青海不同產(chǎn)地寬葉羌活抗菌活性的篩選及活性比較

李美雎，朱瑞娟，陳海娟，尚 軍

(青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810008)

羌活為傘形科羌活屬的寬葉羌活(Notopterygiumfranchetii)或羌活(Notopterygiumincisum)的干燥根莖和根。寬葉羌活藥性溫，微苦、辛，歸膀胱、腎經(jīng)。具有祛風(fēng)、散寒的功效，主治外感風(fēng)寒、頭痛無汗、風(fēng)寒濕痹、項(xiàng)強(qiáng)筋急、肩臂酸痛、癰疽瘡毒等癥。主產(chǎn)于四川、甘肅、青海、西藏、陜西、新疆、云南等地。寬葉羌活喜陰冷濕潤(rùn)氣候，怕強(qiáng)光，生長(zhǎng)于海拔2 000～4 000 m的林緣、灌叢下、溝谷草叢中。寬葉羌活的化學(xué)成分中主要有揮發(fā)油、香豆素及糖類、有機(jī)酸、氨基酸等[1～3]。文獻(xiàn)研究報(bào)道[4]，采用高效液相色譜測(cè)定羌活中羌活醇、異歐前胡素的含量和薄層鑒別色譜法鑒別中藥羌活中紫花前胡苷的方法，能夠有效地控制中藥羌活的質(zhì)量。寬葉羌活的藥理學(xué)研究表明，寬葉羌活有明顯的抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱、抗氧化、抗心律失常、抗血栓形成、抗心肌缺血、促進(jìn)腦循環(huán)等藥理作用[5～8]。文獻(xiàn)研究報(bào)道羌活提取物對(duì)金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用，并篩選出兩個(gè)抗菌活性成分鐮葉芹二醇(falcarindiol)和苯乙基阿魏酸酯(phenethylferulate)[9～13]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)合體外抗菌試驗(yàn)，篩選出羌活抗菌活性部位[14]，且以金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產(chǎn)氣桿菌(Enterobacteraerogenes)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、變形桿菌(Proteusvulgaris)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地寬葉羌活抗菌活性，以此為寬葉羌活抗菌活性藥物開發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與藥材來源 6種寬葉羌活藥材均采挖于青海省不同的地方，分別為互助北山、佑寧寺、果洛瑪可河、幫菜、軍功、湟中。藥材粉碎后過60目篩，密閉保存?zhèn)溆?；陽性藥物青霉素鈉購(gòu)買于中諾藥業(yè)(石家莊)有限公司；試驗(yàn)用培養(yǎng)基購(gòu)買于北京奧波星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 乙醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純，超純水。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)

產(chǎn)氣桿菌(Enterobacteraerogenes)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)

變形桿菌(Proteusvulgaris)

陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)

銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)

糞腸球菌(CoprococcusHoldemanandMoore)

以上7株用于活性部位的篩選和抗菌活性比較的指示菌均購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，于零下20攝氏度冰箱凍存，實(shí)驗(yàn)前3～4 h復(fù)活使用。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平METTLER TOLEDO (XP205 DeltaRange)；

電熱恒溫培養(yǎng)箱；

可調(diào)微量移液器(1 000 μL、200 μL、50μL)；

超聲波清洗器SB-5200TDT(功率300W，頻率40kHZ)；

高壓滅菌鍋、無菌操作臺(tái)、離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 寬葉羌活提取物的制備 取寬葉羌活藥材粉末(過60目篩)50 g，置500 mL圓底燒瓶中，加入400 mL無水乙醇經(jīng)超聲處理(功率300 W，頻率40 kHZ)回流提取2 h，共3次，過濾，合并提取液后濃縮獲得羌活粗提取物浸膏，加超純水打成混懸液，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇(分析純)萃取，濃縮得寬葉羌活各提取物浸膏，將各提取物放于恒溫烘箱或干燥器內(nèi)保存，備用。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定各寬葉羌活提取物，加入1 mL二甲基亞砜超聲溶解，搖勻，精密量取0.2 mL置于10mL容量瓶中，加25%的二甲基亞砜定容至刻度，即得供試品溶液。

1.2.3 陽性對(duì)照藥溶液的制備 于青霉素鈉(80萬單位)瓶中注入4 mL25%的二甲基亞砜，溶解、搖勻，取1 mL溶液置于5 mL容量瓶中，用4 mL25%的二甲基亞砜溶液定容，即得青霉素鈉為5萬單位的對(duì)照品溶液。

1.2.4 菌懸液的配置 將保存的實(shí)驗(yàn)菌種活化后，加入超純水輕輕刮下菌苔并按菌液與超純水1∶9的比率稀釋成104倍，即得菌懸液，備用。

1.2.5 抑菌活性考察

(1)給藥方案及分組

空白組加入240 μL25%二甲基亞砜溶液；陽性藥組加入240 μL5萬單位青霉素鈉；實(shí)驗(yàn)組加入240 μL寬葉羌活不同部位供試品溶液。每組設(shè)3個(gè)平行組，重復(fù)3次。

(2)抑菌活性部位篩選及比較

在超凈工作臺(tái)上于無菌條件下，用牛津杯法(瓊脂孔洞法)考察培養(yǎng)基中羌活不同部位抗菌活性，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄數(shù)據(jù)，考察不同產(chǎn)地羌活抑菌活性。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)以x±s表示(此公式表示數(shù)值偏差平均數(shù)的變動(dòng)范圍，其中x表示平均數(shù)，s表示方差)。

2 結(jié)果

由表1可知，寬葉羌活5個(gè)活性部位對(duì)糞腸球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌效應(yīng)，與空白對(duì)照組相比除了石油醚和水層對(duì)糞腸球菌抗菌效應(yīng)差異不顯著外，其它部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與空白對(duì)照組相比除了正丁醇和水層對(duì)大腸肝菌抗菌效應(yīng)差異不顯著外，其它部位差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且不同部位間的抗菌效應(yīng)強(qiáng)弱不同，其中石油醚對(duì)糞球菌抑菌效應(yīng)差異不顯著；水層部位對(duì)大腸桿菌抑菌效應(yīng)差異不顯著；氯仿部位與其他4個(gè)部位相比，對(duì)兩種菌的抑菌效應(yīng)均較強(qiáng)，故選取氯仿部位作為寬葉羌活抑菌活性部位。

表1 寬葉羌活不同部位的抑菌作用

由表2可知，不同產(chǎn)地寬葉羌活對(duì)受試菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，軍功幫菜、湟中、互助佑寧寺產(chǎn)寬葉羌活與空白組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)；果洛軍功寬葉羌活對(duì)變形桿菌的抑菌效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，互助北山、果洛瑪可河產(chǎn)寬葉羌活對(duì)銅綠假單胞菌的抑菌效應(yīng)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)其它菌的抑菌效應(yīng)均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)。

表2 不同產(chǎn)地寬葉羌活抑菌作用比較

由表3可知，對(duì)陰溝腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是瑪可河產(chǎn)寬葉羌活，與佑寧寺產(chǎn)寬葉羌活差異顯著(P<0.05)，與其他地區(qū)產(chǎn)寬葉羌活氯仿部位相比差異不顯著；對(duì)大腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是佑寧寺產(chǎn)寬葉羌活，與軍功幫菜和果洛軍功產(chǎn)寬葉羌活差異不顯著，與其他地區(qū)產(chǎn)寬葉羌活相比差異均顯著(P<0.01)；對(duì)產(chǎn)氣桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是果洛軍功產(chǎn)寬葉羌活，與其它產(chǎn)地差別不顯著；對(duì)變形桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是瑪可河產(chǎn)寬葉羌活，與互助北山佑寧寺、軍功幫菜產(chǎn)寬葉羌活差異不顯著，與湟中、果洛軍功產(chǎn)寬葉羌活差異顯著(P<0.01)；對(duì)糞腸球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是瑪可河產(chǎn)寬葉羌活，與其它產(chǎn)地差別不顯著；對(duì)銅綠假單胞菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是果洛軍功產(chǎn)寬葉羌活，與互助北山、瑪可河產(chǎn)寬葉羌活相比差異顯著(P<0.05)，與其它地區(qū)產(chǎn)寬葉羌活均無顯著性差異；對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)的是幫菜產(chǎn)寬葉羌活，與湟中、瑪可河、果洛軍功產(chǎn)寬葉羌活差異不顯著，與其他產(chǎn)地寬葉羌活差異顯著(P<0.05或P<0.01)。

表3 不同產(chǎn)地寬葉羌活抑菌作用效應(yīng)比較

3 討論

隨著青霉素和磺胺類藥物在臨床上的廣泛使用，各種感染性疾病得到治療，但是細(xì)菌對(duì)抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的問題也越來越明顯，嚴(yán)重威脅人體健康。中藥發(fā)展幾千年的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)證明有許多中藥都具有抗菌活性、且副作用小、很少產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。有研究報(bào)道，復(fù)方川紫方具有抗菌消炎、通絡(luò)止痛、行氣活血散瘀等功能，由川芎、紫草、羌活等十余味藥組成[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：寬葉羌活不同部位抗菌效應(yīng)氯仿部位是最好的，水層部位效果不明顯，說明寬葉羌活的抗菌效應(yīng)對(duì)活性部位的選擇具有科學(xué)性。其中，瑪可河產(chǎn)寬葉羌活對(duì)陰溝腸桿菌、變形桿菌、糞腸球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)；佑寧寺產(chǎn)寬葉羌活對(duì)大腸桿菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)；果洛軍功產(chǎn)寬葉羌活對(duì)產(chǎn)氣桿菌、銅綠假單胞菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)；幫菜產(chǎn)寬葉羌活對(duì)金黃色葡萄球菌抗菌效應(yīng)最強(qiáng)。且不同產(chǎn)地寬葉羌活對(duì)膽囊炎相關(guān)菌呈現(xiàn)出一個(gè)綜合性效應(yīng)。

寬葉羌活氯仿活性部位具有廣譜抗菌效應(yīng)，可作為寬葉羌活抗菌藥物開發(fā)物質(zhì)基礎(chǔ)，但由于本實(shí)驗(yàn)采用人體給藥最大劑量換算為體外給藥劑量，所以關(guān)于寬葉羌活氯仿活性部位量效關(guān)系還有待于進(jìn)一步研究。