybridization Oven 儀器上進(jìn)行circRNA雜交檢測(cè)，用Agilent Scanner G2505C儀器進(jìn)行掃描獲取circRNA芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)。利用R software limma package，以P<0.05且差異表達(dá)倍數(shù)(fold change)>2的條件篩選差異表達(dá)的circRNA。在篩選差異表達(dá)circRNA中選擇上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)倍數(shù)排在前5位的circRNA進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.4差異表達(dá)的circRNA生物信息學(xué)分析

通過(guò)生物信息學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)的circRNA進(jìn)行基因本體論(gene ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)信號(hào)通路分析，預(yù)測(cè)差異表達(dá)的circRNA相關(guān)的生物學(xué)功能。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證circRNA的表達(dá)

使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照SYBRGreen PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)篩選得到的上調(diào)和下調(diào)差異表達(dá)前5位的 circRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 外泌體的提取和鑒定

經(jīng)透射電鏡觀察，從HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中提取到的沉淀物其形態(tài)為有圓形或橢圓形脂膜結(jié)構(gòu)的小囊泡，見(jiàn)圖1A；顆粒大小為50～150 nm，見(jiàn)圖1B。成功從HepG2細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提取到外泌體。

2.2 CircRNA芯片原始數(shù)據(jù)均一化

CircRNA芯片原始圖像資料采用Agilent Feature Extraction軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，利用R語(yǔ)言limma軟件包依據(jù)Quantile算法規(guī)則對(duì)circRNA芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化和均一化處理。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化和均一化處理后消除了染色偏差和點(diǎn)樣針頭帶來(lái)空間差異引起基因表達(dá)量的不同，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組標(biāo)本circRNA表達(dá)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化后熒光信號(hào)強(qiáng)度基本一致，可進(jìn)一步進(jìn)行circRNA基因差異表達(dá)分析。

2.3 芯片數(shù)據(jù)差異表達(dá)基因篩選分析

CircRNA基因芯片在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)后共檢測(cè)出10 017個(gè)circRNA，為篩選出正常LO2細(xì)胞和外泌體處理后細(xì)胞中差異表達(dá)的基因，以FC>2且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出235個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中50個(gè)circRNA上調(diào)表達(dá)，185個(gè)circRNA下調(diào)表達(dá)；其中前10位明顯上調(diào)和明顯下調(diào)的circRNA見(jiàn)表2。根據(jù)FC>2且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)繪制火山圖，見(jiàn)圖2。經(jīng)HepG2細(xì)胞外泌體處理LO2細(xì)胞后，circRNA低表達(dá)數(shù)量多于高表達(dá)數(shù)量。

A：外泌體形態(tài)鑒定；B：外泌體顆粒大小檢測(cè)。

兩側(cè)紅點(diǎn)和藍(lán)點(diǎn)：兩組間存在差異表達(dá)的circRNA；右側(cè)藍(lán)點(diǎn)：經(jīng)外泌體處理后LO2細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)的circRNA；左側(cè)紅點(diǎn)：外泌體處理后LO2細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)的circRNA。

2.4 外泌體處理后LO2細(xì)胞相關(guān)circRNA的聚類分析

對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組經(jīng)篩選獲得的circRNA表達(dá)水平進(jìn)行聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖2。差異表達(dá)的circRNA中LO2細(xì)胞經(jīng)外泌體處理后低表達(dá)的circRNA多于高表達(dá)的circRNA，見(jiàn)圖3。與火山圖分析結(jié)果一致。

2.5 在LO2細(xì)胞中驗(yàn)證差異表達(dá)的circRNA

根根前面篩選結(jié)果挑選出其中表達(dá)倍數(shù)差異較大的前5個(gè)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的circRNA，見(jiàn)表2。上調(diào)表達(dá)的hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918和下調(diào)表達(dá)的hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等circRNA在HepG2細(xì)胞外泌體處理后的LO2細(xì)胞表達(dá)與之前分析結(jié)果一致，見(jiàn)圖4。hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918等circRNA確實(shí)在經(jīng)外泌體處理后的LO2細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等circRNA確實(shí)在經(jīng)外泌體處理后的LO2細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與之前生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析結(jié)果一致。

縱軸：基因聚類；橫軸：標(biāo)本聚類；綠色：該基因在經(jīng)外泌體處理后的LO2細(xì)胞中低表達(dá)；紅色：基因在經(jīng)外泌體處理后的LO2細(xì)胞中高表達(dá)；黑色：該基因在二者中無(wú)明顯差異。

表2 正常LO2細(xì)胞經(jīng)HepG2細(xì)胞外泌體處理后表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的circRNA(倍數(shù)改變排列在前10的circRNA)

圖4 正常LO2細(xì)胞經(jīng)HepG2細(xì)胞外泌體處理后差異表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的circRNA聚類分析熱圖

2.6 差異表達(dá)circRNA的GO、KEGG分析結(jié)果

GO富集分析經(jīng)HepG2外泌體處理后LO2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)前5個(gè)的circRNA宿主基因可能參與的生物過(guò)程主要富集在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄調(diào)控，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控，Rac蛋白信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路等；可能參與的細(xì)胞成分主要富集在核仁、細(xì)胞質(zhì)、核質(zhì)、細(xì)胞膜等；可能參與的分子功能主要富集在蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)合、N-乙酰轉(zhuǎn)移酶活性等。KEGG信號(hào)通路分析發(fā)現(xiàn)經(jīng)HepG2外泌體處理后LO2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)前5的circRNA的宿主基因與細(xì)胞周期、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、腫瘤發(fā)生等密切相關(guān)。

3 討 論

外泌體是一種具有雙層脂膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外小泡，由JOHNSTONE等[3]在1989年研究成熟的綿羊網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)發(fā)現(xiàn)報(bào)道。外泌體經(jīng)細(xì)胞“內(nèi)吞-融合-外排”等過(guò)程形成直徑為50～140 nm圓形或橢圓形囊泡，廣泛分布于血漿、腦脊液、乳汁、胸腹腔積液、尿液等物質(zhì)中，甚至存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清液中[4]，其內(nèi)含豐富的核酸[(微小RNA(micro RNA，miRNA)、長(zhǎng)非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、circRNA等]、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)可在細(xì)胞間進(jìn)行信號(hào)傳遞[5]。 外泌體參與了細(xì)胞之間或細(xì)胞與組織之間重要信息和物質(zhì)的交換，在人類細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化、衰老等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。越來(lái)越多的研究表明，外泌體參與了細(xì)胞間通訊和微環(huán)境調(diào)節(jié)，可促進(jìn)病毒擴(kuò)散及炎癥的發(fā)生，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞之間交換致癌因子并維持相鄰基質(zhì)細(xì)胞的腫瘤生長(zhǎng)，在腫瘤轉(zhuǎn)移、發(fā)生中具有重要作用；通過(guò)傳遞非編碼RNA觸發(fā)化學(xué)耐藥性誘導(dǎo)肝臟疾病的惡性轉(zhuǎn)化， 刺激免疫激活及免疫逃逸，可作為生物標(biāo)志物用于腫瘤的預(yù)測(cè)和診治[6-8]。

circRNA是由5′和3′末端首尾環(huán)化形成一個(gè)特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)套索驅(qū)動(dòng)環(huán)化和內(nèi)含子配對(duì)驅(qū)動(dòng)環(huán)化形成的circRNA[9-10]，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定在體內(nèi)不易被核酸酶降解。近年來(lái)，隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的迅速發(fā)展，circRNA廣泛存在于不同生物的細(xì)胞質(zhì)中，具有多樣性、高度穩(wěn)定性、時(shí)空特異性等[11-12]。在胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可與miRNA結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)、發(fā)育[13-15]。此外，在多種惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)，腫瘤分泌的外泌體中存在大量差異表達(dá)的circRNA，研究其影響腫瘤生長(zhǎng)、發(fā)育的生物功能，可作為一種生物標(biāo)志物在腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估等方面具有極大的潛力[16]。

肝癌分泌的外泌體中含豐富的核酸(miRNA、lncRNA、circRNA等)，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用，其生物功能也成為研究熱點(diǎn)之一。肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miRNA-21能使肝星狀細(xì)胞向腫瘤相關(guān)的成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[17]。肝癌高轉(zhuǎn)移的肝癌細(xì)胞分泌的外泌體miRNA-1247-3p可直接作用靶向B4GALT3基因促使肝細(xì)胞癌(HCC)向肺癌轉(zhuǎn)移[18]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β選擇性使lincRNA-ROR在肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中表達(dá)增加，使HCC細(xì)胞對(duì)索拉菲尼敏感性降低，對(duì)其產(chǎn)生耐藥性而降低療效[19]。在肝癌HepG2、97L、LM3等細(xì)胞系分泌的外泌體中發(fā)現(xiàn)，circPTGR1與間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(MET)競(jìng)爭(zhēng)性靶向miRNA449a促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展[20]。肝癌細(xì)胞分泌的外泌體circ-100338可通過(guò)作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成，使肝癌發(fā)生轉(zhuǎn)移[21]。Circ-0061395在肝癌分泌的外泌體中表達(dá)增加，可通過(guò)miR-877-5p/PIK3R3軸影響細(xì)胞增殖、侵襲、遷移等能力促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展[22]。肝癌細(xì)胞分泌的外泌體中circUHRF1表達(dá)增加造成自然殺傷細(xì)胞功能紊亂，circUHRF1可通過(guò)降解miR-449c-5p上調(diào)TIM-3的機(jī)制誘導(dǎo)自然殺傷細(xì)胞的功能障礙，參與免疫抑制導(dǎo)致肝癌預(yù)后較差[23]。因此，肝癌分泌的外泌體中含有大量核酸物質(zhì)在肝癌轉(zhuǎn)移、發(fā)生、發(fā)展及治療中均發(fā)揮了重要的作用，在肝癌的診斷和預(yù)后治療方面具有巨大潛力，外泌體中更多的核酸其生物功能需進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

本研究通過(guò)HepG2細(xì)胞外泌體與正常LO2細(xì)胞共同培養(yǎng)后對(duì)其circRNA表達(dá)譜進(jìn)行了全面測(cè)序，按FC>2且P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選出235個(gè)差異表達(dá)的circRNA，其中50個(gè)circRNA上調(diào)表達(dá)，185個(gè)circRNA下調(diào)表達(dá)。通過(guò)火山圖、聚類熱圖等分析，在HepG2細(xì)胞外泌體與正常LO2細(xì)胞共同培養(yǎng)后篩選出差異表達(dá)明顯上調(diào)或下調(diào)的前5個(gè)circRNA，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918等circRNA經(jīng)外泌體處理后表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等circRNA經(jīng)外泌體處理后表達(dá)水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。通過(guò)GO、KEGG富集分析，經(jīng)HepG2外泌體處理后LO2細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)前5個(gè)的circRNA的宿主基因可能參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、蛋白質(zhì)結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子激活結(jié)合、細(xì)胞周期、MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路等生物過(guò)程。細(xì)胞周期是細(xì)胞分裂和復(fù)制的過(guò)程，與細(xì)胞增殖、分化密切相關(guān)，而細(xì)胞增殖失控正是癌癥發(fā)生、發(fā)展的特征之一[24]。

綜上所述，hsa_circRNA_0010044、hsa_circRNA_009012、hsa_circRNA_101016、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_007918等5個(gè)表達(dá)上調(diào)和hsa_circRNA_002082、hsa_circRNA_103128、hsa_circRNA_092388、hsa_circRNA_007343、hsa_circRNA_071935等5個(gè)表達(dá)下調(diào)的circRNA可能影響肝癌的發(fā)生、發(fā)展，有可能成為潛在的生物標(biāo)志物，為今后研究肝癌的發(fā)生機(jī)制提供了理論依據(jù)。同時(shí)，本研究尚存在一些不足，由于實(shí)驗(yàn)條件和時(shí)間的限制對(duì)差異表達(dá)的circRNA只在細(xì)胞上進(jìn)行了初步的驗(yàn)證其表達(dá)，并未進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。因此，今后仍需增加后續(xù)相關(guān)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，逐步驗(yàn)證其生物功能，進(jìn)一步研究circRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。